Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

El objetivo general de este protocolo es describir los procedimientos necesarios para la generación exitosa de ratones modificados genéticamente mediante microinyección de ovocitos. Este protocolo puede ayudar a los investigadores y al personal técnico involucrado en el campo de la génesis de ratones, pero también en la selección de genes. La principal ventaja de esta técnica, es que se basa en la inyección directa de ovocitos de ratón, tanto para la integración aleatoria, como para la focalización génica, permitiendo la generación de ratones modificados genéticamente en tan solo seis semanas.

Para preparar un solo ARN guía, después de seleccionar las dos secuencias objetivo deseadas y hacer cebadores de acuerdo con el protocolo de texto, se sintetiza una plantilla de ADN lineal diluyendo el plásmido PX330 a 10 nanogramos por microlitro en agua libre de nucleasas. Prepare una mezcla maestra, agregando la polimerasa al final, y manténgala en hielo. A continuación, mezcle y divida la solución en ocho tubos de PCR.

Agregue un microlitro de PXR330 por tubo y ejecute el siguiente programa. A continuación, utilice un kit de purificación de PCR, un colector y una fuente de vacío para purificar el producto de PCR. Añada cinco volúmenes de tampón de unión a un volumen de la muestra de PCR y mezcle.

Coloque la columna de giro de la membrana de silicona en el colector. Para unir el ADN, aplique las ocho muestras a la columna, en el vacío. Para lavar la muestra, agregue 0,75 mililitros de tampón de lavado a la columna y aspire.

A continuación, centrifugar la columna a 12.000 veces G durante 60 segundos para eliminar el etanol residual. Coloque la columna en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros, luego, para eluir el ADN, agregue 30 microlitros de agua libre de nucleasas al centro de la membrana. Deje reposar la columna durante un minuto y centrifuérela, 12.000 veces G durante 60 segundos.

A continuación, utilice un espectrofotómetro para medir la concentración de ADN. Para llevar a cabo la transcripción in vitro utilizando un kit de síntesis de ARN t7, prepare la mezcla maestra e incube la reacción en un termociclador a 37 grados centígrados durante tres horas. Agregue 28 microlitros de agua libre de nucleasa y dos microlitros de ADNasa uno, e incube la reacción durante otros 15 minutos.

Para purificar el ARN, disuelva el polvo contenido en la columna de centrifugación provista y 650 microlitros de tampón de microinyección libre de nucleasas. Retire con cuidado todas las burbujas de aire, tape el tubo e hidrate la solución a temperatura ambiente durante cinco a 15 minutos. Retire la tapa azul en la parte inferior y coloque la columna en un tubo de dos mililitros.

A continuación, centrifugar el tubo a 750 veces G a temperatura ambiente durante dos minutos. A continuación, coloque la columna en un tubo nuevo de 1,5 mililitros y aplique 50 microlitros de la solución de ARN gota a gota en el centro, sin tocar la pared de la columna. A continuación, gira la columna a 750 veces G durante dos minutos.

Mida la concentración de ARN y evalúe la calidad del ARN de acuerdo con el protocolo de texto. Usando un tampón de microinyección libre de nucleasas, diluya el ARNm de la caja a 50 nanogramos por microlitro y los sgRNA a 12,5 nanogramos por microlitro para experimentos de eliminación de genes. Agregue la plantilla del donante a una concentración de 200 nanogramos por microlitro, para la edición del genoma basada en la reparación directa de homología y manténgala en hielo.

Utilice la boquilla aspiradora, para lavar los ovocitos con cuatro gotas frescas de aminoácidos caseína. Y transfiéralos a una gota final de casome ocho medio, recubierto con aceite mineral. Para llevar a cabo la inyección pro nuclear para la integración aleatoria, bajo el microscopio estereoscópico, use la boquilla del aspirador para transformar aproximadamente 50 huevos en una gota de medio m2, recubierta con aceite mineral que se utilizará como cámara de inyección.

Transfiera la cámara de inyección a un microscopio invertido e inyecte los ovocitos fertilizados con unos pocos picolitros de la mezcla de inyección. El pronúcleo se hinchará si la inyección tiene éxito. Realice la inyección citoplasmática para la orientación de genes, use una boquilla para transferir aproximadamente 50 huevos a una gota de casoma A, que contiene cinco microgramos por mililitro de citocalasina B e incube los huevos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cinco minutos.

Transfiera los óvulos a la cámara de inyección, luego, a muy baja presión, inyecte unos picolitros de la mezcla de inyección en el citoplasma. Utilizar la presión de compensación del microinyector automático siempre que sea posible. Después de la inyección, utilice la boquilla para transferir los ovocitos de nuevo a una gota de casomeaminoácidos.

Manténgalos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que se carguen para su reimplantación en el oviducto de las hembras pseudo embarazadas. Después de anestesiar a un ratón hembra taponado de acuerdo con el protocolo de texto, para llevar a cabo la reimplantación en condiciones estériles, exponga el tracto reproductivo mediante el uso de un bisturí a una incisión de un centímetro de largo paralela a la línea media dorsal. Luego, con unas tijeras, corte el músculo y use pinzas para agarrar la almohadilla de grasa.

Tire suavemente del ovario hacia afuera, hasta que el oviducto y el útero adheridos sean claramente visibles. Luego use una abrazadera de recipiente para fijar la almohadilla de grasa. Bajo el microscopio estereoscópico, use un par de microtijeras para hacer una incisión en la pared del oviducto, unos milímetros aguas arriba de la ampolla.

Además, bajo el microscopio estereoscópico, cargue 25 huevos microinyectados en el capilar de vidrio conectado a la boquilla. A continuación, introduce el capilar de vidrio en el oviducto y expulsa los huevos hasta que se vea una burbuja de aire en el interior de la ampolla. Para asegurarse de que la reimplantación ha sido exitosa, debe verificar la presencia de la burbuja de aire en la ampolla, lo que garantiza que todos los óvulos hayan sido expulsados en el lugar correcto y que ninguno permanezca en el capilar de vidrio.

Retire suavemente el capilar de vidrio y vuelva a colocar el tracto reproductivo en el abdomen. A continuación, utilice tres suturas quirúrgicas cero no absorbibles para suturar la incisión y, a continuación, utilice clips para heridas para cerrar la piel. Coloque el ratón sobre una colchoneta tibia para evitar la hipotermia e inyecte analgésico por vía subcutánea.

Monitoree el mouse hasta una recuperación completa. Por último, realizar la tipificación y secuenciación del genoma según el protocolo de texto. Esta figura muestra geles analíticos que demuestran la calidad de la purificación del transgén y la síntesis de sgRNA, que son fundamentales para generar con éxito ratones modificados genéticamente.

Aquí se muestra una lectura típica de una sesión de microinyección para la integración aleatoria. El cebador de genotipado debe asentarse en el transgén y debe estar diseñado para generar un fragmento de 200 a 800 pares de bases. En esta lectura de la selección de genes, los cebadores seleccionados para hibridarse con el ADN genómico fuera de la región finalmente fueron extirpados por los dos hombres.

Esta estrategia permite la identificación directa de fundadores heterocigotos y homocigotos. Como se ilustra aquí, cuando se optimiza cada paso del protocolo, el porcentaje de cachorros transgénicos debe alcanzar entre el 10% y el 25% para la integración aleatoria, que es algo bajo en comparación con la capacidad de los componentes CRISPR para editar el genoma del ratón. Al usar CRISPR para la orientación de genes, el número de fundadores es generalmente mayor, oscilando entre el 25% y el 100%no es raro obtener una progenie completa que es homocigota con éxito cuando se edita con CRISPR.

Tras su desarrollo, esta técnica permite a los investigadores de campos como la neurociencia o el cáncer, por ejemplo, utilizar nuevos modelos de mascarillas para descubrir mecanismos patológicos y, finalmente, traducirlos en estrategias terapéuticas.