LERLIC-MS / MS para la caracterización en profundidad y cuantificación de glutamina y asparagina desamidación en escopeta Proteómica

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la proteómica en tándem para caracterizar y cuantificar productos endógenos de desamidación de glutamina y asparagina en proteomas complejos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en bioquímica, como la influencia de procesadores espontáneos y antimáticos sobre el producto isométrico gluteo de la desamidación de glutamina y asparagina. La principal ventaja de esta técnica es que los isómeros de desamidación de glutamina se separan en una columna capilar de intercambio iónico de longitud prolongada, maximizando la capacidad de separación de péptidos según sus puntos isométricos.

Para comenzar la construcción de la columna, suspenda 50 miligramos de material de empaque de intercambio aniónico débil en 3,5 mililitros de isopropanol al 90% en agua. Fije un conector hembra a hembra, un microferal y una tuerca hembra en un extremo de un tramo de tubo peak de 50 centímetros de longitud y un diámetro interno de 200 micrómetros. Coloque una pantalla de 1/16 de pulgada con poros de un micrómetro en el extremo del tubo dentro del microferal.

Utilizando una bomba de presión ajustada a 4 500 psi, empaque el intercambiador aniónico en el capilar hasta que el material sea visible en la parte superior. Conecte otro accesorio hembra a hembra, microferal y tuerca hembra en la parte superior del capilar empaquetado en el extremo opuesto para terminar de armar la columna. Lave de 50 a 100 miligramos de tejido con solución salina tamponada con fosfato durante cinco minutos.

Repita este lavado dos veces y luego coloque el tejido lavado en tubos con tapas de seguridad. Añada a cada tubo un equivalente en peso de esferas de acero inoxidable y 2,5 equivalentes en volumen de una solución acuosa de acetato de amonio 100 milimolar con 1% de desoxicolanato de sodio. Homogenice el tejido a intensidad máxima durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Luego, centrifugue el homogenato durante diez minutos a 10.000 x g y cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 1,5 mililitros. Continúe homogenizando y centrifugando el pellet de tejido, combinando los sobrenadantes cada vez hasta que no se observe ningún pellet.

Cuantifique la concentración de proteína en los sobrenadantes combinados mediante un ensayo con ácido bicinconínico. A continuación, añada al homogenato una solución unimolar de ditiotreitol en acetato de amonio 100 milimolar para alcanzar una concentración de ditiotreitol de 10 milimolar en la muestra. Incube el homogenato en un baño de agua a 60 grados Celsius durante treinta minutos.

Añada al homogenato una solución unimolar de iodoacetamida en acetato de amonio 100 milimolar para alcanzar una concentración de iodoacetamida de 20 milimolar en la muestra. Incube el homogenato a temperatura ambiente en ausencia de luz durante 45 minutos. Luego, diluya el homogenato con dos volúmenes equivalentes de una solución diez milimolar de dithiotreitol en acetato de amonio 100 milimolar.

Incube el homogenato a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Añada al homogenato un volumen suficiente de tripsina modificada de grado para secuenciación en acetato de amonio 100 milimolar para alcanzar una relación proteína:enzima de 1 a 50 en peso en la muestra. Incube la muestra a 30 grados Celsius durante la noche para digerir el homogenato.

Detenga la digestión con un 0,5 % del peso de la muestra de ácido fórmico, precipitando así las sales de desoxicolanato de sodio. Vortex suavemente las muestras que contienen sales de SDC y luego centrifugue las muestras durante diez minutos a 12.000 × g y cuatro grados Celsius. Decante el sobrenadante en un tubo nuevo, teniendo cuidado de no perturbar el precipitado de sales de SDC.

Reconstituir las sales en una solución acuosa al 0,5% en volumen de hidróxido de amonio, agitando vigorosamente en un vórtex. Acondicionar una cartucha de sorbente C-18 de un gramo con 5 mililitros de acetonitrilo, seguido de cinco mililitros de ácido trifluoroacético al 0,1% en agua. A continuación, cargar la muestra digerida sobre la cartucha.

Lave las muestras de tres a cinco veces con porciones de cinco mililitros de TFA al 0,1%. Luego, diluya los péptidos con cinco mililitros de una solución acuosa de acetonitrilo al 75% y ácido fórmico al 0,1%. Seque el líquido en un concentrador al vacío.

Añada 200 microlitros de acetonitrilo al 75 %, con 0,1 % de ácido fórmico, al residuo. Agite la mezcla en vórtex durante al menos diez minutos y, a continuación, sométala a ultrasonidos durante al menos 30 minutos para reconstituir los péptidos secos. Diluya la muestra según sea necesario, de modo que la muestra inyectada contenga entre uno y tres microgramos de proteína.

Conecte la columna capilar LAX a un instrumento de cromatografía líquida de ultra alta presión. Prepare soluciones de ácido fórmico al 0,1% en agua y acetonitrilo. Establezca un caudal de 0,4 microlitros por minuto y configure un programa de gradiente de 1.200 minutos.

Configure los eventos de escaneo del espectrómetro de masas para alternar la adquisición de datos entre espectrometría de masas por transformada de Fourier completa y espectrometría de masas en tándem por transformada de Fourier. Realice MS/MS con LERLIC para separar y caracterizar los péptidos. Utilice los datos resultantes y software proteómico para realizar una búsqueda en bases de datos de proteínas.

Exporte los resultados de la búsqueda en la base de datos a un software de hojas de cálculo. Identifique y extraiga la lista de péptidos desamidados y los péptidos correspondientes no desamidados. Extraiga los cromatogramas de iones de cada uno de estos péptidos con una tolerancia de masa de cinco partes por millón.

Inspeccione los cromatogramas de iones extraídos para detectar la ilusión de doble pico separado de productos isómeros. Mediante MS/MS con LERLIC, se separaron e identificaron isoformas desamidadas de glutamina y asparagina a partir de una muestra proteica en dos tiempos de retención diferentes. Se identificaron residuos intermedios de glutamina modificados enzimáticamente en la transamidación que mostraban una relación gamma alfa glutamil invertida.

El intermediario de succinimida en residuos de asparagina también se identificó con este método. Dado que las condiciones de procesamiento de la muestra ligeramente ácidas estabilizan el intermediario de succinimida. Esto sugiere que la técnica LERLIC MS/MS puede aplicarse al estudio a nivel proteómico de los intermediarios de succinimida.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en bioquímica caracterizaran la desamidación de proteínas en contextos que van desde la arqueología hasta la investigación biomédica.