LERLIC-MS / MS para la caracterización en profundidad y cuantificación de glutamina y asparagina desamidación en escopeta Proteómica

Aquí se presenta un protocolo paso a paso de la longitud larga electrostática método (LERLIC-MS / MS) repulsión-hidrófilo interacción cromatografía-espectrometría de masas tándem. Esta es una metodología novedosa que permite por primera cuantificación tiempo y caracterización de los glutamina y asparagina isoformas de desamidación por proteómica escopeta.

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la proteómica de escopeta para caracterizar y cuantificar los productos endógenos de desamidación de glutamina y asparagina en proteomas complejos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en bioquímica, como la influencia de un procesador espontáneo y antimático en el producto isométrico gluteo de la glutamina y la desaminación de la espárraga. La principal ventaja de esta técnica es que los isómeros de desaminación de glutamina se separan en una columna capilar de cambio iónico de larga longitud, maximizando la capacidad de separar los péptidos por los puntos somáticos.

Para comenzar la construcción de la columna, suspenda 50 miligramos de material de empaque de intercambio aniónico débil en 3,5 mililitros de isopropanol al 90%, en agua. Asegure el accesorio de hembra a hembra, un microsalvaje y una tuerca hembra en un extremo de un tubo de pico de 50 centímetros de longitud con un diámetro interior de 200 micrómetros. Coloque una pantalla de 1/16 de pulgada con poros de un micrómetro en el extremo del tubo dentro del microferral.

Usando una bomba de presión configurada a 4, 500 psi, empaque el intercambio aniónico en el capilar hasta que el material sea visible en la parte superior. Fije otro accesorio hembra a hembra, microsalvaje y tuerca hembra a la parte superior del capilar empaquetado en el extremo opuesto para terminar de ensamblar la columna. Lave de 50 a 100 miligramos de pañuelo con solución salina tamponada con fosfato durante cinco minutos.

Repita este lavado dos veces, y luego coloque el pañuelo lavado en tubos con tapas de seguridad. Agregue a cada tubo un peso equivalente de perlas de acero inoxidable y 2,5 equivalentes en volumen de una solución acuosa de 100 milimolares de acetato de amonio con 1% de desoxicolato de sodio. Homogeneizar el tejido a máxima intensidad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, centrifugar el homogeneizado durante diez minutos a 10.000 x g y cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 1,5 mililitros. Continúe homogeneizando y centrifugando el pellet de tejido, combinando los sobrenadantes cada vez hasta que no se observe ningún pellet.

Cuantificar la concentración de proteínas en los sobrenadantes combinados con un ensayo de ácido bicinconínico. A continuación, agregue al homogeneizado una solución molar de ditiotreitol en acetato de amonio de 100 milimolares para alcanzar una concentración de ditiothreitol de diez milimolares en la muestra. Incubar el homogeneizado en un baño de agua a 60 grados centígrados durante treinta minutos.

Añadir al homogeneizado una solución molar de yodoacetamida en acetato de amonio de 100 milimolares para alcanzar una concentración de yodoacetamida de 20 milimolares en la muestra. Incubar el homogeneizado a temperatura ambiente en ausencia de luz durante 45 minutos. A continuación, diluya el homogeneizado con dos volúmenes equivalentes de una solución de diez milimolares de ditiotreitol en acetato de amonio de 100 milimolares.

Incubar el homogeneizado a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Agregue al homogeneizado un volumen suficiente de tripsina modificada de grado de secuenciación en acetato de amonio de 100 milimolares para lograr una proporción de enzimas proteicas de 1 a 50 en peso en la muestra. Incubar la muestra a 30 grados centígrados durante la noche para digerir el homogeneizado.

Apagar la digestión con el 0,5% del peso de la muestra de ácido fórmico, precipitando las sales de desoxicolato de sodio. Agite suavemente las muestras que contienen sales SDC y luego centrifugue las muestras durante diez minutos a 12, 000 x g y cuatro grados Celsius. Decantar el sobrenadante en un nuevo tubo, teniendo cuidado de no alterar la pellets de sales SDC.

Vuelva a disolver las sales en una solución acuosa de hidróxido de amonio al 0,5% en volumen, vórtice vigorosamente. Acondicione un cartucho de sorbente C-18 de un gramo con 5 mililitros de acetonitrilo, seguido de cinco mililitros de ácido trifluoroacético al 0,1% en agua. A continuación, cargue la muestra digerida en el cartucho.

Lave las muestras de tres a cinco veces con porciones de cinco mililitros de 0,1%TFA. A continuación, diluir los péptidos con cinco mililitros de una solución acuosa de 75% de acetonitrilo y 0,1% de ácido fórmico. Seque el fluido en un concentrador de vacío.

Añadir 200 microlitros de acetonitrilo al 75%, con ácido fórmico al 0,1%. Agite la mezcla durante al menos diez minutos y luego sonique la mezcla durante al menos 30 minutos para reconstituir los péptidos secos. Diluya la muestra según sea necesario, de modo que la muestra inyectada contenga de uno a tres microgramos de proteína.

Conecte la columna capilar LAX a un instrumento de cromatografía líquida de ultra alta presión. Prepare soluciones de ácido fórmico al 0,1% en agua y acetonitrilo. Ajuste el caudal a 0,4 microlitros por minuto y configure un recorrido de gradiente de 1.200 minutos.

Configure los eventos de escaneo del espectrómetro de masas para alternar la adquisición de datos, entre la espectrometría de masas por transformada de Fourier completa y la espectrometría de masas en tándem por transformada de Fourier. Realizar LERLIC MS/MS para separar y caracterizar los péptidos. Utilice los datos resultantes y el software proteómico para realizar una búsqueda en la base de datos de proteínas.

Exporte los resultados de búsqueda de la base de datos a un software de hoja de cálculo. Identificar y extraer la lista de péptidos desamidados y los péptidos no desamidados correspondientes. Extraiga los cromatogramas iónicos de cada uno de estos péptidos con cinco partes por millón de tolerancia a la masa.

Inspeccione los cromatagras iónicos extraídos para obtener la ilusión de doble pico separado de los productos isoméricos. Utilizando LERLIC MS/MS, se separaron e identificaron isoformas desamidadas de glutamina y asparagina a partir de una muestra de proteína en dos tiempos de retención diferentes. Se identificaron residuos intermedios de glutamina modificados enzimáticamente de transamidación que mostraban una relación gamma alfa glutamil invertida.

Con este método también se identificó el intermediario de succinimida en los residuos de asparagina. A medida que las condiciones de procesamiento de muestras ligeramente ácidas estabilizan el intermedio de succinimida. Esto sugiere que la técnica LERLIC MS/MS puede aplicarse al estudio de los intermedios de succinimida en todo el proteoma.

Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores en bioquímica caracterizaran la desamidación de proteínas en contextos que van desde la arqueología hasta la investigación biomédica.