Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

El objetivo general de este protocolo es describir los procedimientos necesarios para la generación exitosa de ratones modificados genéticamente mediante microinyección de ovocitos. Este protocolo puede ayudar a investigadores y personal técnico involucrado tanto en el campo de la generación de ratones como en la edición génica. La principal ventaja de esta técnica es que se basa en la inyección directa de ovocitos de ratón, tanto para integración aleatoria como para edición génica, lo que permite la generación de ratones modificados genéticamente en tan solo seis semanas.

Para preparar un ARN guía individual, tras seleccionar las dos secuencias diana deseadas y diseñar los cebadores según el protocolo descrito, sintetice una plantilla de ADN lineal diluyendo el plásmido PX330 hasta 10 nanogramos por microlitro en agua libre de nucleasas. Prepare una mezcla maestra, agregando la polimerasa al final, y manténgala en hielo. Luego mezcle y divida la solución en ocho tubos de PCR.

Añada un microlitro de PXR330 por tubo y ejecute el siguiente programa. A continuación, utilice un kit de purificación de PCR, un manifold y una fuente de vacío para purificar el producto de PCR. Añada cinco volúmenes de tampón de unión a un volumen de la muestra de PCR y mezcle.

Coloque la columna de centrifugación con membrana de silicio en el manifold. Para unir el ADN, aplique las ocho muestras a la columna bajo vacío. Para lavar la muestra, agregue 0,75 mililitros de tampón de lavado a la columna y aplique vacío.

Luego, centrifugue la columna a 12 000 × g durante 60 segundos para eliminar el etanol residual. Coloque la columna en un tubo microcentrífugo limpio de 1,5 mL y, para eluir el ADN, agregue 30 µL de agua libre de nucleasas al centro de la membrana. Deje la columna en reposo durante un minuto y luego centrifúguela a 12 000 × g durante 60 segundos.

Luego, utilice un espectrofotómetro para medir la concentración de ADN. Para llevar a cabo la transcripción in vitro utilizando un kit de síntesis de ARN T7, prepare la mezcla maestra e incube la reacción en un termociclador a 37 grados Celsius durante tres horas. Añada 28 microlitros de agua libre de nucleasas y 2 microlitros de DNAasa I, e incube la reacción durante otros 15 minutos.

Para purificar el ARN, disuelva el polvo contenido en la columna giratoria proporcionada y 650 microlitros de tampón de microinyección libre de nucleasas. Eliminando cuidadosamente todas las burbujas de aire, tape el tubo e incube la solución a temperatura ambiente durante cinco a 15 minutos. Retire la tapa azul de la base y coloque la columna en un tubo de dos mililitros.

Luego, centrifugue el tubo a 750 veces G a temperatura ambiente durante dos minutos. A continuación, coloque la columna en un tubo nuevo de 1,5 mililitros y aplique 50 microlitros de la solución de ARN gota a gota en el centro, sin tocar la pared de la columna. Luego, centrifugue la columna a 750 veces G durante dos minutos.

Mida la concentración de ARN y evalúe la calidad del ARN según el protocolo descrito en el texto. Utilizando tampón de microinyección libre de nucleasas, diluya el ARNm del caso nueve a 50 nanogramos por microlitro y los ARNsg a 12,5 nanogramos por microlitro para experimentos de interrupción génica. Añada la plantilla donadora a una concentración de 200 nanogramos por microlitro, para edición del genoma basada en la reparación dirigida por homología, y manténgala en hielo.

Utilice la boquilla del aspirador para lavar los ovocitos con cuatro gotas frescas de aminoácidos de caseína. Luego transfiéralos a una gota final de medio casome ocho, recubierta con aceite mineral. Para realizar la inyección en el pronúcleo con el fin de integración aleatoria, bajo el microscopio estereoscópico, utilice la boquilla del aspirador para transferir aproximadamente 50 huevos a una gota de medio m2, recubierta con aceite mineral, que se usará como cámara de inyección.

Transfiera la cámara de inyección a un microscopio invertido e inyecte los óocitos fertilizados con unos pocos picolitros de la mezcla de inyección. El pronúcleo se hinchará si la inyección es exitosa. Realice la inyección citoplasmática para la edición génica, utilice un accesorio bucal para transferir aproximadamente 50 huevos a una gota de casoma A, que contiene cinco microgramos por mililitro de citocalasina B, e incube los huevos a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante cinco minutos.

Transfiera los óvulos a la cámara de inyección y, luego, a presión muy baja, inyecte unas pocas picolitros de la mezcla de inyección en el citoplasma. Utilice la presión de compensación del microinyector automatizado cuando sea posible. Después de la inyección, use la boquilla para transferir los ovocitos nuevamente a una gota de aminoácidos casoméicos.

Manténgalos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono hasta que se carguen para la reimplantación en el oviducto de las hembras pseudoembarazadas. Después de anestesiar un ratón hembra con tapón según el protocolo descrito en el texto, para realizar la reimplantación en condiciones estériles, exponga el tracto reproductivo realizando con un escalpelo una incisión de un centímetro de longitud paralela a la línea media dorsal. Luego, con tijeras, corte el músculo y use pinzas para sujetar la almohadilla de grasa.

Extraiga suavemente el ovario hasta que el oviducto y el útero adyacentes sean claramente visibles. Luego, utilice un clamp de vaso para fijar el páncreas adiposo. Bajo el microscopio estereoscópico, use un par de tijeras microquirúrgicas para hacer una incisión en la pared del oviducto, unos pocos milímetros aguas arriba de la ampolla.

Además, bajo el microscopio estereoscópico, cargue 25 huevos microinyectados en la capilaridad de vidrio conectada a la boquilla. Luego, inserte la capilaridad de vidrio en el oviducto y expulse los huevos hasta que una burbuja de aire sea visible dentro de la ampolla. Para asegurarse de que la reimplantación haya sido exitosa, debe verificar la presencia de la burbuja de aire en la ampolla, lo que garantiza que todos los huevos hayan sido expulsados en la ubicación correcta y que ninguno permanezca en la capilaridad de vidrio.

Retire suavemente la micropipeta de vidrio y coloque el tracto reproductivo de vuelta en el abdomen. Luego, utilice tres puntos de sutura quirúrgica no absorbibles para suturar la incisión y, a continuación, use grapas quirúrgicas para cerrar la piel. Coloque el ratón sobre una esterilla tibia para evitar la hipotermia e inyecte analgésicos por vía subcutánea.

Monitoree el ratón hasta que se recupere por completo. Finalmente, realice la tipificación genómica y la secuenciación de acuerdo con el protocolo descrito en el texto. Esta figura muestra geles analíticos que demuestran la calidad de la purificación del transgén y de la síntesis de sgRNA, lo cual es fundamental para generar con éxito ratones modificados genéticamente.

Se muestra aquí una lectura típica de una sesión de microinyección para integración aleatoria. El cebador de genotipificación debe ubicarse en el transgén y debe diseñarse para generar un fragmento de 200 a 800 pares de bases. En esta lectura para la edición génica, los cebadores se seleccionaron para hibridizarse con el ADN genómico fuera de la región que eventualmente es eliminada por los dos cebadores.

Esta estrategia permite la identificación directa de fundadores heterocigotos y homocigotos knock out. Como se ilustra aquí, cuando cada paso del protocolo está optimizado, el porcentaje de crías transgénicas debería alcanzar entre el 10 % y el 25 % para integración aleatoria, lo cual es algo bajo en comparación con la capacidad de los componentes CRISPR para editar el genoma del ratón. Al utilizar CRISPR para la edición génica, el número de fundadores es generalmente mayor, oscilando entre el 25 % y el 100 %; no es raro obtener una descendencia completa que sea homocigota con éxito cuando se edita mediante CRISPR.

Después de su desarrollo, esta técnica permite a los investigadores en campos como la neurociencia o el cáncer, por ejemplo, utilizar nuevos modelos de máscaras para descubrir mecanismos patológicos y eventualmente traducir esto en estrategias terapéuticas.