Name: Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Aprende a generar ratones con deficiencias génicas mediante TALENs, diseñando constructos y microinyectando ovocitos fertilizados. Este método permite modificaciones genéticas precisas para estudiar funciones génicas en modelos animales.

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Nos gustaría dar las gracias a Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, y Ewa Skoczylas por su excelente asistencia técnica. Este estudio fue financiado por SNF Sinergia subvención CRSI33-125073 al PP.

<ol><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).</li>
<li>Johansson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+zoo+of+mice+for+genetic+analyses%3A+a+comprehensive+protocol+for+the+rapid+generation+of+BAC+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice.</a> Genesis. 48, 264-280 (2010).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li>
<li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li>
<li>Meyer, M., de Angelis, M. H., Wurst, W., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022-15026 (2010).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+integration+in+rat+and+mouse+embryos+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 29, 64-67 (2011).</li>
<li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li>
<li>Wefers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+production+of+mouse+disease+models+by+embryo+microinjection+of+TALENs+and+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct production of mouse disease models by embryo microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 3782-3787 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-Step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genetics. 11, 636-646 (2010).</li>
<li>ZFN, T. A. L. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li>
<li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs%3A+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 49-55 (2013).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39, (2011).</li>
<li>Reyon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH+assembly+of+TALENs+for+high-throughput+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 30, 460-465 (2012).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nat. Protoc. 7, 171-192 (2012).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+library+of+TAL+effector+nucleases+spanning+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.</a> Nat. Biotechnol. 31, 251-258 (2013).</li>
<li>Schmid-Burgk, J. L., Schmidt, T., Kaiser, V., Honing, K., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ligation-independent+cloning+technique+for+high-throughput+assembly+of+transcription+activator-like+effector+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes.</a> Nat. Biotechnol. 31, 76-81 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 31, 822-826 (2013).</li>
<li>Hermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+OPEN+zinc+finger+nucleases+for+direct+gene+targeting+of+the+ROSA26+locus+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Evaluation of OPEN zinc finger nucleases for direct gene targeting of the ROSA26 locus in mouse embryos.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Meyer, M., Ortiz, O., Hrabe de Angelis, M., Wurst, W., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+disease+mutations+by+gene+targeting+in+one-cell+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modeling disease mutations by gene targeting in one-cell mouse embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 9354-9359 (2012).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011).</li>
<li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li>
<li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+zinc-finger-nuclease+activity+with+improved+obligate+heterodimeric+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures.</a> Nat. Methods. 8, 74-79 (2011).</li>
<li>Wefers, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWefers%2C+B+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22">Current Protocols in Mouse Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Wefers, B., Wurst, W., Kühn, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWefers%2C+B+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22">Current Protocols in Mouse Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Haueter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+vasectomy-overexpression+of+Prm1-EGFP+fusion+protein+in+elongating+spermatids+causes+dominant+male+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic vasectomy-overexpression of Prm1-EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice.</a> Genesis. 48, 151-160 (2010).</li>
<li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Brown, M. T., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+to+the+ROSA26+locus+directed+by+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases.</a> Nucleic Acids Res. 40, 3741-3752 (2012).</li>
<li>Bultmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+transcriptional+activation+of+silent+oct4+pluripotency+gene+by+combining+designer+TALEs+and+inhibition+of+epigenetic+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5368-5377 (2012).</li>
<li>Valton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+TALE+DNA+binding+domain+sensitivity+to+cytosine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Overcoming TALE DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation.</a> J. Biol. Chem. 287, 38427-38432 (2012).</li>
<li>Cradick, T. J., Ambrosini, G., Iseli, C., Bucher, P., McCaffrey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN-Site+searches+genomes+for+zinc+finger+nuclease+target+sites+and+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">ZFN-Site searches genomes for zinc finger nuclease target sites and off-target sites.</a> BMC Bioinform. 12, (2011).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).</li>
<li>Byers, S. L., Payson, S. J., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+ten+inbred+mouse+strains+following+assisted+reproductive+technologies+%28ARTs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies (ARTs).</a> Theriogenology. 65, 1716-1726 (2006).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superovulation+strategies+for+6+commonly+used+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Animal+Sci%22%5BJournal%5D)">Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains.</a> J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 50, 471-478 (2011).</li>
<li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPease%2C+S+%22International+Society+for+Transgenic+Technologies.+Advanced+protocols+for+animal+transgenesis+%3A+an+ISTT+manual%22">International Society for Transgenic Technologies. Advanced protocols for animal transgenesis : an ISTT manual</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-Guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Genoma enfoques edición nucleasa impulsada diseño han ampliado considerablemente la gama de especies susceptibles de modificaciones específicas de sus respectivos genomas 10,12. En ratones, el gen de la orientación en células madre embrionarias ha sido una técnica estándar para más de dos décadas; sin embargo, ha demostrado ser difícil de adaptar a las células madre embrionarias de especies distintas de la del ratón, aunque ha habido algunos éxitos recientes en ratas células madre embrionarias. Incluso con la disponibilidad de &quot;off-the-shelf&quot; clones de células madre embrionarias de ratón con genes dirigidos proporcionadas por consorcios como EUCOMM, KOMP o NorCOMM 3 edición genoma por ZFN y TALEN proporciona mayor precisión y flexibilidad en cuanto al espectro de las modificaciones que pueden ser introducido en el genoma de ratón. Los animales fundadores que llevan mutaciones nucleasa mediada parecen ser altamente línea germinal competente 4-6,20,21, que no es siempre el caso para quimeras procedentes de inyecciones de blastocistos de células ES. Por lo tanto, en ciertos casos la microinyección de desnucleasas igner pueden dar lugar a significativamente más rápida generación de líneas novedosas de ratón con modificaciones del genoma específicas. La generación exitosa de ratones knockout por inyección de ZFN y TALEN depende en gran medida de la actividad de la nucleasa par inyectado. Talens han demostrado tener una alta tasa de éxito en la selección de una amplia gama de genes en un número de organismos; Sin embargo, estudios recientes sugieren que TALEN unión es sensible a la metilación de citosina 30,31. Por lo tanto, los pares de nucleasa recién generadas, por ejemplo Talens clonó en vectores de pCAG-T7, pueden ser transfectadas transitoriamente en una línea celular de ratón, tales como NIH-3T3 o Neuro -2a, que imitan el estado de la cromatina del embrión de ratón en cierta medida. Aquí, la actividad nucleasa puede estimarse utilizando el ensayo de T7 endonucleasa o un compendio de restricción de productos PCR como se describe en la sección 5 antes de la síntesis de ARNm y microinyección. Recomendamos secuenciación de la región genómica de interés en el respetoive línea celular y la cepa de ratón utilizada para experimentos de microinyección. En cigotos de ratón, diferentes pares TALEN o ZFN trabajarán de manera óptima a diferentes concentraciones de ARNm y por lo tanto la concentración de trabajo óptima del ARNm nucleasa microinyectados pueden tener que ser determinado experimentalmente. Dependiendo del par nucleasa, una concentración demasiado baja dará lugar a ninguna escisión, mientras que demasiado alto puede dar lugar a la letalidad embrionaria. Dependiendo del par nucleasa, hemos tenido éxito en el uso total de las concentraciones de ARNm tan bajas como 2 ng / l y tan alto como 200 mg / ul. Estos efectos son difíciles de predecir a partir de experimentos en cultivo de células y la concentración óptima de nucleasa tanto para la supervivencia del embrión y la velocidad de modificación del locus diana tiene que ser determinado empíricamente. ZFN de gran actividad o TALEN pueden escindir su secuencia objetivo más allá de la fase de una célula del embrión microinyectado y por lo tanto causar patrones complejos de una mutagénesisd mosaicismo en fundadores. Nosotros y otros 4 han observado tres o más alelos mutados distintos en un único fundador (Figura 5C). Por lo tanto, al establecer una nueva línea de ratón a partir de estos fundadores, la descendencia deben ser examinadas cuidadosamente mediante la secuenciación de la presencia de la mutación favorable ya que los ensayos de digestión proporcionan evidencia de que sólo una mutación sin definir está presente. Una de las críticas con frecuencia expresaron en contra de los sistemas de ZFN y TALEN es la posibilidad de que estas nucleasas también son capaces de escindir secuencias presentes en otro lugar en el genoma que son similares a los sitios diana. Tales fuera de objetivo efectos se han observado con reactivos de primera generación utilizando el dominio FokI homodimérica y construcciones heterodímero fueron diseñados para aliviar fuera de objetivo efectos 25. Sitios fuera de objetivo potencial se pueden predecir en cierta medida en silico 32,33 y se cribaron por PCR y secuenciación. Una ventaja obvia Of utilizando ZFNs y Talens para generar los ratones en lugar de líneas celulares es la posibilidad de eliminar de las mutaciones de destino no ligados a la modificación del genoma deseada mediante la realización de varios retrocruzamientos a una cepa de tipo salvaje de la elección. Para el análisis de un gran número de ratones fundadores, de próxima generación profunda secuenciación de los productos PCR generados a partir del locus nucleasa específica y en silico predichos desviado loci podría ofrecer una lectura cualitativa y cuantitativa alternativa a los ensayos de digestión de productos de PCR. Las técnicas de reproducción asistida que se describen en este protocolo se optimizan para las cepas de ratón estándar utilizados para experimentos de microinyección como C57Bl/6J o B6D2F1. Los ratones de diferentes orígenes, como las cepas no consanguínea, pueden, en principio, se utilizarán para las aproximaciones de edición del genoma y podrían proporcionar una base genética más adecuado para las preguntas de investigación específicas. El rendimiento de las técnicas de reproducción asistida como la superovulación puede ser predicadocted para un número de cepas de 34-36 pero podría requerir una mayor optimización para las cepas no estándar con el fin de obtener un número suficiente de embriones para microinyección nucleasa. Además ZFN y TALEN, nuevos nucleasas de diseñadores como el sistema CRISPR/Cas9 ARN guiada 9,37,38 ahora se han introducido para aplicaciones de edición de genoma. Todos los métodos para la microinyección y análisis de animales fundadores descritos aquí son también aplicables a CRISPR/Cas9 y futuras modos de edición genoma.

Los ratones son, con mucho, la plataforma más popular para la generación de modelos animales transgénicos. La caja de herramientas versátiles para la ingeniería genética del embrión de ratón 1-3 se ha extendido recientemente por los enfoques de edición del genoma basado en las nucleasas de diseñadores como nucleasas de dedos de zinc (ZFN) 4-6, nucleasas activador de transcripción efectoras (Talen) 7,8, y las repeticiones agrupadas interspaced regularmente cortas palindrómicas (CRISPR) / sistema CRISPR-asociado (CAS) 9 9. ZFN y función TALEN como pares de dos dominios de diseño personalizado a base de proteínas de unión al ADN (arrays de proteínas dedo de zinc y repetir variables di-residuos (RVDS), respectivamente) que están acoplados cada uno a la endonucleasa FokI 10-12. Por el contrario, la especificidad de la escisión de ADN mediada por Cas9 es proporcionado por transactivación de ARN de CRISPR (crRNA y tracrRNA, que también se pueden combinar en una sola molécula de ARN quimérico de ARN denominado guía) 11 que actúan en un complejo con laProteína CRISPR. Talens una secuencia definida de RVDS se puede construir rápidamente por experimentadores individuales con una multitud de estrategias de montaje para elegir 13-17. CRISPR/Cas9 promete aún menor generación de mano de obra de las nucleasas de diseño, sin embargo, la especificidad de la guía de ARN-ADN vinculante aún no se resuelve por completo 18,19. Generación de ZFNs personalizados hasta ahora se ha limitado a laboratorios académicos especializados y proveedores comerciales tales como Sangamo Biosciences y el servicio Sigma CompoZr. En general, el genoma edición con nucleasas de diseño tiene como objetivo la introducción de la línea se rompe dobles (OSD) en loci genómica definida, el cual posteriormente atraer fin homóloga (NHEJ) o recombinación homóloga (HR) los mecanismos de reparación del ADN 10,12. La reparación mediada por NHEJ de un OSD a menudo resulta en la introducción de inserciones y deleciones en estrecha proximidad al sitio de la reparación. Por lo tanto la reparación NHEJ cun ser explotados para la anulación de la función de un gen diana mediante la introducción de una mutación de cambio de marco en el genes de codificación de proteínas secuencia 4,7,9. Alternativamente, la adición o sustitución de la información genética definida se puede lograr proporcionando un donante de ADN junto con las nucleasas de diseño. Un donante de ADN comprende secuencias de ADN investigador-diseñado flanqueadas por regiones de homología con el locus diana, por lo que sirve como una plantilla para la reparación de DSB por HR. Ambos plásmidos 5,6,20 y oligonucleótidos monocatenarios 8,9,21 se han utilizado con éxito como donantes. Ni NHEJ-ni de edición genoma HR-mediada requieren la introducción de un marcador seleccionable en el genoma del embrión del ratón, lo que hace que estas estrategias particularmente bien adaptado para la creación de pequeñas alteraciones en la secuencia de nucleótidos sin afectar a la arquitectura genética general. En este protocolo se describen todos los procedimientos esenciales para su edición en el genomaembrión de ratón utilizando Talens. Estos incluyen: 1) la identificación de un sitio de destino TALEN 22, 2) la construcción de Talens por clonación golden gate 13, 3) la síntesis in vitro de mRNA TALEN, 4) la microinyección de ARNm TALEN en oocitos fertilizados de ratón, 5) los procedimientos quirúrgicos para la transferencia de embriones , y 6) análisis de mutagénesis inducida por TALEN en animales fundadores. Nos centramos en TALEN mRNA microinyección y la detección de los fundadores de inducidos NHEJ inserciones / supresiones. Con este fin hemos generado construcciones bifuncionales TALEN que permiten tanto la expresión en células de mamífero cuando se transfecta como plásmidos y en la síntesis in vitro de ARNm TALEN para la microinyección en embriones de ratón. Estos constructos comprenden una cadena principal CUENTO truncada 23 fusionado a heterodimérica FokI dominios de 24,25 para la edición genoma óptima en células de mamífero. Este protocolo también puede ser adoptado para la microinyección de otras nucleasas de diseño o para preparaciones inyectables combinados de nucleasas diseñadory construcciones de donantes (diseño de los donantes de ADN ha sido descrito en publicaciones técnicas excelentes por Wefers et al. 26,27). Declaración de Ética Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos de la Oficina Veterinaria Cantonal del Cantón de Zurich.

<table><tbody><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535S o L</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S o L</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma</td><td>S0692-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Epicentro de nucleasa seguro para plásmidos</td><td></td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Kit Midi de plásmido</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>NucAway Spin Columns</td><td>Invitrogen AM10070</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax Formaldyde Load Dye</td><td>Invitrogen</td><td>AM8552</td><td></td></tr><tr><td>RNA Millennium Markers</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE tampón</td><td>Thermo Scientific</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>T7 endonucleasa</td><td>NEB</td><td>M0302S o L</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T EasyVector System I</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>yegua embarazada&#039; s gonadotropina sérica (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td></td></tr><tr><td>gonadotropina coriónica humana (hCG)</td><td>Sigma</td><td>CG5</td><td></td></tr><tr><td>M2 medio de cultivo embrionario</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 medio de cultivo embrionario</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral, embrión probado</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>CentraVet</td><td>Ket 201</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46995</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment/Tools</td></tr><tr><td>Microscopio invertido con óptica Nomarski DIC (por ejemplo, Nikon Eclipse TE200)</td>Unidades de micromanipulador <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(por ejemplo, Narishige, NT88NF)</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embryo holding capillaries</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Capilares para inyección de embriones</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>Extractor capilar (por ejemplo, Sutter P97)</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge (por ejemplo, Narishige MF-900)</td>Tijeras para piel <td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Walton</td><td>FST</td><td>14077-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>FST</td><td>14041-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonda quirúrgica</td><td>FST</td><td>10140-03</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de pinzas para heridas Reflex (9 mm)</td><td>FST</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas para heridas Reflex (9 mm)</td><td>FST</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fina Dumont 5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinza curva Moria</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fina Moria</td><td>FST</td><td>11399-80</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de bulldog Dietrich</td><td>FST</td><td>18038-45</td><td></td></tr><tr><td>ratones C57BL/6J</td><td>Código de cepa de Jackson Labs</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>ratones CD-1</td><td>Código de cepa</td> <td>de Charles River</td> 000664 <td></td></tr></tbody></table>

del genoma del ratón ingeniería utilizando nucleasas designer

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Los ratones transgénicos que llevan modificaciones específicas del sitio del genoma (knockout, knock-in) son de vital importancia para la disección de los sistemas biológicos complejos, así como para la modelización de enfermedades humanas y probar estrategias terapéuticas. Los recientes avances en el uso de las nucleasas de diseño tales como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs), transcripción nucleasas efectoras del tipo activador (Talens) y los agrupados interspaced regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / sistema CRISPR-asociado (CAS) 9 para el sitio- la ingeniería del genoma específico abierta la posibilidad de realizar la modificación del genoma centrada y urgente en prácticamente cualquier especie de laboratorio sin la necesidad de depender de la tecnología de células madre embrionarias (ES). Un experimento de edición genoma normalmente comienza con la identificación de diseño de nucleasa sitios diana dentro de un gen de interés seguido por la construcción de los dominios de unión a ADN personalizadas para dirigir la actividad de nucleasa para el locus genómico investigador-definido. Plásmidos de nucleasa Designer son in vitro &lt;/ Em&gt; transcrita para generar ARNm para la microinyección de los ovocitos de ratón fertilizados. Aquí, ofrecemos un protocolo para el logro de modificación del genoma dirigida por inyección directa de TALEN mRNA en ovocitos de ratón fertilizados.

Hemos construido plásmidos de destino compatible con el conjunto de oro GateTALEN publicado por Cermak et al. 13 que permiten la expresión de talens en células de mamífero, así como in vitro la síntesis de ARNm a partir del promotor del fago T7 (Figura 1C). Estos plásmidos llevan dominios FokI heterodiméricas (mutaciones ELD o KKR) que han sido mostrados para reducir fuera de objetivo efectos relativos a homodímeros FokI y para mejorar la actividad de escisión en comparación con la primera generación FokI heterodímeros 25,29. Reacciones de montaje de puerta de oro # 1 y # 2 son por lo general muy eficiente y cada colonia blanco, cuando se analiza por PCR de colonias, muestra el patrón esperado para el número particular de RVDS clonados (Figuras 1B y 1D). Análisis en gel de ARNm sintetizado in vitro (Figura 2) debe revelar una sola banda distinguibles con poco o nada de frotis para cada muestra analizada. Debe haber un cambio de tamaño claramente entre muestras L1/R1 y L2/R2, L3/R3, lo que indica poliadenilación éxito. Los animales fundadores pueden ser examinados para alelos mutados inducidas-NHEJ utilizando PCR genotipo seguido de digestión con endonucleasas de T7 (Figura 3) o una digestión de restricción usando una enzima que escinde la secuencia de tipo salvaje dentro de la región espaciadora del par de nucleasa (Figura 4). El ensayo de T7 endonucleasa es aplicable a cualquier tipo de mutación, independientemente de la secuencia genómica específica dentro de la región espaciadora del par nucleasa inyectado; sin embargo, sólo detecta desajustes entre las hebras de ADN en los productos de PCR heterodúplex. Así, en el raro caso de que uno de los fundadores lleva dos alelos mutados de forma idéntica, los productos PCR se no mostrar ningún patrón de digestión T7. Tal distinción es, sin embargo, siempre es posible cuando un sitio de restricción específica se encuentra dentro de la región espaciadora nucleasa que se elimina por NHEJInducida inserciones / supresiones (Figura 5). Aquí, las bandas no digeridas indican la presencia de mutaciones, y la ausencia de cualquiera de los productos digeridos sugiere fuertemente un fundador llevar a mutaciones en ambos alelos del gen diana (marcadas con asteriscos en la Figura 4b). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1.jpg" width="600" /> Figura 1. Golden Gate clonación de Talen RVDS en vectores pCAG-T7-Destination heterodímeras. A) Asamblea de arrays RVD en vectores UFP. Aquí se muestra un ejemplo de un par TALEN con matrices CUENTO individuales que comprende 15 RVDS y 17 RVDS, respectivamente (para matrices CUENTO más de 21 RVDS, se requieren tres UFP-RVDS asambleas, no se muestra). Las flechas indican cebadores para pfus específica reacciones de PCR colonia. B) Los productos de PCRamplificado a partir de conjuntos de pfus correctas típicamente muestran una banda correspondiente a la longitud combinada de todos los RVDS clonados (por ejemplo, alrededor de 1,1 kb para RVDS 10) y una &quot;escalera&quot; de pequeñas bandas menos prominentes debido a la naturaleza repetitiva de matrices de RVD. C) El montaje final de arrays pfus-RVD y un plásmido que contiene la última repetición (PLR) en vectores de expresión heterodímeras Talen con FokIELD y FokIKKR variantes, respectivamente. La columna vertebral TALEN (anotado como N y C) se asemeja a la arquitectura publicado por Miller et al. 23 El CAG (CMV elemento potenciador temprano / pollo beta-actina) promotor asegura altos niveles de expresión en células de mamífero transfectadas, mientras que el promotor del fago T7 permite en la síntesis de ARNm in vitro (SacI utilizar para la linealización del vector de aguas abajo del codón STOP nucleasa). D) PCR de colonias usando cebadores indicados por las flechas en C) permite la identificación de ensamblado correctamente Talens. Full-lengtproductos h PCR suelen ser menos prominente, mientras que el &quot;efecto escalera&quot; representa un sólido indicador de reunión exitosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2.jpg" width="300" /> Figura 2. . Control de calidad de ARNm de nucleasa en la síntesis in vitro usando electroforesis en gel de agarosa ARNm ZFN se muestra como un ejemplo (L, izquierda ZFN, R, ZFN derecha). Muestras L1/R1 muestran ARNm antes de poliadenilación, muestras L2/R2 espectáculo polyadenylated mRNA y L3/R3 muestran mRNA poliadenilado purificado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img<html> alt = &quot;Figura 3&quot; fo: content-width = &quot;6 pulgadas&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figura 3. Ejemplo de un ensayo de T7 endonucleasa utilizado para la identificación de animales fundadores que llevan las mutaciones inducidas por nucleasa-de el locus diana. A) Un par TALEN fue diseñado para romper dentro de la región codificante del gen de la proteína del prión del ratón (Prnp, secuencia diana TALEN pueden ser disponibles bajo petición). Un producto de la PCR se genera usando un cebador directo (F) situado 110 pb aguas arriba y un cebador inverso (R) 250 pb aguas abajo del sitio de escisión TALEN. B) El producto de PCR posteriormente se somete a la formación de heterodúplex y T7 digestión con endonucleasas. C) mutagénesis inducida por TALEN dentro de la región genómica específica de los fundadores individuales se revela por la presencia de un producto de PCR de longitud completa con productos de digestión de 250 y 110 pb.50930/50930fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4.jpg" width="600" /> Figura 4. Ejemplo de un digesto de restricción de productos de PCR utilizados para la identificación de animales fundadores que llevan las mutaciones inducidas por nucleasa-de el locus diana. ZFN específicas para el locus de ratón Rosa26 29 diana un sitio de restricción XbaI en el intrón 1.) Fundadores A fueron seleccionadas por PCR genotipo utilizando un cebador directo (F) situado 500 pb aguas arriba y un cebador inverso (R) 250 pb aguas abajo del sitio de escisión. B) La digestión de los productos de PCR con XbaI revela patrones de digestión que indican ratones con mutaciones bi-alélicas (marcados con asteriscos), mono -alélicas mutaciones (bandas digeridos y no digeridos, por ejemplo, animales 2)y los ratones wt (digestión completa, por ejemplo, los animales 21.) C) La secuenciación de los ratones con posibles modificaciones bi-alélica muestra un máximo de 3 (24 animales) distintas inserciones / supresiones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nombre de la cartilla </td><td> Secuencia 5 &#39;a 3&#39; </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr><tr><td> TAL_Seq_5-1 </td><td> catcgcgcaatgcactgac </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Las secuencias de los primers utilizados para la PCR de colonias y secuenciación dentro del conjunto de la puerta de oro TALENprotocolo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Plásmido / Colección </td><td> Contribuyente </td><td> Addgene ID </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Golden Gate TALEN y TAL Efector Kit 2.0 </td><td> Laboratorio Voytas </td><td> 1000000024 </td><td> Contiene todos los plásmidos necesarios para el montaje de la puerta de oro TALEN </td></tr><tr><td> destino vectores pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD </td><td> Laboratorio Pelczar </td><td> 40131, 40132 </td><td> Add-on plásmidos para la expresión TALEN en células de mamíferos y en la síntesis de ARNm vitro </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Plásmidos y colecciones de plásmidos requeridos para el montaje de puerta de oro TALEN se pueden obtener de Addgene ( <a href="http://www.addgene.org">www.addgene.org</a> ). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> OnlineRecurso </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> http://tale-nt.cac.cornell.edu </td><td> Diseño de TALEN; TALEN predicción fuera del objetivo </td></tr><tr><td> http://zifit.partners.org/ZiFiT/ </td><td> Diseño de TALEN, OPEN ZFN, CoDA ZFN, CRISPR/Cas9 </td></tr><tr><td> http://www.genome-engineering.org </td><td> Diseño de TALEN, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 fuera del objetivo de predicción </td></tr><tr><td> http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html </td><td> Asamblea de TALEN secuencias para la confirmación de los resultados de secuenciación </td></tr><tr><td> http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html </td><td> Diseño de montaje modular ZFN </td></tr><tr><td> www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware </td><td> Diseño de montaje modular ZFN </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Recursos en línea para diseñar ZFN, TALEN y CRISPR/Cas9. </strong&gt;

Nucleasas de diseñadores como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y transcripción nucleasas efectoras del tipo activador (Talens) se pueden utilizar para modificar el genoma de preimplantación de embriones de ratones mediante la activación de ambos al final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR) itinerarios. Estos avances permiten la rápida generación de ratones con modificaciones genéticas precisas.

Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

El objetivo general de este procedimiento es generar rápidamente ratones con deficiencia de genes con la ayuda de nucleasas de cola de diseño o garras. Esto se logra diseñando y ensamblando primero construcciones de ADN que codifican pares específicos de garras, que sirven como plantillas para la transcripción in vitro para generar ARNm de Talon. Los siguientes pasos del procedimiento son aislar los citos de ratón fertilizados y luego microinyectarles la T. El paso final es transferir quirúrgicamente los citos inyectados a las madres adoptivas pseudo embarazadas.La progenie F cero resultante muestra con frecuencia deleciones específicas del sitio de secuencias genómicas que a menudo conducen a la pérdida de la función del gen diana. Aunque el método presentado aquí puede proporcionar información sobre la función de los genes en ratones, el enfoque básico también se puede adaptar a otros organismos modelo, como ratas y peces. Primero, acceda al sitio web del selector de nucleótidos efectores TAL en el sitio.Elija el programa objetivo TN y pegue la secuencia del gen objetivo. Para este protocolo. Utilice las siete construcciones de expresión P-C-A-G-T y el kit de efectos Golden Gate Talen y T que están disponibles en ad gene.Si se utilizan otras construcciones o kits de ensamblaje para Talen La configuración de ensamblaje puede ser diferente para la longitud óptima del espaciador y el número de RV de cola, elija la opción Miller Etal 2011 en la configuración Usar una arquitectura preestablecida. A continuación, seleccione NN en la pestaña Sustituto G. El programa genera un archivo de texto con los posibles sitios de destino generados a partir de esta lista.Seleccione el par o los pares de Talen necesarios y proceda con el montaje del Golden Gate. Este protocolo funciona con las cepas de ratón de laboratorio más utilizadas, incluidas las hembras donantes C 57 BL six J y BDF one superovuladas a las cuatro semanas de edad mediante una inyección intraperitoneal de cinco unidades de gonadotropina sérica de yegua preñada. 48 horas más tarde dar a las hembras cinco unidades de gonadotropina coriónica humana también por inyección intraperitoneal inmediatamente después de la inyección de gonadotropina coriónica humana pareja, las hembras uno a uno con machos en edad reproductiva el mismo día, preparan a las madres adoptivas pseudo embarazadas. Otros.A la mañana siguiente, sacrifique las hembras y recupere los ovocitos fertilizados mediante la disección de los ucts. A continuación, libere las nidadas de ovocitos en una placa de cultivo de órganos que contenga un mililitro de medio M dos. Retire todas las células del cúmulo agregando 10 microlitros de solución de hialuronidasa bovina al 0,1% a un plato que contenga nidadas de cites en medio M dos.A continuación, utilice la pipeta bucal para lavar los embriones a través de dos o tres cambios de M dos medios para eliminar la hialuronidasa. Continuar el tratamiento con hialuronidasa para los embriones que aún no se han disociado de las células del cúmulo. Los embriones aislados se pueden almacenar en M 16, medio a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que se microinyectan.Prepare 100 microlitros de solución inyectable que contengan 10 nanogramos por microlitro de cada cola. Nucleasa, ARNm, par y centrífuga durante 30 minutos a 30.000 g para pelletizar. Cualquier partícula que pueda obstruir las agujas de inyección.A continuación, mantén la mezcla en hielo. Planea inyectar los ovocitos en su etapa pronuclear a primera hora de la tarde. Sumerja aproximadamente 100 embriones en un medio M dos bajo una capa de aceite mineral y trabaje en un microscopio invertido sin óptica DIC marsónica.Con un aumento de 20x, seleccione citos con pronúcleos distintos. La clasificación de los ovocitos se puede realizar utilizando una carga capilar de inyección vacía, el capilar de inyección justo antes de usarlo con uno o dos microlitros de la solución inyectable. A continuación, conéctelo al cabezal de microinyección.A continuación, aspire un cito seleccionado con un capilar de retención y realice una inyección superficial del ARNm de la nucleasa en el citoplasma. Evite el contacto con los pronúcleos. El volumen de inyección debe mantenerse bajo.A la primera señal de distensión citoplasmática, retire la aguja. Normalmente, entre el 80 y el 90% de los embriones deberían sobrevivir sin necesidad de una estimulación inmediata. Para aumentar la cantidad de ARNm inyectado, haga que la solución sea más concentrada después de la microinyección de los citos disponibles.Transfiéralos a medios M 16 con una pipeta bucal. Incubar los embriones durante una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Luego, transfiere a las que sobreviven a madres adoptivas pseudo embarazadas.El día antes de la microinyección, induzca un pseudo embarazo en ratones hembra CD uno de tres a seis meses de edad apareándolos con machos sectorizados VA. A la mañana siguiente, seleccione hembras con un tapón atorial transparente para usarlas como receptoras de embriones. Las hembras no utilizadas volverán de su estado de pseudo embarazo en tres semanas y se pueden reutilizar después.Coloque a una hembra madre adoptiva anestesiada sobre una superficie caliente en su abdomen. A continuación, desinfecte la zona de la incisión rociándola con etanol al 70%. Peine el cabello mojado lejos del sitio de la incisión planeado.Ahora corta la cavidad peritoneal con unas tijeras y exterioriza el cuerno uterino. Para ello. Tire de la almohadilla de grasa unida al ovario e inmovilice los órganos reproductivos con una pinza de bulldog.Además, asegúrese de mantener los órganos húmedos con una solución tibia de cloruro de sodio al 0,9%. En este punto, clasifique de 12 a 20 embriones viables y cárguelos en un capilar de vidrio delgado. Con la pipeta bucal, aspire primero una pequeña burbuja de aire, luego aspire los embriones con pinzas finas.Sujete suavemente el UCT justo aguas arriba del amplificador y cree un pequeño agujero en la pared del UCT con una aguja de calibre 30. Inserte el capilar cargado en el orificio y sople suavemente los embriones en el amplificador hasta que vea que la burbuja de aire se ha desplazado del capilar. A continuación, retire el capilar.Reemplace inmediatamente los órganos reproductores en la cavidad corporal y cierre la cavidad peritoneal con una sola sutura. A continuación, cierre la piel con una o dos pinzas de nueve milímetros. Regrese al animal a su jaula de origen y supervíselo hasta que desaparezca el efecto de la anestesia.Luego, aloje a las hembras en grupos sociales estables de dos a tres ratones para minimizar el estrés durante los primeros tres días postoperatorios, asegúrese de proporcionar un analgésico como DEF Falcon en el agua potable para cada langosta en el genoma del ratón que sea objetivo con nucleasas de diseño. Un ensayo basado en PCR está diseñado para identificar a los animales fundadores que portan un alelo mutado deseado. En el primer ejemplo, los fundadores se originaron a partir de la microinyección de un par de nucleasas de cola.Los objetivos de la región de recubrimiento del gen de la proteína priónica del ratón se analizaron mediante la digestión endonucleasa T seven de un producto de PCR. El ensayo de digestión de endonucleasas T seven se basa en la formación de heterodúplex entre hebras de ADN de productos de PCR generados a partir de alelos mutados y de tipo salvaje. La mutagénesis inducida por Talon dentro de la región genómica objetivo de los fundadores individuales se reveló mediante la aparición de productos de digestión larga emparejados de bases 250 y 110, además del producto de PCR de longitud completa.Alternativamente, los productos de PCR pueden estar sujetos a una digestión de restricción si se encuentra un sitio de restricción de diagnóstico adecuado dentro de la región espaciadora del par de nucleasas de diseño. En el segundo ejemplo, ZFN se dirige a un sitio de restricción XPO one ubicado dentro de la introducción, uno de los locus Rosa 26 del ratón. En este caso, las bandas no digeridas indican la presencia de mutaciones.Los asteriscos marcan, la ausencia de productos digeridos sugiere fuertemente un fundador portador de mutaciones en ambos alelos del gen objetivo. La clonación y secuenciación de estos productos de PCR no digeridos revela que los ratones fundadores pueden albergar dos o más modificaciones distintas del alelo objetivo. La ausencia de secuencias de tipo salvaje indica la ablación completa del gen diana.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión del diseño de la nucleasa de la cola, el ensamblaje de la cola, las construcciones de nucleasas y cómo usarlas para generar ratones mutantes por microinyección directa de óside. Este método se puede adaptar para trabajar con otras clases de nucleasas de diseño, como el zinc, los núcleos de dedo o el CAS nine crispr. También puede facilitar la modificación del genoma por recombinación homóloga a través de la inyección simultánea de la nucleasa y la plantilla de orientación génica adecuada.

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Investigación

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Biología

El CompoZr personalizado nucleasa dedo de zinc (ZFN) Servicio permite la edición precisa en el genoma de cualquier organismo o línea celular en cualquier lugar definido por el usuario. En este artículo se describe el proceso para el diseño, fabricación, validación e implementación del Servicio de CompoZr ZFN personalizado.

Genoma Edición con CompoZr nucleasas de dedos de zinc personalizados (ZFNs)

CRISPR/Cas9 es un sistema robusto para producir disrupción de genes y elementos genéticos. En este trabajo describimos un protocolo para la creación eficiente de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR/Cas9.

Generación de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos a través de CRISPR / Cas9

La edición del genoma de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) se puede realizar de forma rápida y eficiente. Aquí se presenta un procedimiento experimental robusto para la ingeniería genética de hPSCs, como se ejemplifica mediante la edición del locus de puerto seguro AAVS1 para expresar EGFP e introducir resistencia a los antibióticos.

Establecimiento de editados-Genoma Humano pluripotentes Líneas de Células Madre: De Focalización de Aislamiento

La microinyección de ovocitos de ratón se utiliza comúnmente tanto para la transgénesis clásica ( es decir, la integración aleatoria de transgenes) como para la orientación de genes mediados por CRISPR. Este protocolo revisa los últimos avances en microinyección, con especial énfasis en el control de calidad y las estrategias de genotipificación.

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CRISPR-Cas es una tecnología de gran alcance para los complejos genomas de plantas y animales. Aquí detallamos un protocolo eficiente editar el genoma humano utilizando diferentes endonucleasas de Cas. Se destacan importantes consideraciones y parámetros de diseño para optimizar la eficiencia de la edición.

Edición del genoma en las líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR-Cas

Aquí, presentamos un método modificado para la criopreservación de embriones unicelulares, así como un protocolo que combina el uso de embriones de congelación descongelado y electroporación para la generación eficiente de ratones modificados genéticamente.

Uso de embriones congelados descongelados para la producción de alta eficiencia de ratones modificados genéticamente

El presente protocolo describe la microinyección de cigoto de CRISPR-Cas9 y ADN de donantes para producir eficientemente ratones knock-in y floxed de casetes de genes.

Microinyección de cigoto para la creación de alelos de genes de casete knock-in y flox en ratones

Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.

Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos

La eficiencia del método de edición mejorada del genoma mediante la administración de ácidos nucleicos oviductales (I-GONAD) es comparable a la microinyección tradicional, que requiere la recolección de cigotos de hembras donantes y la transferencia a hembras pseudoembarazadas. Este protocolo demuestra su eficacia mediante la introducción de mutaciones inducidas por CRISPR/Cas9 en el locus ROSA26 en el cromosoma 6.

Edición mejorada del genoma a través de la técnica de electroporación in vivo basada en la administración de ácidos nucleicos oviductales para la generación de ratones knockout

Métodos experimentales para la Ingeniería de Tejidos

Aprende a generar ratones con deficiencias génicas mediante TALENs, diseñando constructos y microinyectando ovocitos fertilizados. Este método permite modificaciones genéticas precisas para estudiar funciones génicas en modelos animales.

Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer

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