Name: Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprende a rastrear lisosomas en 3D dentro de células vivas mediante microscopía de dos fotones con seguimiento orbital. Este método de alta velocidad permite observar interacciones entre orgánulos y estudiar dinámica celular.

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Este proyecto fue apoyado por las subvenciones NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 y P50-GM076516

1. Preparación de muestras <ol><li> Mantener células CHOK1 en matraces de cultivo de tejido utilizando DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y 100 UI / ml de penicilina 50 g / ml de estreptomicina. Se incuban las células en una incubadora humidificado 5% de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Cosecha y luego placa células CHOK1 sobre un diámetro micro-bien 14 mm con un espesor de 0,16 mm superficie. Se siembran las células de la densidad óptima para la imagen, en torno al 60-70% de confluencia. </li><li> Se incuban las células durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2. Lavar las células tres veces en HBSS (Hank Buffered Saline Solution), e incubar las células en una solución que contiene 50 nM de DND26 Lysotracker verde y 150 nM de verde rastreador de la tubulina. Se incuban las células durante 1 hora a 37 ° C. Paso opcional: Antes de la incubación, realizar una tinción adicional con un colorante de tinción de la matriz mitocondrial (25 nM). </li><li> Lavar las células tres veces en HBSS para eliminar cualquier colorante no unido. Añadir medio de cultivo DMEM fresco antes de la imagción de las células. </li></ol> 2. Microscopio Configuraciones El microscopio para el rastreo de partículas se describe en el protocolo de vídeo está montado en el bastidor de un microscopio invertido comercialmente disponible (Figura 4). Sin embargo módulos comerciales para el rastreo de partículas orbital 3D ya están disponibles. <ol><li> Use un II coherente Camaleón-Ultra Ti: Sa femtosegundo fuente de luz de excitación láser, con una longitud de onda sintonizable rango de salida entre 690 nm-1040 nm. </li><li> Asegúrese de que el rayo láser está alineado en el puerto trasero del microscopio utilizando espejos IR-revestido. El rayo láser se atenúa usando una placa de media onda giratoria seguido por un polarizador lineal calcita. Atenuar el haz de manera que la potencia media en la muestra es entre 0.5 y 2 mW. NOTA: El rayo láser se refleja por un par de espejos accionados por motor galvanómetro que permiten el control de la posición y trayectoria del haz enfocado en el plano de la muestra. En unaconfiguración típica del haz de láser colimado que sale de los espejos de galvanómetro se expande (10X) que pasa a través de un expansor de haz, antes de entrar en la parte trasera del objetivo del microscopio después de la reflexión en espejo dicroico pase corto. </li><li> Recoger la luz de fluorescencia de la muestra mediante la colocación de un objetivo de alta abertura numérica agua (60X, NA 1.2) en la trayectoria de la luz. Elegir un cubo de filtro de fluorescencia de acuerdo con las longitudes de onda de emisión deseados en uno o dos de configuración de canal. Emplear filtros de paso de banda de emisión para seleccionar aún más la gama espectral de la fluorescencia emitida. </li><li> Colocar la muestra en una platina motorizada, y ajustar la multa movimiento del objetivo del microscopio utilizando un piezo-controlador objetivo. </li><li> Dirija la luz del cubo de filtro en tubos fotomultiplicadores donde se discrimina la señal y la envía a un I / O tarjeta de adquisición de datos digital. NOTA: El ordenador genera formas de onda son la salida analógica de la tarjeta de E / S y son Provided a los escáneres de control de la electrónica. La entrada de conteo de fotones de los fotomultiplicadores y la señal de salida a los escáneres se mide y se controla a través de la tarjeta de E / S por el Laboratorio de software de fluorescencia Dynamics SimFCS. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Coloque las células en el escenario y enfocar con iluminación de luz transmitida. </li><li> Cambiar a formación de imágenes de exploración de trama para identificar las células que han incorporado el colorante y para visualizar los microtúbulos subyacentes. Identificar la zona inicial donde el movimiento de la vesícula está presente. </li><li> Una vez que una vesícula aislado se identificó, establecer los siguientes parámetros para el seguimiento orbital: <ol><li> Seleccione el radio de la órbita para definir el tamaño de la exploración circular de acuerdo con el tamaño de la partícula siendo rastreado. Para un emisor de punto, establecer el radio de la órbita igual a la cintura de la función de dispersión del punto (PSF) de la viga de excitación para maximizar la sensibilidad y la respuesta. </li><li> Ajuste el axialdistanciarse para definir la distancia entre las dos órbitas que se realizan para localizar la posición de la partícula a lo largo de la dirección axial. Establezca la distancia axial a 1,5-3 veces la cintura PSF. </li><li> Definir el tiempo de permanencia en función del brillo de la partícula para establecer el tiempo dedicado a cada punto de la órbita, que también determinará el tipo de foto-blanqueo. Utilice un tiempo de espera entre 10 a 100 microsegundos. </li><li> Establecer el número de puntos en cada órbita a 64 o 128 para producir períodos orbitales en el orden de 4-32 ms y proporcionar una alta resolución temporal para determinar la posición de la partícula. </li></ol></li><li> Cambie la señal DC compensar envía a los espejos con el fin de centrar el haz sobre la partícula a través de la interfaz gráfica de usuario a través de una selección cursor en la imagen raster-escaneada. </li><li> Comience seguimiento al cambiar el modo de microscopio de raster de imágenes para la exploración orbital. </li><li> Active la recogida de opiniones y datos. </li></ol> 4. TrajectAnálisis ory <ol><li> Utilice el software para visualizar la fluorescencia recogida en cada punto a lo largo de la órbita y en cada punto en la forma de una &quot;alfombra intensidad&quot; tiempo. La intensidad de recogida a lo largo de la alfombra proporciona información sobre la interacción de la partícula con otros objetos brillantes. Utilice el software para visualizar tanto la información de trayectoria (es decir, el desplazamiento de CC en el tiempo de la x, y y los escáneres de la -piezo z), así como la intensidad de fluorescencia obtenida de la tubo fotomultiplicador con el tiempo en forma de series de tiempo. </li><li> Utilice la representación de series de tiempo y la información &#39;alfombra intensidad &quot;para seleccionar sólo una región de interés en la trayectoria. </li><li> Utilice el software para mostrar una proyección 2D de la parte seleccionada de la trayectoria de la partícula. Seleccione los controles apropiados para el código de color de acuerdo a la trayectoria de la intensidad de fluorescencia de las partículas. </li><li> Seleccione la opción para mostrar la partículo trayectoria en 3D, y código de color de acuerdo a la intensidad de fluorescencia. Girar la trayectoria en 3D utilizando los controles para visualizar las características del movimiento lisosoma a lo largo de los microtúbulos. </li></ol>

<ol><li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li>
<li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li>
<li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li>
<li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li>
<li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li>
<li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li>
<li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Multiphoton+Microscopy+in+the+Biomedical+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li>
<li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li>
<li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li>
<li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A pesar de los enormes progresos de las técnicas de microscopía de fluorescencia y instrumentaciones de los últimos años, logrando trayectorias de las partículas fluorescentes en tres dimensiones con una alta resolución temporal se ha mantenido un reto en el campo. Si de alta resolución temporal se ha logrado partículas de rastreo en dos dimensiones, la extensión a la dirección axial típicamente trae una drástica reducción en la respuesta de frecuencia del sistema 10. En este vide...

Un gran número de enfoques han sido desarrollados hasta la fecha para realizar un seguimiento de partículas fluorescentes en tres dimensiones usando un microscopio. La mayoría de los enfoques se basan en el uso de cámaras rápidas, ideal para realizar un seguimiento en dos dimensiones, por lo general combinados con modificaciones personalizadas de la óptica de emisión del microscopio para lograr el seguimiento en la dirección axial. Microscopios de barrido láser confocal (ya sea o dos fotones) convencionalmente puede rastrear una partícula fluorescente mediante la realización de una secuencia temporal de z-pilas, aunque este proceso es típicamente mucho tiempo, y produce resolución de tiempo razonable (10 Hz) sólo si la partícula está realizando un seguimiento es mantenido en el centro de una pequeña región de formación de imágenes de trama por un mecanismo de retroalimentación activo 2. La idea de quedarse atrapado en la partícula es la base del método de seguimiento orbital. En lugar de una trama escanear una órbita circular que se realiza alrededor de la partícula fluorescente. La intensidad de la fluorescencia a lo largola órbita localiza con precisión la posición de la partícula 4. La posición localizada de la partícula puede entonces ser utilizada para accionar los escáneres de microscopio y re-centro de la órbita en la posición de la partícula. Los escáneres galvanómetro del microscopio son impulsados ​​por una tensión analógica. El componente de AC de este voltaje permite realizar una órbita con el haz de láser enfocado, es decir, un seno y una onda de coseno aplicado a los espejos de exploración X e Y permitirá la realización de una órbita circular. El desplazamiento de la señal de DC facilita el cambio de la posición del centro de la órbita. Una vez que un período de órbita y se determina la forma de onda para la señal de CA está configurado, el sistema de retroalimentación necesita actualizar sólo el componente DC de la señal. Un software capaz de leer la señal fluorescente obtenida de los detectores se requiere para el control de los escáneres y los detectores, para calcular la posición de la partícula y actualizar el DC fueraestablecer. Para una evaluación exitosa imágenes de una cuidadosa selección de los parámetros de órbita (tamaño y calendario) que se requiere y estos parámetros tienen que ser ajustado en base a las características de las partículas fluorescentes que es necesario realizar un seguimiento. Los fundamentos físicos y matemáticos de la técnica se han descrito en el pasado de 4,5 tanto para aplicaciones 2D y 3D. En este protocolo se describen brevemente los principales componentes de hardware de la configuración, y con más detalle la elección de los parámetros y de la preparación de la muestra necesario para un experimento típico permitiéndonos tras el desplazamiento de un lisosoma en una alta resolución temporal dentro de una célula viva.

<table><tbody><tr><td>Lysotracker DND 26</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td></td></tr><tr><td>Tubuline tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>T34075</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker RED</td><td>Life Technologies</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Chamelón Coherente- ultra II TI</td><td>Glan Coherente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taylor Polarizador de Calcita Melles</td><td>Griot</td><td>03PTA001</td><td></td></tr><tr><td>Espejo galvanómetro-motor</td><td>Cambridge</td><td>Technologies M 6350</td><td></td></tr><tr><td>Espejo dicroico</td><td>Chroma Technologies</td><td>700 DCSPXR</td><td></td></tr><tr><td>Platina motorizada</td><td>ASI</td><td>MS2000</td><td></td></tr><tr><td>Piezo&nbsp;</td><td>PI</td><td>P721-LLQ</td><td></td></tr><tr><td>Tubo fotomultiplicador</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>Tarjeta de adquisición de datos</td><td>IO tech</td><td>PCI 1128-4000</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagen</td><td>LFD</td><td>Global para imágenes-SimFCS</td><td></td></tr></tbody></table>

rastreo orbital 3d en un microscopio de dos fotones modificado: una aplicación para el seguimiento de vesículas intracelulares

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

El objetivo de este protocolo de vídeo es discutir cómo realizar y analizar un tridimensional fluorescente orbital experimento de rastreo de partículas usando un microscopio de dos fotones modificado 1. A diferencia de los enfoques convencionales de exploración de trama (o campo amplio basado en una pila de marcos), el seguimiento orbital 3D permite localizar y seguir con una alta resolución espacial (10 exactitud nm) y la resolución temporal (respuesta de frecuencia 50 Hz) el desplazamiento de 3D una partícula fluorescente pasar longitud escalas de cientos de micras 2. El método se basa en un algoritmo de realimentación que controla el hardware de una de dos fotones microscopio de barrido láser con el fin de realizar una órbita circular alrededor del objeto a ser rastreados: el mecanismo de retroalimentación mantendrá el objeto fluorescente en el centro mediante el control del desplazamiento de el haz de exploración 3-5. Para demostrar las ventajas de esta técnica, hemos seguido un orgánulo de movimiento rápido, el lisosoma, dentro de alcelular iving 6,7. Las células se cultivaron de acuerdo a protocolos estándar, y se tiñeron usando un colorante comercialmente lisosoma. Se discute brevemente la configuración de hardware y con más detalle el software de control, para llevar a cabo un experimento de seguimiento orbital 3D dentro de las células vivas. Se discuten en detalle los parámetros requeridos con el fin de controlar el microscopio de exploración y permitir el movimiento de la viga en una órbita cerrada alrededor de la partícula. Concluimos demostrando cómo este método puede ser usado efectivamente para seguir el movimiento rápido de un lisosoma marcado a lo largo de los microtúbulos en 3D dentro de una célula viva. Los lisosomas pueden moverse con velocidades en el intervalo de 0,4-0,5 m / seg, típicamente presentan un movimiento dirigido a lo largo de la red de microtúbulos 8.

De acuerdo con este protocolo de seguimiento de una sola partícula 3D rápido puede llevar a cabo dentro de las células vivas con un microscopio de dos fotones modificado para seguir el desplazamiento de los lisosomas marcados con fluorescencia. El experimento llevado a cabo consiste en el seguimiento de un lisosoma aislado en movimiento dentro de la célula después del proceso de maduración endosoma 9. Los lisosomas se tiñeron utilizando un tinte verde fluorescente y se excita a 930 nm de excitación que explot...

En este protocolo de video rastreamos, a alta velocidad y en tres dimensiones, lisosomas marcados con fluorescencia dentro de células vivas, utilizando el método de seguimiento orbital en un microscopio modificado de dos fotones.

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

El objetivo general de este procedimiento es ilustrar cómo rastrear orgánulos que se mueven rápidamente, como los lisosomas, que se mueven en 3D dentro de una célula viva. Esto se logra tiñendo primero los lisosomas y los microtúbulos utilizando colorantes comerciales específicos dentro de células vivas cultivadas. El segundo paso es utilizar un microscopio de escaneo láser y emplear el método de seguimiento orbital para seguir el movimiento del lisosoma a alta velocidad, el tamaño de la órbita y otros parámetros, como la respuesta de frecuencia del sistema, se seleccionan para realizar experimentos de seguimiento.En última instancia, los resultados muestran que es posible seguir lisosomas que se mueven rápidamente en tres dimensiones y detectar interacciones con otros orgánulos teñidos con fluorescencia que se encuentran a lo largo de la órbita láser durante el seguimiento. Las principales ventajas del método de seguimiento 3D sobre otros métodos existentes, que se basan, por ejemplo, en los astigmatarios, es que el método de seguimiento 3D nos permite rastrear un rango muy amplio de la demencia. Este método puede ayudar a hacer una pregunta clave en el campo del transporte vesicular, como por ejemplo cómo se mueven las vesículas a lo largo de los microtubos.Aunque este método se puede utilizar para estudiar la dinámica endosomal. También se puede emplear en otros sistemas donde es posible marcar fluorescentemente partículas aisladas como nanopartículas go, receptores de membrana, complejos de puertos nucleares agregados o loci genéticos: células de ovario de hámster chino mantenidas o células CH K uno, como se describe en el protocolo de texto. Después de cosechar las celdas, colóquelas en un diámetro de 14 milímetros.Micro pocillo con un espesor de superficie de 0,16 milímetros células semilla para una densidad óptima para obtener imágenes de alrededor del 60 al 70%Co fluidez incubar células durante la noche a 37 grados Celsius 5%CO2 al día siguiente, lavar las células tres veces en la solución salina tamponada de Hank o H-B-S-S-H-B-S-S para eliminar las células muertas o los residuos de la placa de cultivo y para preparar las células para el paso de tinción. A continuación, incubar las células en una solución de HBSS que contenga una concentración final de 50 ano molar lyo tracker y 150 ano molar de tubulin tracker green durante una hora a 37 grados centígrados después de la incubación. Lave las celdas tres veces en HBSS para eliminar cualquier tinte suelto.Agregue medio de crecimiento DMEM fresco antes de obtener imágenes de las células. El microscopio para el seguimiento de partículas descrito en el protocolo de vídeo se monta en el marco de un microscopio invertido disponible en el mercado. Se utiliza una fuente de luz de excitación láser de femtosegundo de zafiro de titanio camaleónico ultra dos coherente con un rango de longitud de onda de salida sintonizable entre 690 nanómetros y 1040 nanómetros.Asegúrese de que el rayo láser esté alineado en el puerto trasero del microscopio. Usando espejos recubiertos de infrarrojos, el rayo láser se atenúa usando una placa giratoria de media onda colocada frente a un polarizador de calcita, atenúa el haz para que la potencia promedio en la muestra esté entre 0,5 y dos milivatios. Recoja la luz de fluorescencia de la muestra colocando un objetivo de agua de alta apertura numérica en la trayectoria de la luz.A continuación, coloque la muestra en una platina motorizada y ajuste el movimiento fino del objetivo del microscopio. Usando un controlador de pizo objetivo. Elija un cubo de filtro de fluorescencia de acuerdo con las longitudes de onda de emisión deseadas en una configuración de uno o dos canales.Emplear filtros pasados por banda de emisión. Para seleccionar aún más el rango espectral de la fluorescencia emitida, dirija la luz del cubo de filtro a tubos fotomultiplicadores donde la señal se amplifica y discrimina y se envía a una tarjeta de adquisición de datos de salida de entrada digital para obtener imágenes de las células, colocarlas en la plataforma y enfocarlas utilizando iluminación de luz transmitida. Cambie a imágenes de escaneo de trama para identificar las células que han incorporado el tinte y, para visualizar los microtúbulos subyacentes, identifique el área inicial donde está presente el movimiento de las vesículas.Una vez identificada una vesícula aislada, establezca los parámetros para el seguimiento orbital. Primero, seleccione el radio de la órbita para definir el tamaño del escaneo circular de acuerdo con el tamaño de la partícula que se está rastreando. Para un emisor puntual, establezca el radio de la órbita igual a la cintura de la función de dispersión de puntos o PSF del haz de excitación.Para maximizar la sensibilidad y la respuesta. Establezca la distancia axial para definir la distancia entre las dos órbitas que se realizan para localizar la posición de la partícula a lo largo de la dirección axial. Ajuste la distancia axial de 1,5 a tres veces el desperdicio de PSF.Defina el tiempo de permanencia de acuerdo con el brillo de la partícula, para establecer el tiempo dedicado en cada punto de la órbita, lo que también determinará la tasa de fotoblanqueo. Utilice un tiempo de permanencia entre 10 y 100 microsegundos. Establezca el número de puntos en cada órbita en 64 o 128 para producir períodos de órbita del orden de cuatro a 32 milisegundos, y proporcione una alta resolución temporal para determinar la posición de la partícula.Cambie la señal de compensación de CC enviada a los espejos para centrar el haz en la partícula a través de la interfaz gráfica de usuario a través de una selección de cursor en la imagen escaneada de trama. Comience el seguimiento cambiando el modo de microscopio de imágenes rasterizadas a escaneo orbital. Activar la retroalimentación y la recopilación de datos para el análisis de trayectorias.Utilice el software para mostrar la fluorescencia recogida en cada punto a lo largo de la órbita y en cada punto de tiempo en forma de alfombra de intensidad. La intensidad recogida a lo largo de la alfombra proporciona información sobre la interacción de la partícula con otros objetos brillantes. Muestra tanto la información de la trayectoria como la intensidad de fluorescencia recogida del tubo fotomultiplicador a lo largo del tiempo en forma de series temporales.Utilice la representación de series temporales y la información de la alfombra de intensidad para seleccionar solo una región de interés en la trayectoria. A continuación, visualice una proyección 2D de la parte seleccionada de la trayectoria de la partícula. Seleccione los controles apropiados para codificar por colores la trayectoria de acuerdo con la intensidad de fluorescencia de la partícula.Seleccione la opción para mostrar la trayectoria de la partícula en 3D y codificarla por colores según la intensidad de fluorescencia. Gire la trayectoria en 3D usando los controles para visualizar las características del movimiento del lisosoma a lo largo del microtúbulo. Utilizando una tinción de tinción de colorante verde fluorescente de los lisosomas y de los microtúbulos, es posible obtener imágenes del movimiento a alta velocidad de las vesículas a lo largo de los microtúbulos con un microscopio de barrido láser de dos fotones.Sin embargo, las imágenes de escaneo de trama no tienen la resolución temporal necesaria para seguir con precisión el movimiento de los endosomas más rápidos si se utiliza el seguimiento orbital. En cambio, los datos muestran que es posible obtener trayectorias de desplazamiento x, y, Z con una resolución temporal de 32 milisegundos. En estas trayectorias de desplazamiento en función del tiempo, el análisis de la alfombra muestra la intensidad registrada a lo largo de cada órbita.Con el tiempo, la trayectoria de intensidad proporciona información sobre el entorno fluorescente de la partícula. La región encajonada corresponde a la parte de la trayectoria entre dos saltos. Los puntos brillantes fuera de la región encajonada corresponden a las interacciones de la partícula con otros objetos brillantes y están asociados a saltos en la trayectoria a medida que las órbitas se vuelven a centrar en la fuente fluorescente más brillante.Durante el seguimiento, se puede registrar la intensidad integrada de la fluorescencia emitida. La trayectoria 3D reconstruida muestra un movimiento dirigido, como se puede esperar de una vesícula que se mueve en la red de microtúbulos. Además, es posible correlacionar la trayectoria 3D con un RA o una imagen de escaneo de la región circundante.Esto confirma el movimiento de la partícula a lo largo de la dirección de un haz de microtúbulos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en pocas horas si se realiza correctamente mientras se intenta. Es importante recordar este procedimiento para usar un nivel de potencia láser que no sea dañino para su muestra mientras se usa la citación fotónica como se ilustra en este protocolo, se deben mantener niveles de potencia de aproximadamente dos milivoltios después de los objetivos.Después de ver este video, debería tener una muy buena comprensión de cómo configurar un experimento utilizando el método de seguimiento orbital 3D, que permite rastrear objetos de un rango Z muy grande.

3d-orbital-tracking-modified-two-photon-microscope-an-application-to

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este video demuestra cómo las vesículas neuronales se marcan con proteínas fluorescentes específicas para visualizar su movimiento. Primero, un plásmido que codifica para una proteína fluorescente se incuba con un agente de transfección y luego se introduce en un cultivo de neuronas. Posteriormente, se adquieren imágenes de las neuronas y se analizan para rastrear el movimiento de las vesículas.

Visualización de las motilidades de las vesículas en las neuronas mediante imágenes de fluorescencia

Cuatro dimensiones (4D) de formación de imágenes se utiliza para estudiar el comportamiento y las interacciones entre los dos tipos de endosomas en los terminales nerviosos de vertebrados vivían. Movimiento de estas pequeñas estructuras se caracteriza en tres dimensiones, permitiendo la confirmación de eventos tales como la fusión endosoma y la exocitosis.

Visualización de la Dinámica en Endosoma Vivir terminaciones nerviosas con imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones

La investigación del tráfico de membranas es crucial para entender las funciones neuronales. Aquí, se introduce un método para la cuantificación de la motilidad vesicular en las neuronas. Este es un método conveniente que puede adaptarse a la cuantificación del tráfico de membranas en el sistema nervioso.

Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes

Datos de este protocolo la construcción y operación de un microscopio de seguimiento en tiempo real 3D sola partícula capaz de seguimiento nanoescala fluorescente puntas de prueba a altas velocidades difusivos y tasas de conteo de fotones baja.

Un protocolo para el seguimiento en tiempo real 3D sola partícula

Aquí ilustramos cómo sola molécula de microscopía de localización foto-activado puede llevarse a cabo en la terminal del nervio motor de un vivo Drosophila melanogaster tercer instar de la larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

Este protocolo describe el análisis de compartimentos intracelulares etiquetados fluorescentemente en levaduras en ciernes utilizando microscopía confocal 4D (time-lapse 3D) multicolor. Los parámetros de imagen se eligen para capturar señales adecuadas mientras se limitan los fotodaños. Los plugins Personalizados ImageJ permiten rastrear y analizar cuantitativamente las estructuras etiquetadas.

Microscopía 4D de levadura

La microscopía de localización de una sola molécula 3D se utiliza para sondear las posiciones espaciales y las trayectorias de movimiento de las proteínas etiquetadas fluorescentes mente en células bacterianas vivas. El protocolo experimental y de análisis de datos descrito en este documento determina los comportamientos difusivos prevalentes de las proteínas citosólicas basadas en trayectorias agrupadas de una sola molécula.

Microscopía de seguimiento de una sola molécula - Una herramienta para determinar los estados difusos de las moléculas citosólicas

El análisis de desplazamiento cuadrático medio (iMSD) derivado de imágenes se aplica a los macropinosomas para resaltar su naturaleza intrínseca de evolución en el tiempo en términos de propiedades estructurales y dinámicas. Los macropinosomas se comparan con los gránulos secretores de insulina (ISG) como referencia para las estructuras subcelulares con propiedades estructurales / dinámicas promedio invariantes en el tiempo.

Sondeo de las propiedades estructurales y dinámicas del tráfico de nanoestructuras subcelulares mediante espectroscopia de fluctuación espaciotemporal

En el embrión temprano de Drosophila , muchos orgánulos son móviles. En principio, se pueden obtener imágenes en vivo a través de sondas fluorescentes específicas, pero la cáscara del huevo impide la aplicación directa al embrión. Este protocolo describe cómo introducir tales sondas a través de la microinyección, y luego analizar el movimiento de orgánulos a granel a través de la velocimetría de imagen de partículas.

Visualización del tráfico dependiente de citoesqueletos de orgánulos que contienen lípidos en embriones de Drosophila

Este artículo ofrece una descripción detallada de cómo crear muestras para el seguimiento de una sola proteína en bicapas lipídicas soportadas por sólidos. También explica un microscopio de fluorescencia sencillo con sensibilidad a una sola molécula y una tasa de fotogramas rápida. Finalmente, describimos el procedimiento para extraer trayectorias de una sola proteína.

Seguimiento de proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia

Aprende a rastrear lisosomas en 3D dentro de células vivas mediante microscopía de dos fotones con seguimiento orbital. Este método de alta velocidad permite observar interacciones entre orgánulos y estudiar dinámica celular.

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

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