Aislamiento simultáneo de cardiomiocitos de alta calidad, células endoteliales y fibroblastos de un corazón de rata adulto

El objetivo general de este procedimiento es aislar simultáneamente cardiomiocitos viables, células endoteliales y fibroblastos del corazón de rata para sus análisis individuales in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo cardiovascular sobre los mecanismos de señalización involucrados en la hipertrofia cardíaca, la isquemia, la lesión por reperfusión, la función endotelial y la fibrosis cardíaca. La principal ventaja de esta técnica es que todas las células cardíacas principales se pueden aislar simultáneamente, lo que podría reducir los costos de investigación asociados y el número de animales experimentales.

Después de una descarga de agua destilada y un medio Powell de 50 mililitros, reemplace el medio con 80 mililitros de medio Powell fresco y use una pipeta Pasteur de vidrio del cilindro de vidrio para perfundir continuamente el medio con carbógeno. A continuación, utilice dos pares de pinzas curvas finas para montar un corazón de rata recién extraído a través de la aorta en el sistema de perfusión de Langendorff, y coloque el extremo de la cánula del sistema de perfusión entre la primera rama aórtica y la válvula aórtica. Fije la aorta con una pinza de cocodrilo.

Abra la válvula de la cánula y luego fije el corazón con una sutura quirúrgica. Deje que 35 mililitros del medio de perfusión pasen a través del corazón gota izquierda, eliminando cualquier sangre residual. Coloque el embudo colector debajo del corazón y ponga en marcha la bomba peristáltica para recircular el medio de perfusión desde el embudo colector hasta el depósito.

Agregue la solución de colagenasa al medio de perfusión y perfunda el corazón con la solución de colagenasa recirculante durante 30 minutos. Al final de la digestión, use unas tijeras para extraer el corazón del sistema Langendorff y colóquelo en una placa de Petri de vidrio. Ahora retire las aurículas y cualquier resto de tejido graso del corazón.

Para evitar la contaminación de las células epiteliales, use dos pinzas para despegar cuidadosamente el pericardio. Corta el corazón por la mitad y coloca las mitades en la picadora de pañuelos. Picar el corazón dos o tres veces y transferir los trozos de tejido a un tubo cónico de 15 mililitros que contiene 12 mililitros de tampón de digestión de la perfusión de Langendorff.

Digiera los fragmentos de tejido en un baño de agua durante cinco a 10 minutos, mezclando ocasionalmente con una pipeta de plástico desechable de cinco mililitros. A continuación, filtre la suspensión celular a través de un tamiz de 100 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague el sistema de perfusión con un mínimo de un litro de agua destilada seguido de 100 mililitros de hidróxido de sodio normal 0,1 durante 30 minutos, luego enjuague el sistema con otros dos o tres litros de agua destilada y seque el aparato con aire enjuagado.

Recoja las células filtradas por centrifugación y use una pipeta desechable para transferir cuidadosamente la célula endotelial y el sobreblasto que contiene fibroblastos a un nuevo tubo de 50 mililitros. Vuelva a suspender el pellet en seis mililitros de solución de calcio uno. Después de un minuto, recoja las células con una segunda centrifugación y vuelva a suspender el pellet en seis mililitros de solución de calcio dos.

Después de un minuto, diluya la suspensión celular con la adición de 12 mililitros de solución de calcio tres, y mezcle bien inclinando suavemente. Después de otra centrifugación, vuelva a suspender el pellet en 20 mililitros de medio CCT precalentado. A continuación, alícuota de un mililitro de células en cada una de las 20 placas estériles de cultivo celular de 35 milímetros prerrecubiertas con laminina, y coloque las células en una incubadora de cultivo celular libre de dióxido de carbono, sustituyendo el medio por dos mililitros de medio CCT fresco para eliminar las células muertas después de dos horas.

Ahora centrifuga la célula endotelial y el sobrenadante que contiene fibroblastos, y vuelve a suspender el pellet en 1,5 mililitros de tampón de aislamiento de células endoteliales. Transfiera las células a un tubo de muestra de dos mililitros y agregue el anticuerpo CD31 anti-rata de ratón a las células para una incubación de 30 minutos a cuatro grados Celsius con rotación de extremo a extremo. Al final de la incubación, agregue las perlas IGG Pan anti-mouse para una incubación de 20 a cuatro grados centígrados, con rotación de extremo a extremo.

Al final de la incubación de las perlas, coloque las células en una rejilla magnética durante dos minutos y use una pipeta de un mililitro para eliminar cuidadosamente el sobrenadante que contiene principalmente fibroblastos. Vea los fibroblastos en una placa de cultivo de 10 centímetros que contiene 10 mililitros de medio de cultivo de células de fibroblastos y coloque las células en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante una hora. A continuación, agregue un mililitro de tampón de lavado al tubo de células endoteliales y tape el tubo.

Agite suavemente las células de cuatro a cinco veces para volver a suspender las cuentas. A continuación, vuelva a colocar el tubo en el imán y retire el tampón de lavado después de un minuto. Después del último lavado, reemplace el tampón de lavado con un mililitro de medio de cultivo de células endoteliales MV2 y siembre las células endoteliales en un solo pocillo de una placa de 12 pocillos, para su cultivo nocturno en la incubadora de cultivos celulares.

Al final de la incubación de los fibroblastos, lave las células adheridas con un volumen adecuado de PBS precalentado dos o tres veces. Luego, agregue un medio de cultivo de células de fibroblastos frescos precalentado a las células y devuelva los fibroblastos a la incubadora de cultivo celular. A la mañana siguiente, reemplace el sobrenadante en el cultivo de células endoteliales con medio de cultivo de células endoteliales frescas y devuelva las células a la incubadora, reemplazando el medio cada dos o tres días, hasta la semiconfluencia.

A continuación, lave el cultivo de las células de fibroblastos adheridas con PBS fresco precalentado como se acaba de demostrar, y alimente las células con medio fresco precalentado. El procedimiento de aislamiento de cardiomiocitos produce una población de células cardíacas estriadas con una pureza del 70 al 80%. A continuación, se puede realizar un análisis de la oscilación del calcio intracelular de cardiomiocitos aislados cargados con fura AM, en respuesta a la repurfusión por isquemia en los cardiomiocitos, así como el análisis de los cambios en la señalización del calcio en células endoteliales aisladas con perlas magnéticas y fibroblastos, después de la adición de ATP.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar configurar este sistema de perfusión correctamente y fijar rápidamente el corazón en el sistema tan pronto como esté listo. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación cardiovascular exploraran la señalización implicada en diferentes patologías cardiovasculares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de los principios básicos del aislamiento y cultivo de células cardíacas. No olvide que trabajar con instrumentos quirúrgicos y reactivos de cultivo celular puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso cuidadoso de los instrumentos y el uso de guantes al realizar este procedimiento.