Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer

El objetivo general de este procedimiento es generar rápidamente ratones con deficiencia de genes con la ayuda de nucleasas de cola de diseño o garras. Esto se logra diseñando y ensamblando primero construcciones de ADN que codifican pares específicos de garras, que sirven como plantillas para la transcripción in vitro para generar ARNm de Talon. Los siguientes pasos del procedimiento son aislar los citos de ratón fertilizados y luego microinyectarles la T. El paso final es transferir quirúrgicamente los citos inyectados a las madres adoptivas pseudo embarazadas.

La progenie F cero resultante muestra con frecuencia deleciones específicas del sitio de secuencias genómicas que a menudo conducen a la pérdida de la función del gen diana. Aunque el método presentado aquí puede proporcionar información sobre la función de los genes en ratones, el enfoque básico también se puede adaptar a otros organismos modelo, como ratas y peces. Primero, acceda al sitio web del selector de nucleótidos efectores TAL en el sitio.

Elija el programa objetivo TN y pegue la secuencia del gen objetivo. Para este protocolo. Utilice las siete construcciones de expresión P-C-A-G-T y el kit de efectos Golden Gate Talen y T que están disponibles en ad gene.

Si se utilizan otras construcciones o kits de ensamblaje para Talen La configuración de ensamblaje puede ser diferente para la longitud óptima del espaciador y el número de RV de cola, elija la opción Miller Etal 2011 en la configuración Usar una arquitectura preestablecida. A continuación, seleccione NN en la pestaña Sustituto G. El programa genera un archivo de texto con los posibles sitios de destino generados a partir de esta lista.

Seleccione el par o los pares de Talen necesarios y proceda con el montaje del Golden Gate. Este protocolo funciona con las cepas de ratón de laboratorio más utilizadas, incluidas las hembras donantes C 57 BL six J y BDF one superovuladas a las cuatro semanas de edad mediante una inyección intraperitoneal de cinco unidades de gonadotropina sérica de yegua preñada. 48 horas más tarde dar a las hembras cinco unidades de gonadotropina coriónica humana también por inyección intraperitoneal inmediatamente después de la inyección de gonadotropina coriónica humana pareja, las hembras uno a uno con machos en edad reproductiva el mismo día, preparan a las madres adoptivas pseudo embarazadas. Otros.

A la mañana siguiente, sacrifique las hembras y recupere los ovocitos fertilizados mediante la disección de los ucts. A continuación, libere las nidadas de ovocitos en una placa de cultivo de órganos que contenga un mililitro de medio M dos. Retire todas las células del cúmulo agregando 10 microlitros de solución de hialuronidasa bovina al 0,1% a un plato que contenga nidadas de cites en medio M dos.

A continuación, utilice la pipeta bucal para lavar los embriones a través de dos o tres cambios de M dos medios para eliminar la hialuronidasa. Continuar el tratamiento con hialuronidasa para los embriones que aún no se han disociado de las células del cúmulo. Los embriones aislados se pueden almacenar en M 16, medio a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que se microinyectan.

Prepare 100 microlitros de solución inyectable que contengan 10 nanogramos por microlitro de cada cola. Nucleasa, ARNm, par y centrífuga durante 30 minutos a 30.000 g para pelletizar. Cualquier partícula que pueda obstruir las agujas de inyección.

A continuación, mantén la mezcla en hielo. Planea inyectar los ovocitos en su etapa pronuclear a primera hora de la tarde. Sumerja aproximadamente 100 embriones en un medio M dos bajo una capa de aceite mineral y trabaje en un microscopio invertido sin óptica DIC marsónica.

Con un aumento de 20x, seleccione citos con pronúcleos distintos. La clasificación de los ovocitos se puede realizar utilizando una carga capilar de inyección vacía, el capilar de inyección justo antes de usarlo con uno o dos microlitros de la solución inyectable. A continuación, conéctelo al cabezal de microinyección.

A continuación, aspire un cito seleccionado con un capilar de retención y realice una inyección superficial del ARNm de la nucleasa en el citoplasma. Evite el contacto con los pronúcleos. El volumen de inyección debe mantenerse bajo.

A la primera señal de distensión citoplasmática, retire la aguja. Normalmente, entre el 80 y el 90% de los embriones deberían sobrevivir sin necesidad de una estimulación inmediata. Para aumentar la cantidad de ARNm inyectado, haga que la solución sea más concentrada después de la microinyección de los citos disponibles.

Transfiéralos a medios M 16 con una pipeta bucal. Incubar los embriones durante una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Luego, transfiere a las que sobreviven a madres adoptivas pseudo embarazadas.

El día antes de la microinyección, induzca un pseudo embarazo en ratones hembra CD uno de tres a seis meses de edad apareándolos con machos sectorizados VA. A la mañana siguiente, seleccione hembras con un tapón atorial transparente para usarlas como receptoras de embriones. Las hembras no utilizadas volverán de su estado de pseudo embarazo en tres semanas y se pueden reutilizar después.

Coloque a una hembra madre adoptiva anestesiada sobre una superficie caliente en su abdomen. A continuación, desinfecte la zona de la incisión rociándola con etanol al 70%. Peine el cabello mojado lejos del sitio de la incisión planeado.

Ahora corta la cavidad peritoneal con unas tijeras y exterioriza el cuerno uterino. Para ello. Tire de la almohadilla de grasa unida al ovario e inmovilice los órganos reproductivos con una pinza de bulldog.

Además, asegúrese de mantener los órganos húmedos con una solución tibia de cloruro de sodio al 0,9%. En este punto, clasifique de 12 a 20 embriones viables y cárguelos en un capilar de vidrio delgado. Con la pipeta bucal, aspire primero una pequeña burbuja de aire, luego aspire los embriones con pinzas finas.

Sujete suavemente el UCT justo aguas arriba del amplificador y cree un pequeño agujero en la pared del UCT con una aguja de calibre 30. Inserte el capilar cargado en el orificio y sople suavemente los embriones en el amplificador hasta que vea que la burbuja de aire se ha desplazado del capilar. A continuación, retire el capilar.

Reemplace inmediatamente los órganos reproductores en la cavidad corporal y cierre la cavidad peritoneal con una sola sutura. A continuación, cierre la piel con una o dos pinzas de nueve milímetros. Regrese al animal a su jaula de origen y supervíselo hasta que desaparezca el efecto de la anestesia.

Luego, aloje a las hembras en grupos sociales estables de dos a tres ratones para minimizar el estrés durante los primeros tres días postoperatorios, asegúrese de proporcionar un analgésico como DEF Falcon en el agua potable para cada langosta en el genoma del ratón que sea objetivo con nucleasas de diseño. Un ensayo basado en PCR está diseñado para identificar a los animales fundadores que portan un alelo mutado deseado. En el primer ejemplo, los fundadores se originaron a partir de la microinyección de un par de nucleasas de cola.

Los objetivos de la región de recubrimiento del gen de la proteína priónica del ratón se analizaron mediante la digestión endonucleasa T seven de un producto de PCR. El ensayo de digestión de endonucleasas T seven se basa en la formación de heterodúplex entre hebras de ADN de productos de PCR generados a partir de alelos mutados y de tipo salvaje. La mutagénesis inducida por Talon dentro de la región genómica objetivo de los fundadores individuales se reveló mediante la aparición de productos de digestión larga emparejados de bases 250 y 110, además del producto de PCR de longitud completa.

Alternativamente, los productos de PCR pueden estar sujetos a una digestión de restricción si se encuentra un sitio de restricción de diagnóstico adecuado dentro de la región espaciadora del par de nucleasas de diseño. En el segundo ejemplo, ZFN se dirige a un sitio de restricción XPO one ubicado dentro de la introducción, uno de los locus Rosa 26 del ratón. En este caso, las bandas no digeridas indican la presencia de mutaciones.

Los asteriscos marcan, la ausencia de productos digeridos sugiere fuertemente un fundador portador de mutaciones en ambos alelos del gen objetivo. La clonación y secuenciación de estos productos de PCR no digeridos revela que los ratones fundadores pueden albergar dos o más modificaciones distintas del alelo objetivo. La ausencia de secuencias de tipo salvaje indica la ablación completa del gen diana.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión del diseño de la nucleasa de la cola, el ensamblaje de la cola, las construcciones de nucleasas y cómo usarlas para generar ratones mutantes por microinyección directa de óside. Este método se puede adaptar para trabajar con otras clases de nucleasas de diseño, como el zinc, los núcleos de dedo o el CAS nine crispr. También puede facilitar la modificación del genoma por recombinación homóloga a través de la inyección simultánea de la nucleasa y la plantilla de orientación génica adecuada.