Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

El objetivo general de este procedimiento es ilustrar cómo rastrear orgánulos que se mueven rápidamente, como los lisosomas, que se mueven en 3D dentro de una célula viva. Esto se logra tiñendo primero los lisosomas y los microtúbulos utilizando colorantes comerciales específicos dentro de células vivas cultivadas. El segundo paso es utilizar un microscopio de escaneo láser y emplear el método de seguimiento orbital para seguir el movimiento del lisosoma a alta velocidad, el tamaño de la órbita y otros parámetros, como la respuesta de frecuencia del sistema, se seleccionan para realizar experimentos de seguimiento.

En última instancia, los resultados muestran que es posible seguir lisosomas que se mueven rápidamente en tres dimensiones y detectar interacciones con otros orgánulos teñidos con fluorescencia que se encuentran a lo largo de la órbita láser durante el seguimiento. Las principales ventajas del método de seguimiento 3D sobre otros métodos existentes, que se basan, por ejemplo, en los astigmatarios, es que el método de seguimiento 3D nos permite rastrear un rango muy amplio de la demencia. Este método puede ayudar a hacer una pregunta clave en el campo del transporte vesicular, como por ejemplo cómo se mueven las vesículas a lo largo de los microtubos.

Aunque este método se puede utilizar para estudiar la dinámica endosomal. También se puede emplear en otros sistemas donde es posible marcar fluorescentemente partículas aisladas como nanopartículas go, receptores de membrana, complejos de puertos nucleares agregados o loci genéticos: células de ovario de hámster chino mantenidas o células CH K uno, como se describe en el protocolo de texto. Después de cosechar las celdas, colóquelas en un diámetro de 14 milímetros.

Micro pocillo con un espesor de superficie de 0,16 milímetros células semilla para una densidad óptima para obtener imágenes de alrededor del 60 al 70%Co fluidez incubar células durante la noche a 37 grados Celsius 5%CO2 al día siguiente, lavar las células tres veces en la solución salina tamponada de Hank o H-B-S-S-H-B-S-S para eliminar las células muertas o los residuos de la placa de cultivo y para preparar las células para el paso de tinción. A continuación, incubar las células en una solución de HBSS que contenga una concentración final de 50 ano molar lyo tracker y 150 ano molar de tubulin tracker green durante una hora a 37 grados centígrados después de la incubación. Lave las celdas tres veces en HBSS para eliminar cualquier tinte suelto.

Agregue medio de crecimiento DMEM fresco antes de obtener imágenes de las células. El microscopio para el seguimiento de partículas descrito en el protocolo de vídeo se monta en el marco de un microscopio invertido disponible en el mercado. Se utiliza una fuente de luz de excitación láser de femtosegundo de zafiro de titanio camaleónico ultra dos coherente con un rango de longitud de onda de salida sintonizable entre 690 nanómetros y 1040 nanómetros.

Asegúrese de que el rayo láser esté alineado en el puerto trasero del microscopio. Usando espejos recubiertos de infrarrojos, el rayo láser se atenúa usando una placa giratoria de media onda colocada frente a un polarizador de calcita, atenúa el haz para que la potencia promedio en la muestra esté entre 0,5 y dos milivatios. Recoja la luz de fluorescencia de la muestra colocando un objetivo de agua de alta apertura numérica en la trayectoria de la luz.

A continuación, coloque la muestra en una platina motorizada y ajuste el movimiento fino del objetivo del microscopio. Usando un controlador de pizo objetivo. Elija un cubo de filtro de fluorescencia de acuerdo con las longitudes de onda de emisión deseadas en una configuración de uno o dos canales.

Emplear filtros pasados por banda de emisión. Para seleccionar aún más el rango espectral de la fluorescencia emitida, dirija la luz del cubo de filtro a tubos fotomultiplicadores donde la señal se amplifica y discrimina y se envía a una tarjeta de adquisición de datos de salida de entrada digital para obtener imágenes de las células, colocarlas en la plataforma y enfocarlas utilizando iluminación de luz transmitida. Cambie a imágenes de escaneo de trama para identificar las células que han incorporado el tinte y, para visualizar los microtúbulos subyacentes, identifique el área inicial donde está presente el movimiento de las vesículas.

Una vez identificada una vesícula aislada, establezca los parámetros para el seguimiento orbital. Primero, seleccione el radio de la órbita para definir el tamaño del escaneo circular de acuerdo con el tamaño de la partícula que se está rastreando. Para un emisor puntual, establezca el radio de la órbita igual a la cintura de la función de dispersión de puntos o PSF del haz de excitación.

Para maximizar la sensibilidad y la respuesta. Establezca la distancia axial para definir la distancia entre las dos órbitas que se realizan para localizar la posición de la partícula a lo largo de la dirección axial. Ajuste la distancia axial de 1,5 a tres veces el desperdicio de PSF.

Defina el tiempo de permanencia de acuerdo con el brillo de la partícula, para establecer el tiempo dedicado en cada punto de la órbita, lo que también determinará la tasa de fotoblanqueo. Utilice un tiempo de permanencia entre 10 y 100 microsegundos. Establezca el número de puntos en cada órbita en 64 o 128 para producir períodos de órbita del orden de cuatro a 32 milisegundos, y proporcione una alta resolución temporal para determinar la posición de la partícula.

Cambie la señal de compensación de CC enviada a los espejos para centrar el haz en la partícula a través de la interfaz gráfica de usuario a través de una selección de cursor en la imagen escaneada de trama. Comience el seguimiento cambiando el modo de microscopio de imágenes rasterizadas a escaneo orbital. Activar la retroalimentación y la recopilación de datos para el análisis de trayectorias.

Utilice el software para mostrar la fluorescencia recogida en cada punto a lo largo de la órbita y en cada punto de tiempo en forma de alfombra de intensidad. La intensidad recogida a lo largo de la alfombra proporciona información sobre la interacción de la partícula con otros objetos brillantes. Muestra tanto la información de la trayectoria como la intensidad de fluorescencia recogida del tubo fotomultiplicador a lo largo del tiempo en forma de series temporales.

Utilice la representación de series temporales y la información de la alfombra de intensidad para seleccionar solo una región de interés en la trayectoria. A continuación, visualice una proyección 2D de la parte seleccionada de la trayectoria de la partícula. Seleccione los controles apropiados para codificar por colores la trayectoria de acuerdo con la intensidad de fluorescencia de la partícula.

Seleccione la opción para mostrar la trayectoria de la partícula en 3D y codificarla por colores según la intensidad de fluorescencia. Gire la trayectoria en 3D usando los controles para visualizar las características del movimiento del lisosoma a lo largo del microtúbulo. Utilizando una tinción de tinción de colorante verde fluorescente de los lisosomas y de los microtúbulos, es posible obtener imágenes del movimiento a alta velocidad de las vesículas a lo largo de los microtúbulos con un microscopio de barrido láser de dos fotones.

Sin embargo, las imágenes de escaneo de trama no tienen la resolución temporal necesaria para seguir con precisión el movimiento de los endosomas más rápidos si se utiliza el seguimiento orbital. En cambio, los datos muestran que es posible obtener trayectorias de desplazamiento x, y, Z con una resolución temporal de 32 milisegundos. En estas trayectorias de desplazamiento en función del tiempo, el análisis de la alfombra muestra la intensidad registrada a lo largo de cada órbita.

Con el tiempo, la trayectoria de intensidad proporciona información sobre el entorno fluorescente de la partícula. La región encajonada corresponde a la parte de la trayectoria entre dos saltos. Los puntos brillantes fuera de la región encajonada corresponden a las interacciones de la partícula con otros objetos brillantes y están asociados a saltos en la trayectoria a medida que las órbitas se vuelven a centrar en la fuente fluorescente más brillante.

Durante el seguimiento, se puede registrar la intensidad integrada de la fluorescencia emitida. La trayectoria 3D reconstruida muestra un movimiento dirigido, como se puede esperar de una vesícula que se mueve en la red de microtúbulos. Además, es posible correlacionar la trayectoria 3D con un RA o una imagen de escaneo de la región circundante.

Esto confirma el movimiento de la partícula a lo largo de la dirección de un haz de microtúbulos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en pocas horas si se realiza correctamente mientras se intenta. Es importante recordar este procedimiento para usar un nivel de potencia láser que no sea dañino para su muestra mientras se usa la citación fotónica como se ilustra en este protocolo, se deben mantener niveles de potencia de aproximadamente dos milivoltios después de los objetivos.

Después de ver este video, debería tener una muy buena comprensión de cómo configurar un experimento utilizando el método de seguimiento orbital 3D, que permite rastrear objetos de un rango Z muy grande.