Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

El objetivo general de este software de análisis de imágenes es el análisis paralelo de la dinámica de protrusión y la concentración relativa de proteínas a lo largo de toda la longitud filopodial. Este método realmente puede ayudarnos a comprender preguntas clave en la biología celular, especialmente las proteínas individuales involucradas en la extensión y retracción de los filopodios. La principal ventaja de la técnica es que el algoritmo de seguimiento de forma adaptativa proporcionado permite la evaluación cuantitativa de la dinámica de la protrusión y la localización de proteínas resueltas espacialmente.

Para empezar, cultivar neuronas, células HeLa o COS, en medio suplementado como se detalla en el protocolo de texto. Una vez que se alcance el 40% de confluencia, transvecnte las celdas con las construcciones de elección, utilizando un reactivo de transvección según las instrucciones del fabricante. Mantenga las células transvectadas en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 15 a 18 horas.

Después de la incubación, llene las cámaras de cultivo celular hasta el 90% con un medio precalentado a 37 grados centígrados, que contenga 20 milimolares HEPES, para reducir los cambios en el pH y la osmolaridad debidos a la evaporación durante la adquisición de la imagen. Para sellar la tapa, aplique una fina capa de grasa al vacío en el interior de la tapa y presiónela suavemente sobre la cámara de cultivo que contiene las células transvectadas. Posiblemente la parte más importante para el análisis de imágenes es la calidad de la imagen.

Una cosa que tenemos que cuidar es la relación señal/ruido, que tiene que ser más de cuatro y podemos asegurarnos de que, ajustando el tiempo de exposición de la cámara y la intensidad y fuerza del láser que seguiría la velocidad de fotogramas tiene que ser superior a un hercio. Adquiera las imágenes utilizando un microscopio con un objetivo de 60x o 100x y sin flexión de píxeles. Utilice tasas de adquisición no inferiores a un hercio para realizar un seguimiento de la dinámica filopodial.

Para minimizar los artefactos desenfocados, imagen filopodial cerca de la membrana de la albahaca. Para garantizar un seguimiento suave, ajuste el tiempo de exposición de la cámara y la intensidad del láser de modo que la relación señal/ruido sea superior a cuatro. Una vez completado, inicie la adquisición de la imagen.

Después del preprocesamiento de imágenes, como se describe en el protocolo de texto, cargue las imágenes descargando la carpeta comprimida que contiene todos los archivos necesarios para el análisis de imágenes. Descomprima y copie los archivos en la carpeta de trabajo. Una vez instalada, inicie la interfaz gráfica de usuario abriendo el archivo denominado filopodiaAnalysisM3.fig.

Cargue los archivos TIFF de pila guardados para proteínas individuales en la interfaz gráfica de usuario o en la GUI. Usando los botones 1B para la proteína A, 1C para la proteína B y, opcionalmente, 1D para la proteína C.Cree una imagen superpuesta de la célula a partir de los canales de proteína haciendo clic en 1A. A continuación, haga clic en 2A, para asignar el primer fotograma y haga clic en 2B, para asignar el último fotograma para el análisis.

Opcionalmente, recorte la región de interés o el ROI, que contiene el filopodio de interés, utilizando el botón 2H. Gire la imagen con el botón 2I o elimine las regiones no deseadas con la herramienta de dibujo a mano alzada, 2J. Mueva el control deslizante, 2C para cada fotograma para controlar la calidad y comprobar si el filopodio permanece claramente visible durante toda la película.

Para generar el seguimiento, primero, haga clic en el botón 3A en la ventana de la GUI uno, para abrir la ventana de la GUI dos. Haga clic en el botón cuatro en la ventana dos de la GUI para generar la masa del cuerpo de la celda superpuesto que se generó en la ventana 1 de la GUI, después de hacer clic en 1A. Le recomendamos que dedique algún tiempo a optimizar parámetros como el número de segmentos, el ancho de escaneo y el radio de escaneo para su conjunto de datos experimentales.

Mueva el control deslizante en la ventana número dos, para verificar dónde aparece primero la punta filopodial. Luego, haga clic en el botón cinco y aparecerá el cursor. Utilice el cursor para seleccionar la base desde donde se mide la distancia de la punta filopodial.

Seguido de la punta de los filopodios en el fotograma donde aparece por primera vez. A continuación, seleccione la longitud del umbral por encima de la cual se doblarán los filopodios, utilizando 6C. A continuación, especifique el número de segmentos utilizados para aproximar la forma de los filopodios en el cuadro 6A.

Especifique el ancho de escaneo, que actúa como un escáner horizontal, para colocar los nodos en 6B. Especifique el radio de escaneo en el cuadro 6D, use un valor que sea aproximadamente un 50% mayor que el desplazamiento de la punta entre fotogramas observado. A continuación, especifique el ángulo de flexión en la casilla 6E.

Marque el historial de seguimiento de la casilla en la ventana dos de la GUI, para guardar todo el protocolo de seguimiento para referencia futura y luego haga clic en el botón rastrear y analizar para comenzar el seguimiento. Para el análisis espacio-temporal, seleccione la casilla representada por 8B, seguida del canal de proteína de interés. Haga clic en 8A, para iniciar el seguimiento de proteínas a lo largo de la longitud filopodial, utilizando la traza generada previamente.

Para el análisis radiométrico de proteínas, marque la casilla 9B o 9C y haga clic en el botón 9A para obtener el gráfico radiométrico espacio-temporal. Para realizar el análisis filopodio de la punta, marque la casilla 8F y especifique la longitud de la punta y la longitud del umbral desde la base, utilizando 8G y 8H. Haga clic en el botón pulsador para guardar los datos en un archivo de Excel llamado dynamics.xlsx.

A continuación, haga clic en analizar intensidades de proteínas para generar la traza de intensidades de proteínas de la punta filopodial y guardarla para el análisis radiométrico. Haga clic en la relación deseada a analizar, utilizando 9D o 9E. Por último, haga clic en el botón de comparación, 9A para generar los datos radiométricos.

El análisis de las células COS transvectadas con un marcador de actina filamentosa en rojo y una referencia citosólica en verde revelan protuberancias filopodiales ricas en actina. Una serie temporal muestra que las protuberancias filopodiales ricas en actina se extienden y retraen rápidamente. Utilizando el software de análisis de imágenes, se trazaron los filopodios individuales.

El software de análisis de imágenes rastrea de manera confiable la extensión filopodial, además de las tasas de crecimiento y retracción de un filopodio individual, los quimigrafías también muestran la concentración de actina normalizada a la referencia citosólica. Si se utiliza correctamente, esta técnica permite el análisis cuantitativo de la dinámica de la protrusión y la concentración de proteínas resueltas espacialmente a lo largo de los filopodios. Al intentar el procedimiento, es importante recordar la velocidad de adquisición y mantener la relación señal/ruido superior a cuatro, sin saturar las imágenes individuales.