Visualización de la proteína-DNA en células bacterianas en directo mediante fotoactivado Tracking Single-molécula

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar directamente la actividad de proteínas de unión al ADN en células bacterianas vivas. Esto se logra visualizando células que expresan una proteína fluorescente fotoactivada fusionada a una proteína de unión al ADN de interés. El segundo paso del procedimiento consiste en adquirir una película de proteínas individuales que se activan mediante luz mientras se las imagina.

Luego, los datos se analizan para determinar localizaciones proteicas y rastrear proteínas dentro de células individuales. Los eventos de unión al ADN se identifican por el cambio en el coeficiente de difusión de proteínas individuales cuando entran en contacto con los cromosomas. En última instancia, los resultados pueden proporcionar una medida cuantitativa de las interacciones proteína-ADN a nivel de célula individual mediante el conteo del número de proteínas unidas y en difusión por célula.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reparación del ADN, como las tasas de reparación in vivo y la distribución espacial de los sitios de reparación. Ahora demostraremos el método midiendo la actividad de reparación de la ADN polimerasa uno en células vivas de E. coli. Primero, prepare cubreobjetos sin partículas fluorescentes de fondo en un horno a 500 grados Celsius durante una hora. Queme un suministro estándar de cubreobjetos de grosor número 1.5 y guárdelos a temperatura ambiente envueltos en papel de aluminio.

Son buenos durante semanas venideras. A continuación, concentre un mililitro de fase exponencial temprana de E. coli de la cepa AB1157 poli A PA mCherry en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugue las células a 2.300 ×g durante cinco minutos.

Elimine el sobrenadante y resuspenda el botón celular en 20 microlitros de medio residual, luego vortex las células hasta obtener una solución homogénea. A continuación, prepare una solución de agarosa al 1,5 % de baja fluorescencia en agua destilada. Mezcle 500 microlitros de agarosa fundida con 500 microlitros de medio mínimo 2x mediante pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo varias veces para experimentos de daño del ADN con metil metanosulfonato o MMS, tomando las precauciones necesarias.

Añada 8,3 microlitros de MMS a los 500 microlitros de medio mínimo antes de mezclarlo con los aros antes de que la mezcla se enfríe. Extiéndalo sobre un cubreobjetos quemado. Distribúyalo de manera uniforme y centrada sin formar burbujas.

Aplane el almohadillado con una segunda cubreobjetivo calcinada. Una vez enfriado, retire la cubreobjetivo superior del almohadillado y agregue un microlitro de suspensión celular concentrada. Inmovilice las células cubriendo el almohadillado con una nueva cubreobjetivo calcinada y presionando muy suavemente hacia abajo.

Las células deben ser observadas mediante microscopía dentro de los 45 minutos antes de que se deshidraten. Para prolongar este tiempo, la preparación puede sellarse dentro de una junta de silicona para experimentos de daño en el ADN. Antes de observar las células, incúbelas sobre la preparación durante 20 minutos.

En un recipiente humedecido a temperatura ambiente, el microscopio cuenta con un láser de activación fotónica de 405 nanómetros y un láser de excitación de 561 nanómetros. Se alcanza la sensibilidad a nivel de molécula individual al excitar únicamente los fluoróforos dentro de una sección delgada por encima de la superficie del cubreobjetos mediante una iluminación altamente inclinada; la emisión fluorescente se registra en una cámara CCD con multiplicación electrónica. Coloque la muestra sobre la platina del microscopio y enfoque las células.

Bajo iluminación de luz transmitida, defina un campo de visión recortado para reducir el tamaño de los datos y aumentar la velocidad de lectura de la cámara. Cubra la muestra de la luz ambiental y active la ganancia de la cámara CCD de multiplicación electrónica para la detección individual de fluoro cuatro. Establezca la velocidad de cuadro en 15,26 milisegundos por cuadro.

Esto incluye el tiempo de lectura de la cámara de 0.26 milisegundos. Los tiempos de exposición deben ser suficientemente cortos para observar puntos fluorescentes nítidos con poca difusión por movimiento. Por otro lado, las trayectorias deben muestrearse a intervalos de tiempo suficientemente largos para distinguir claramente las moléculas fijas de las que difunden. Ahora muestre los datos de la cámara para verificar la señal de fondo oscuro.

Encienda el láser de 561 nanómetros y verifique la señal de fondo de excitación. Encienda el láser de 405 nanómetros para la fotoactivación de las proteínas de fusión Paul one PA M cherry y aumente la intensidad hasta que aparezcan puntos fluorescentes de moléculas individuales. Ajuste ahora el ángulo del haz de excitación para iluminar únicamente una sección delgada de la muestra.

Cierre la superficie del cubreobjetos. Este método depende de la detección y localización precisa de proteínas fluorescentes individuales, por lo que el alineamiento óptimo y la sensibilidad del microscopio serán cruciales para la calidad de los datos. Para ello, enfoque el haz láser en el plano focal posterior de un objetivo de 100 x con apertura numérica 1.4.

Trasladar la lente de enfoque perpendicular al haz desplaza el punto focal desde el centro del objetivo, haciendo que el haz salga del objetivo con un ángulo. Apunte a que el haz maximice la intensidad de fluorescencia y minimice el fondo. Busque un nuevo campo de visión de células en el modo de microscopía de luz transmitida y enfoque la imagen.

Tome una instantánea con la cámara para registrar los contornos celulares. Encienda el láser de 561 nanómetros y blanquee la autofluorescencia celular y los puntos de fondo en la cubierta. Deslice durante unos segundos.

Antes de comenzar la adquisición de datos, inicie la adquisición de una película PALM bajo excitación continua de 561 nanómetros. Encienda el láser de 405 nanómetros y aumente gradualmente la intensidad durante la película hasta alcanzar un vatio por centímetro cuadrado. Evite intensidades más altas de 405 nanómetros que provoquen autofluorescencia celular.

Preste atención a la densidad de las moléculas fluorescentes. Es importante mantener tasas de activación bajas de manera que los puntos fluorescentes estén claramente aislados en cada cuadro. Registre aproximadamente 10.000 cuadros por película, lo que, con un campo de visión recortado, generalmente toma hasta tres minutos y hasta un gigabyte de espacio en disco duro.

Tenga en cuenta que una vez que se ha obtenido una imagen de un campo de visión, los fluoróforos pa m cherry quedan irreversiblemente fotodegradados y no pueden observarse. Nuevamente, el siguiente procedimiento utiliza software personalizado en matlab. Los fluoróforos individuales aparecen como funciones de dispersión puntual o psfs.

En la película, primero se identifican las PSF en una imagen filtrada por paso de banda utilizando un kernel gaussiano con un diámetro de siete píxeles; las posiciones candidatas corresponden a PSF cuyos píxeles máximos tienen intensidades 4,5 veces superiores a la desviación estándar del fondo. El píxel localmente más brillante por cada PSF candidata sirve como estimación inicial para ajustar una función gaussiana elíptica. Los parámetros libres del ajuste son: posición X, posición Y, ancho X, ancho Y, ángulo de rotación, amplitud y desplazamiento del fondo.

La máscara gaussiana elíptica tiene en cuenta el movimiento de la molécula durante el tiempo de exposición, lo que desenfoca y deforma el gráfico de la PSF. Las localizaciones en XY resultantes de todos los fotogramas del video de PALM se superponen sobre la imagen de microscopía de luz transmitida del mismo campo de visión; las localizaciones de Paul una PAM Cherry deben aparecer dentro del área central de las células de E. coli. El seguimiento automatizado mide el movimiento de las proteínas, pero la elección adecuada de una ventana de seguimiento es crucial.

Primero, ejecute el algoritmo de seguimiento para un rango de parámetros de la ventana de rastreo. Represente gráficamente el número de trayectorias medidas por célula frente a la ventana de rastreo para identificar la ventana de rastreo más pequeña posible que no divida las trayectorias; muestre las trayectorias resultantes sobre la imagen de microscopía de luz transmitida del mismo campo de visión. Para visualizar la distribución espacial del movimiento de las moléculas dentro de las células, las trayectorias deben mostrar difusión confinada dentro de células individuales; si una fracción de las trayectorias parece cruzar entre células, esto sugiere que se vincularon erróneamente moléculas separadas porque la ventana de rastreo fue elegida demasiado grande y/o la tasa de fotoactivación fue demasiado alta.

Trace la distribución acumulativa de las longitudes de los pasos entre localizaciones consecutivas. La curva aumenta y se satura suavemente para ventanas de seguimiento suficientemente grandes, pero muestra un borde de corte si la ventana fue elegida demasiado pequeña. Una vez que se ha seleccionado una ventana de seguimiento adecuada, pueden analizarse las características de difusión de Paul one.

Calcule el desplazamiento cuadrático medio o MSD entre localizaciones consecutivas para cada trayectoria con un total de n pasos; utilice únicamente trayectorias con al menos cinco localizaciones para reducir la incertidumbre estadística del MSD. A continuación, calcule el coeficiente de difusión aparente por trayectoria a partir del MSD. El segundo término corrige el error de localización estimado.

Estos son los valores para el segundo término. En este ejemplo, grafique ahora un histograma de los valores medidos del coeficiente de difusión provenientes de todas las trayectorias en el campo de visión para la pol uno en células no dañadas y para la pol uno en células sometidas a tratamiento con daño de ADN mediante MMS; las barras rojas identifican la población de moléculas individuales de pol uno que parecen estar unidas al cromosoma y se difunden a menos de 0,15 micrómetros cuadrados por segundo. Mientras tanto, las moléculas que difunden libremente se mueven alrededor de 0,9 micrómetros cuadrados por segundo.

Después de que se han identificado las moléculas de Paul unión. Las posiciones de los sitios de unión pueden visualizarse en células no dañadas y en células con daño en mm MS. La fracción de trayectos unidos en relación con el número total de trayectos observados proporciona una medida cuantitativa directa de la actividad de reparación del ADN de la pol.

Una activación fotoinducida in vivo de proteínas de fusión Pol una PA m-cherry se llevó a cabo en células vivas de E. coli. La activación fotoinducida podía limitarse a un solo fluoróforo PA m-cherry en una célula; tasas más altas de activación fotoinducida revelaron un mayor número de moléculas fluorescentes. Se realizó un análisis de localización para cada cuadro de una película PALM.

La precisión se midió utilizando moléculas inmóviles en células fijadas o moléculas unidas en células vivas, y se encontró que era de 40 nanómetros, en concordancia con la predicción teórica. A continuación, se estableció el umbral de localización: cuando era demasiado bajo, picos aleatorios en el ruido de fondo se seleccionaban erróneamente como posiciones candidatas; por el contrario, si el umbral era demasiado alto, se omitían algunos puntos.

Las localizaciones resultantes de Paul one ocuparon el área central de la célula, recapitulando ampliamente la organización espacial del nucleoide de e coli. La mayoría de las trayectorias de Paul one en células no dañadas muestran difusión. Una célula típica contiene varios cientos de trayectorias de Paul one, lo que es consistente con un número de copias de aproximadamente 400 moléculas de Paul one por célula de e coli.

Pueden identificarse diferentes tipos de movimiento molecular calculando los valores de MSD en una serie de tiempos de retraso: el movimiento dirigido produce una curva parabólica. El movimiento browniano se caracteriza por una línea recta. Una curva de difusión confinada alcanza una meseta, y un desplazamiento de la curva de MSD para partículas inmóviles representa la incertidumbre en la localización.

La curva resultante de MSD para Paul uno aumentó linealmente con tiempos de retardo cortos, lo que indica un movimiento browniano, y se saturó en tiempos de retardo más largos debido al confinamiento celular. Mediante estos métodos, se midió la actividad de reparación del ADN de Paul uno en respuesta a daños exógenos por alquilación del ADN en células no dañadas. El histograma del coeficiente de difusión de Paul uno muestra una población predominante de moléculas en difusión.

Las pocas moléculas unidas podrían estar involucradas en la replicación del ADN y en la reparación de daños endógenos en el ADN bajo un daño continuo con MMS de 100 milimolares. La frecuencia de trayectorias con coeficientes de difusión cercanos a cero aumenta significativamente. Esto respalda el modelo de que más moléculas de Paul uno deben participar en la reparación del ADN cuando está presente un agente mutagénico siguiendo este procedimiento.

Pueden realizarse otros métodos de análisis de datos, como la localización y la agrupación, para cuantificar la distribución espacial de las proteínas en la célula y para investigar la presencia de complejos proteicos más grandes implicados en la reparación del ADN.