Patógenos de transmisión alimentaria proyección utilizando Magneto-fluorescente Nanosensor: Detección rápida de e. Coli O157: H7

El objetivo general del presente Protocolo es sintetizar funcional nanosensores para el portable, eficiente, y rápida detección de específicamente las bacterias patógenas a través de una combinación de relajación magnética y las modalidades de emisión de fluorescencia.

El objetivo principal de este protocolo es diseñar y sintetizar nanosensores duales capaces de detectar contaminantes bacterianos como E.coli O157:H7. Los nanosensores magnetofluorescentes se sintetizan funcionalizando nanopartículas de óxido de hierro mediante un procedimiento de dos pasos. En primer lugar, los anticuerpos dirigidos se conjugan con la superficie de la nanopartícula.

A continuación, se carga un tinte fluorescente en su codificación. El emparejamiento de estas modalidades permite una detección rápida y sensible de contaminantes bacterianos tanto en soluciones bajas como altamente concentradas. En presencia de una pequeña cantidad de bacterias, los nanosensores se agruparán alrededor de las bacterias debido a la orientación de los anticuerpos conjugados.

Este enjambre altera las interacciones del núcleo magnético de los nanosensores con los protones de agua circundantes, lo que permite la detección sensible de cambios en los valores de relajación magnética. A medida que aumenta la concentración de contaminantes bacterianos en las soluciones, disminuye el enjambre y se reduce la capacidad de la modalidad magnética para cuantificar la contaminación. Sin embargo, a medida que aumenta la concentración bacteriana, también lo hace la presentación fluorescente de los bionanosensores.

Es por esta razón que el emparejamiento de las modalidades magnética y fluorescente es importante. La combinación ha permitido la detección de tan solo una unidad formadora de colonias de E. coli O157:H7 en cuestión de minutos. El primer paso en la síntesis de nanosensores magnetofluorescentes es la preparación de una solución de sal de hierro compuesta por cloruro feroz y férrico.

El hierro proporcionará a los nanosensores un núcleo magnético que permite su adaptabilidad a plataformas de relajación magnética. Las soluciones adicionales necesarias son el ácido poliacrílico y el hidróxido de amonio. El ácido clorhídrico se introduce en la solución de sal de hierro, que luego se agrega a la solución de hidróxido de amonio mientras se agita en vórtice.

Finalmente, se agrega la solución de ácido poliacrílico y la mezcla resultante se vórtice durante una hora adicional mientras continúa la reacción. La solución resultante se centrifuga para precipitar las moléculas más grandes y aislar las nanopartículas de menos de 100 nanómetros de tamaño. A continuación, la solución se dializa durante la noche para su purificación.

El siguiente paso es la conjugación de anticuerpos dirigidos al código de ácido poliacrílico de las nanopartículas de ácido de hierro recién sintetizadas. Los materiales necesarios incluyen tampón MES, EDC, NHS y los anticuerpos seleccionados. El EDC se añade primero a la solución de nanopartículas, seguido del NHS y, por último, del anticuerpo.

A continuación, la mezcla se coloca en una batidora de mesa durante tres horas mientras continúa la reacción. La solución se purifica mediante una columna magnética. La columna magnetizada captura las nanopartículas, permitiendo que solo salgan los anticuerpos que flotan libremente.

A continuación, la columna se lava con tampón PBS y se recogen los nanosensores conjugados. A continuación, las nanopartículas están listas para la adición de colorante fluorescente, proporcionando la segunda modalidad clave utilizada para la detección. Una de las características más importantes de nuestro nanosensor es la combinación de las modalidades magnética y fluorescente, lo cual es importante por varias razones.

En primer lugar, la combinación de las modalidades permite que cada una de ellas coteje la otra, lo que reduce en gran medida el riesgo de falsos positivos y falsos negativos, que es uno de los mayores obstáculos a los que se enfrentan las diferentes plataformas de diagnóstico utilizadas en la actualidad. Y en segundo lugar, la combinación de las modalidades amplía enormemente el rango dentro del cual no solo podemos detectar sino también cuantificar la contaminación bacteriana. El paso final en la preparación de los nanosensores es la encapsulación del colorante fluorescente en la codificación de la nanopartícula.

Esto se logra simplemente agregando tinte a la solución mientras se agita el vórtice, y luego permitiendo más tiempo para que el tinte se difunda en la codificación del nanosensor. A continuación, los nanosensores totalmente funcionalizados se dializan por última vez para su purificación. Con el fin de caracterizar los nanosensores, el tamaño y la presentación de fluorescencia se registran utilizando un zetasizador y un lector de placas de fluorescencia.

Se añade una pequeña muestra del nanosensor a una solución de agua de cubeta y se coloca en el zetasizer para registrar el tamaño. Para el análisis de fluorescencia, se coloca una muestra del nanosensor en una placa de 96 pocillos y se inserta en el lector de placas de fluorescencia. Lo ideal es que los nanosensores tengan alrededor de 70 nanómetros de diámetro y una emisión fluorescente de 575 nanómetros.

Además de la síntesis de los nanosensores, es necesario el cultivo de bacterias para proporcionar los objetivos bacterianos en el laboratorio. Se utiliza una reserva de glicerol de bacterias para preparar un cultivo en caldo de nutrientes. A continuación, se deja incubar esta solución.

Después del período inicial de incubación, se realizan diluciones en serie para lograr una amplia gama de concentraciones bacterianas. Cien microlitros de cada concentración se colocan en una placa perforadora de nutrientes y luego se incuban durante 24 horas. Después de esta incubación, se cuentan las colonias en cada placa para determinar la unidad formadora de colonias, o recuento de UFC por mil de cada cepa diluida.

Ahora que se han preparado las soluciones madre bacterianas, se pueden utilizar junto con los nanosensores preparados. Y un aspecto importante de este serotipo particular de la bacteria que lo distingue de otros serotipos es que supongamos que si te infectas con los otros serotipos, necesitas tener muchas unidades formadoras de colonias para contraer una infección. Pero en este caso particular, E. coli de 10 a 100 UFC, o unidades formadoras de colonias, son lo suficientemente buenas como para provocar una infección.

Nuestra tecnología está establecida de tal manera que no se pierde ni una sola colonia de contaminación bacteriana allí. Con el fin de preparar las soluciones para la lectura en el relaxómetro magnético, primero se pipetean 300 microlitros de PBS en un tubo Eppendorf. A continuación, se añade una muestra de stock bacteriano, seguida de la adición de nanosensores.

A continuación, la solución se transfiere a un tubo de vidrio y se coloca un trozo de parafilm en la parte superior para evitar la evaporación. Luego, el tubo de vidrio se coloca dentro de un tubo de RMN más grande y se inserta en el relaxómetro magnético. Se utiliza una solución de referencia que no contiene bacterias y solo un nanosensor y PBS para obtener una lectura de T2 de referencia, como se muestra.

Luego, las soluciones que contienen varias concentraciones de bacterias se insertan en el relaxómetro magnético para su análisis, y los cambios en los valores de T2 son causados por la unión entre los nanosensores y las bacterias. Como se ha mostrado, la presencia de tan solo una UFC bacteriana se puede detectar en minutos utilizando esta modalidad. Sin embargo, a medida que aumenta la concentración bacteriana, la lectura de RM es menos cuantificable, por lo que el uso de datos de submisión fluorescente también equivale a una cuantificación bacteriana precisa.

Antes de que se puedan recopilar los datos de fluorescencia, primero se debe centrifugar la muestra. La solución se transfiere del tubo de vidrio a un tubo Eppendorf y luego se centrifuga. Esto separa las bacterias y los nanosensores unidos a ellas de los nanosensores que flotan libremente en solución.

El sobrenadante se desecha y la peleta bacteriana se resuspende en PBS. Finalmente, la muestra puede ser analizada mediante envío fluorescente. La fuerza de la emisión será relativa a la cantidad de nanosensores que quedan en solución y, por lo tanto, también a la cantidad de bacterias presentes.

Como se puede observar, la sumisión fluorescente se fortalece a medida que aumenta la concentración bacteriana y también se vuelve más sensible. Esta es la razón por la que el emparejamiento de las modalidades magnética y fluorescente permite la detección y cuantificación de la contaminación bacteriana tanto en las etapas tempranas como tardías del desarrollo. Además de la detección de bacterias en soluciones simples como PBS, estos nanosensores también poseen la capacidad de funcionar en medios más complejos, como el agua del lago o la leche.

Además, estos nanosensores han sido probados para determinar la especificidad en presencia de bacterias no objetivo y bacterias objetivo inactivadas por calor. Como se muestra, los nanosensores magnetofluorescentes tienen poca o ninguna reacción con bacterias no dirigidas o no vivas debido a la especificidad de los anticuerpos conjugados. Esto demuestra su eficacia para la detección de bacterias específicas en presencia de otras especies.

Por último, también es importante tener en cuenta que estos nanosensores pueden personalizarse fácilmente para la detección de otros patógenos. Se pueden sintetizar o formular estos nanosensores que hicimos en nuestro laboratorio en un mes más. Puedes hacerlo en un mes, y ese mes de producto te puede dar como 10 años de aplicación.