Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos de rata adulta

El objetivo general de este experimento es aislar y cultivar cardiomiocitos de ratas adultas, que se pueden utilizar en varios experimentos para comprender su comportamiento biológico y fisiopatológico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología y la fisiopatología del corazón, como la desdiferenciación cardíaca, la hipertensión cardíaca o la insuficiencia cardíaca. La principal ventaja de esta técnica es que los cardiomiocitos adultos pueden ser investigados individualmente sin la influencia de las células adyacentes, como los fibroblastos o las células endoteliales.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la comprensión fisiopatológica de las enfermedades cardíacas, ya que los miocitos cardíacos adultos se pueden investigar individualmente. Aunque este método puede proporcionar información sobre el comportamiento de los cardiomiocitos de ratas adultas, también se puede aplicar a otros modelos, como los modelos de reperfusión por isquemia, las ratas espontáneamente hipertensas u otras especies. El sistema de perfusión de Langendorff consiste en un tubo de vidrio largo de doble pared con un embudo de vidrio en la parte superior e inferior del tubo.

El aparato se puede calentar con agua. Los embudos de vidrio superior e inferior están conectados con una bomba que transporta el medio de perfusión, que se fumiga con un 95% de oxígeno. Para preparar el sistema de perfusión, caliente el medio de recubrimiento y el medio de lavado a 37 grados centígrados.

Luego, descongela un tubo de 500 microlitros de cloruro de calcio y pesa 25 miligramos de colagenasa. A continuación, enjuague el sistema de perfusión de Langendorff con aqua sterile. Después, deje que Powell medium haga circular el sistema durante cinco minutos.

A continuación, prepara un tubo con 40 mililitros de medio Powell y cúbrelo con Parafilm. Caliente el tubo a 37 grados centígrados y gaséelo con un 95% de oxígeno. Retire el medio Powell circulante y llene el sistema de perfusión Langendorff con 80 mililitros de medio Powell fresco sin burbujas de aire, y gasee el medio con un 95% de oxígeno.

A continuación, prepare una rosca de unos 25 centímetros de longitud para sujetar el corazón extraído a la cánula. Desengrase una hoja de afeitar con alcohol y fíjela a la picadora. Finalmente, sujete un disco de plástico en la picadora.

Después de sacrificar a los machos, las ratas Wistar, como se describe en el protocolo de texto, abren el abdomen detrás del arco costal con una cizalla abdominal y, con el mismo par de tijeras, cortan el diafragma para abrir la cavidad torácica. Extraer el corazón junto con el pulmón y el timo cortando por encima del timo muy craneal en la cavidad torácica. Transfiera el material a una solución salina helada inmediatamente.

Extirpe el pulmón y el timo del corazón con una tijera diseccionadora grande. Luego, fijando el material con pinzas de cápsula, transfiera el corazón a una nueva solución salina. Los siguientes pasos deben realizarse de forma precisa, pero también rápida, para minimizar el tiempo entre la extracción del corazón y la fijación al sistema de perfusión de Langendorff.

Esto es esencial para un buen resultado en calidad y número de cardiomiocitos adultos. Retire el exceso de tejido, como los residuos de timo, tráquea, grasa y tejido conectivo del corazón, utilizando pinzas de cápsula y una tijera de disección. Destapa la aorta y córtala con una tijera de disección entre el primer y el segundo arco branquial.

A continuación, inicie el goteo del sistema de perfusión de Langendorff. Coloque el corazón en la cánula del sistema de perfusión de Langendorff y fíjelo primero con una pinza de cocodrilo y luego con el hilo preparado. Enjuague el corazón hasta que esté libre de sangre.

Disuelva 25 miligramos de colagenasa en cinco a seis mililitros de medio Powell tibio y agregue 12,5 microlitros de cloruro de calcio. Cuando el volumen del residuo sea de 45 mililitros, cierre la circulación moviendo un embudo de vidrio, que está conectado con el sistema de perfusión de Langendorff sobre el corazón que gotea, y cubra este embudo con Parafilm para proteger el corazón. Añadir la colagenasa disuelta al sistema de perfusión.

Ajuste el sistema de perfusión durante 25 minutos con una velocidad de caída de una gota por segundo. Después de 25 minutos de perfusión, el corazón aparece hinchado y ceroso. Detenga la perfusión después de 25 minutos y retire el corazón del sistema de perfusión de Langendorff.

Extirpar la aorta, las aurículas y el tejido conectivo del corazón y abrir los ventrículos derecho e izquierdo. Pica el corazón dos veces en un ángulo de 90 grados, repitiendo este proceso manualmente con dos bisturíes durante 10 segundos por cada lado. A continuación, transfiera 12 mililitros del medio de perfusión a un tubo nuevo.

Vierta la suspensión de células en este medio y digiera las células durante otros cinco minutos a 37 grados centígrados. Mezcle la solución cada minuto. Filtre la solución con el corazón digerido a través de una malla de nailon de 200 micras en un tubo nuevo.

La recalcificación es un proceso delicado. Si se utilizan otros modelos de ratas o especies diferentes, el protocolo demostrado puede ser demasiado agresivo, lo que conduciría a una alta tasa de mortalidad de las células. Centrifugar la solución filtrada a 29 g durante tres minutos.

Deseche el sobrenadante y agregue seis mililitros de medio Powell tibio, incluidos 12,5 microlitros de cloruro de calcio al pellet de la celda. Vuelva a suspender el pellet con suaves movimientos de agitación. A continuación, vuelva a centrifugar a 29 g durante dos minutos.

Deseche el sobrenadante y agregue seis mililitros de medio Powell tibio, sustituido por 25 microlitros de cloruro de calcio. Disuelva el pellet celular con suaves movimientos de agitación y agregue 12 mililitros de medio Powell tibio, incluidos 120 microlitros de cloruro de calcio. Después de centrifugar por tercera vez a 16 g durante un minuto, retire el sobrenadante.

A continuación, mezcle el pellet de celda con el medio de recubrimiento precalentado. Retire el medio de presiembra de las placas de cultivo. A continuación, transfiera un mililitro de medio de siembra, incluidos los cardiomiocitos aislados, a cada placa de cultivo.

Incubar los cardiomiocitos frescos aislados a 37 grados centígrados durante una hora. Retire el medio de recubrimiento de las placas de cultivo. Finalmente, agregue un mililitro de medio de lavado a cada placa de cultivo.

Guarde las placas a 37 grados centígrados hasta seis días sin cambiar el medio. Los ARVC recién aislados muestran una morfología típica en forma de bastoncillo. Se puede suponer que los ARVC con una superficie irregular y sin membrana celular intacta detectable no son viables.

Esta morfología cambia durante el período de cultivo en un medio que contiene FCS o Mcostatin M.Los ARVC se redondean y forman estructuras similares a los seudópodos, un proceso también llamado propagación. A través de la tinción fluorescente con Phalloidin TRITC, se puede investigar la alteración del aparato contráctil de ARVC durante el cultivo. Los cardiomiocitos recién aislados muestran una estría cruzada claramente visible.

Durante los primeros días de cultivo, los ARVC perdieron todos sus elementos contráctiles. A esto le siguió una reforma, implicando la sarcomerogénesis de novo con fibras de estrés de actina y haces de actina en la región perinuclear. Esta reforma fue precedida por la formación de estructuras similares a los seudópodos.

Al final del cultivo, se observó una estría cruzada típica de sarcómeros recién ensamblados en la propagación de ARVC. Al final del período de cultivo, el 14,7% más o menos 1,39% de todos los ARVC contados mostraron estructuras similares a los seudópodos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una a una hora y media si se realiza correctamente.

Al intentar el procedimiento, tenga en cuenta que debe trabajar lo más rápido y preciso posible. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y cultivar cardiomiocitos adultos. No olvide que trabajar con material biológico y productos químicos puede ser peligroso.

Después de su desarrollo, este método allanó el camino para que los investigadores en el campo de la cardiología exploraran la fisiología básica de los miocitos cardíacos adultos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la separación de cardiomiocitos del ventrículo izquierdo y derecho u otras especies modelo, para responder preguntas adicionales, como diferencias anatómicas o relacionadas con la especie.