Visualización de la proteína-DNA en células bacterianas en directo mediante fotoactivado Tracking Single-molécula

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar directamente la actividad de las proteínas de unión al ADN en células bacterianas vivas. Esto se logra mediante la visualización de células que expresan una proteína fluorescente fotoactivada fusionada con una proteína de unión al ADN de interés. El segundo paso del procedimiento es adquirir una película de proteínas individuales que se fotoactivan mientras se obtienen imágenes.

Luego, los datos se analizan para determinar las localizaciones de proteínas y rastrear las proteínas dentro de las células individuales. Los eventos de unión al ADN se identifican por el cambio en el coeficiente de difusión de proteínas individuales cuando entran en contacto con los cromosomas. En última instancia, los resultados pueden proporcionar una medida cuantitativa de las interacciones entre proteínas y ADN a nivel de una sola célula mediante el recuento del número de proteínas unidas y difusas por célula.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reparación del ADN, como las tasas de reparación in vivo y la distribución espacial de los sitios de reparación. Ahora demostraremos el método midiendo la actividad de reparación de la ADN polimerasa una en células de E. coli vivas: primero haremos cubreobjetos sin partículas fluorescentes de fondo en un horno a 500 grados Celsius durante una hora. Queme un suministro de cubreobjetos de espesor número 1.5, guárdelos a temperatura ambiente en papel de aluminio.

Son buenos para las próximas semanas. A continuación, concentre un mililitro de E coli de fase exponencial temprana en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros de la cepa. AB 1157 poly a PA m centrífuga de cereza las células a 2.300 G durante cinco minutos.

Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 20 microlitros de medio residual y haga un vórtice de las células en solución. A continuación, prepare una solución de aros de baja fluorescencia al 1,5% en agua destilada. Mezcle 500 microlitros de los aeros derretidos con 500 microlitros de dos x medio mínimo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para experimentos de daño al ADN usando sulfonato de metilmetano o MMS, tomando precauciones.

Agregue 8.3 microlitros de MMS a los 500 microlitros de medio mínimo antes de mezclarlo con los aros antes de que la mezcla se enfríe. Extiéndalo en un cubreobjetos quemado. Extiéndelo de manera uniforme y centrado sin hacer burbujas.

Aplana la almohadilla con un segundo cubreobjetos quemado. Una vez enfriado, retire la cubierta superior de la almohadilla y agregue un microlitro de suspensión de celdas concentradas. Inmovilice las celdas cubriendo la almohadilla con un nuevo cubreobjetos quemado y presionando hacia abajo muy suavemente.

Las células deben ser visualizadas dentro de los 45 minutos antes de que se sequen. Para extender este tiempo, la almohadilla se puede sellar dentro de una junta de silicona para experimentos de daño en el ADN. Antes de obtener imágenes de las células, incubérelas en la almohadilla durante 20 minutos.

En un recipiente humidificado a temperatura ambiente, el microscopio cuenta con un láser de fotoactivación de 405 nanómetros y un láser de excitación de 561 nanómetros. La sensibilidad de una sola molécula se alcanza excitando solo cuatro fluorescentes dentro de una sección delgada sobre la superficie del deslizamiento de la cubierta utilizando iluminación altamente inclinada, la emisión de fluorescencia se registra en una cámara CCD multiplicadora de electrones. Coloque la muestra en la platina del microscopio y enfoque las células.

Bajo iluminación de luz transmitida, defina un campo de visión recortado para reducir el tamaño de los datos y aumentar la velocidad de lectura de la cámara. Cubra la muestra de la luz ambiental y encienda la ganancia de la cámara CCD que multiplica los electrones para la detección de un solo fluoro cuatro. Establezca la velocidad de fotogramas en 15,26 milisegundos por fotograma.

Esto incluye la lectura de la cámara de 0,26 milisegundos: los tiempos de exposición deben ser lo suficientemente cortos para observar puntos fluorescentes nítidos con poco movimiento. Por otro lado, las pistas deben muestrearse a intervalos de tiempo suficientemente largos para distinguir claramente el enlace de las moléculas difusoras. Ahora muestre los datos de la cámara para verificar la señal de fondo oscuro.

Encienda el láser de 561 nanómetros y compruebe la señal de fondo de excitación. Encienda el láser de 405 nanómetros para la fotoactivación de las proteínas de fusión de cereza Paul one PA M y aumente la intensidad hasta que aparezcan puntos fluorescentes de moléculas individuales. Ahora ajuste el ángulo del haz de excitación para iluminar solo una sección delgada de la muestra.

Cierre la superficie deslizante de la cubierta. Este método se basa en la detección y localización precisa de proteínas fluorescentes individuales, por lo que la alineación y la sensibilidad óptimas del microscopio serán cruciales para la calidad de los datos. Para ello, enfoque el rayo láser en el plano focal posterior de un objetivo de 100 x con apertura numérica de 1,4.

La traslación de la lente de enfoque perpendicular al haz aleja el foco del centro del objetivo, lo que hace que el haz salga del objetivo en ángulo. Apunte a que el haz maximice la intensidad de la fluorescencia y minimice el fondo. Encuentre un nuevo campo de visión de las células en el modo de microscopía de luz transmitida y enfoque la imagen.

Tome una instantánea de la cámara para registrar los contornos de las celdas. Encienda el láser de 561 nanómetros y blanquee la autofluorescencia celular y las manchas de fondo en la cubierta. Deslízate durante unos segundos.

Antes de iniciar la adquisición de datos, inicie la adquisición de una película de la palma de la mano bajo una excitación continua de 561 nanómetros. Encienda el láser de 405 nanómetros y aumente gradualmente la intensidad a lo largo de la película, alcanzando hasta un vatio por centímetro cuadrado. Evite intensidades más altas de 405 nanómetros que causen autofluorescencia celular.

Preste atención a la densidad de las moléculas fluorescentes. Es importante mantener bajas las tasas de activación, de modo que los puntos fluorescentes estén claramente aislados en cada fotograma. Grabe alrededor de 10.000 fotogramas por película, que con un campo de visión recortado suele tardar hasta tres minutos y hasta un gigabyte de espacio en el disco duro.

Tenga en cuenta que una vez que se ha obtenido una imagen de un campo de visión, los fluoróforos de cereza se blanquean irreversiblemente y no se pueden observar. De nuevo, el siguiente procedimiento utiliza software personalizado en matlab. Los fluoróforos individuales aparecen como funciones de dispersión puntual o psfs.

En la película, las psfs se identifican por primera vez en una imagen filtrada de paso de banda utilizando un kernel gaussiano con siete píxeles de diámetro, las posiciones candidatas corresponden a P SFS con intensidades máximas de píxeles 4,5 veces por encima de la desviación estándar del fondo. El píxel localmente más brillante por PSF candidato sirve como una estimación inicial para ajustar una función gaussiana elíptica. Los parámetros de ajuste libre son la posición X y, la posición X anchura, la anchura Y la rotación, el ángulo, la amplitud y el desplazamiento del fondo.

La máscara gaussiana elíptica tiene en cuenta el movimiento de las moléculas durante el tiempo de exposición, lo que difumina y deforma el gráfico PSF. Las localizaciones XY resultantes de todos los fotogramas de la película de la palma en la imagen de microscopía de luz transmitida del mismo campo de visión de las localizaciones de Paul one PAM Cherry deben aparecer dentro del área central de las células de E. coli. El seguimiento automatizado mide el movimiento de las proteínas, pero la elección exitosa de una ventana de seguimiento es crucial.

En primer lugar, ejecute el algoritmo de seguimiento para un rango de parámetros de la ventana de seguimiento. Trace el número de pistas medidas por celda en comparación con la ventana de seguimiento para identificar la ventana de seguimiento más pequeña posible que no divida las pistas, muestre las pistas resultantes en la imagen de microscopía de luz transmitida del mismo campo de visión. Para visualizar la distribución espacial del movimiento de las moléculas dentro de las células, las pistas de P one deben mostrar la difusión confinada dentro de las células individuales si una fracción de las pistas parece cruzarse entre las células, esto sugiere que las moléculas separadas se unieron erróneamente porque la ventana de seguimiento se eligió demasiado grande o la tasa de fotoactivación era demasiado alta.

Represente la distribución acumulativa de las longitudes de paso entre localizaciones consecutivas. La curva se eleva y se satura suavemente para ventanas de seguimiento suficientemente grandes, pero muestra un borde de corte si la ventana se eligió demasiado pequeña. Una vez elegida una ventana de seguimiento adecuada, se pueden analizar las características de difusión de Paul one.

Calcule el desplazamiento cuadrático medio o MSD entre localizaciones consecutivas para cada pista con un total de n pasos, utilice solo pistas con al menos cinco localizaciones para reducir la incertidumbre estadística de la MSD. A continuación, calcule el coeficiente de difusión aparente por pista a partir del MSD. El segundo término corrige el error de localización estimado.

Estos son los valores para el segundo término. En este ejemplo, ahora trace un histograma de los valores medidos del coeficiente de difusión de todas las pistas en el campo de visión para pol one en células no dañadas y para pol one en células bajo tratamiento de daño en el ADN con MMS, las barras rojas identifican la población de moléculas individuales de pol one que parecen unidas al cromosoma y se difunden a menos de 0,15 micras cuadradas por segundo. Mientras que las moléculas que se difunden libremente se mueven alrededor de 0,9 micras cuadradas por segundo.

Después de la unión de Paul se han identificado una molécula. Las posiciones de los sitios de unión se pueden visualizar en células no dañadas y en células con daño por EM en mm. La fracción de huellas ligadas en relación con el número total de huellas observadas proporciona una medida cuantitativa directa de la actividad de reparación del ADN de pol.

Se llevó a cabo una fotoactivación in vivo de proteínas de fusión de cereza pol one PA m en células vivas de E. coli. La fotoactivación podría limitarse a un solo fluoróforo de cereza PA m en una célula, las tasas de fotoactivación más altas revelaron más moléculas fluorescentes. Se realizó un análisis de localización para cada fotograma de una película de la palma de la mano.

La precisión se midió utilizando moléculas inmóviles en células fijas o moléculas unidas en células vivas, y se encontró que era de 40 nanómetros de acuerdo con la predicción teórica. A continuación, el umbral de localización se estableció cuando era demasiado bajo. Los picos aleatorios en el ruido de fondo se seleccionaron erróneamente como posiciones candidatas, mientras que si el umbral era demasiado alto, se omitieron algunos puntos.

Las localizaciones de Paul one resultantes ocuparon el área central de la célula, recapitulando a grandes rasgos la organización espacial del nucleoide de E. coli. La mayoría de las huellas de Paul One en células no dañadas muestran difusión. Una célula típica contiene varios cientos de trazas de Paul uno, lo que coincide con el número de copias de aproximadamente 400 moléculas de Paul uno por célula de E. coli.

Se pueden identificar diferentes tipos de movimiento molecular calculando los valores de MSD en un rango de tiempos de retraso: el movimiento dirigido da una curva parabólica. El movimiento browniano se caracteriza por una línea recta. Una curva de difusión confinada alcanza una meseta y un desplazamiento de la curva MSD para partículas inmóviles representa la incertidumbre de localización.

La curva MSD resultante para Paul one aumentó linealmente para tiempos de retraso cortos, indicativos de movimiento browniano, y se saturó en tiempos de retraso más largos debido al confinamiento celular. Usando estos métodos, se midió la actividad de reparación del ADN de Paul, uno en respuesta al daño de la alquilación del ADN exógeno en células no dañadas. El histograma del coeficiente de difusión de Paul one muestra una población dominante de moléculas difusoras.

Las pocas moléculas unidas podrían estar involucradas en la replicación del ADN y la reparación del daño endógeno del ADN bajo un daño MMS continuo de 100 milimolares. La frecuencia de las pistas con coeficientes de difusión cercanos a cero aumenta significativamente. Esto apoya el modelo de que más moléculas de Paul uno deben estar involucradas en la reparación del ADN con mutágeno presente siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos de análisis de datos, como la localización y el agrupamiento, para cuantificar la distribución espacial de las proteínas en la célula e investigar la presencia de complejos proteicos más grandes involucrados en la reparación del ADN.