Name: Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende a combinar muestreo con cinta adhesiva y hibridación in situ por fluorescencia para detectar Salmonella en productos frescos. Este método rápido mejora la seguridad alimentaria mediante microscopía.

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La financiación de este trabajo fue proporcionado por un premio del Fondo de crecer Iowa Valores de BFBS.

1. Superficie de muestreo con cinta adhesiva estéril <ol><li> Seleccione una cinta a utilizar para el muestreo. Disponibles en el comercio Hongos-Tape o póngase en contacto-Es cintas de muestreo son estériles y envasadas especialmente para la facilidad de uso. Sin embargo, hemos encontrado que la transparencia (ópticamente transparente) cinta de la oficina de genéricos también se puede utilizar. </li><li> Use un marcador permanente para dibujar 1 cm 2 plazas en el lado no pegajosa de una pieza de 10 cm de cinta adhesiva (una plantilla de papel se puede utilizar). Esto servirá como una guía visual para destacar que parte de la cinta se ha utilizado para probar la superficie del alimento o del medio ambiente. </li><li> Formar una "C" en forma de lazo de cinta, con el lado adhesivo hacia la superficie a muestrear. Para ello, mantenga los extremos pegajosos con el pulgar y el dedo medio y la posición del dedo índice contra el cuadrado dibujado en la espalda (no pegajosa lado) de la cinta (Figura 1). </li><li> Coloque la cinta en la superficie para tomar muestras y presionar suavemente el área marcada sobre la superficie. Sin soltar los bordes de la cinta, utilice el dedo índice para asegurarse de que el lado pegajoso de la cinta llega en pleno contacto con la superficie de la muestra, evitando las burbujas. </li><li> El uso de un movimiento, incluso, lentamente tire de la cinta fuera de la muestra, de extraer físicamente unidas a la superficie, los microbios. Fije la cinta de células con carga, lado pegajoso hacia arriba, sobre un portaobjetos de vidrio con cinta transparente genérico de oficina. Asegúrese de que la tensión adecuada / estiramiento de la cinta para que un piso, no arrugada superficie se crea. Esto ayudará a minimizar los problemas con la deformación / curling de la cinta durante el calentamiento posterior durante la hibridación. </li></ol> 2. En fase sólida de enriquecimiento y Miniculture superficie del líquido <ol><li> En fase sólida de enriquecimiento se realiza mediante la colocación de la cinta boca abajo en la xilosa-lisina-Tergitol 4 (XLT-4) placas de agar, para que las células de la muestra se ponen en contacto directo con la superficie del agar. La plantilla parte / muestra el contacto de la cinta se coloca al ras con la superficie del agar y un extremo de la cinta está ligeramente adherida a la pared lateral de la placa de Petri para facilitar una fácil extracción de la cinta de la superficie del agar después del enriquecimiento. </li><li> Las placas son invertidas (para evitar la condensación) y se incubaron a 35 - 37 ° C para permitir el crecimiento suficiente de Salmonella spp. La duración del período de incubación necesario para enriquecer a las células a un nivel detectable dependerá de los niveles iniciales de contaminación por Salmonella. Hemos observado la formación de microcolonias excelente a partir de inóculos iniciales de baja después de las 8 h de enriquecimiento. </li><li> Tras el periodo de enriquecimiento deseado, abra la placa de agar. La cinta mantendrá su adherencia durante la incubación. Presione suavemente la cinta contra el agar usando el dedo índice para asegurar la recuperación máxima de microcolonias formado en la interfaz de cinta-agar. Sujete la cinta desde el borde pegado a la pared de la cápsula de Petri y retírela con un lento, incluso movimiento. Montar la cinta de células cargadas, el lado pegajoso arriba, sobre un portaobjetos como se describe en el punto 1.5. Proceder a la "fijación y deshidratación" un paso adelante. </li><li> Para miniculture superficie del líquido, comience por la fijación de la cinta utilizada para el muestreo sobre un portaobjetos como se describe en el punto 1.5. A continuación, cubrir la parte de plantilla / muestra el contacto de la cinta con una cámara de silicona no estéril de perfusión (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.), formando una cámara sellada, cuyo fondo está compuesto por células de la cinta cargada, mirando hacia arriba. Firmemente pero con cuidado de prensa de la cámara en su lugar para asegurar un sello hermético. </li><li> El uso de un gel flexible de carga punta de la pipeta, transferir ≤ 500 l de caldo de tripticasa de soja u otro medio de enriquecimiento necesario a través de uno de los puertos de entrada de la cámara pequeña. Sello de los dos puertos con cinta transparente para evitar que la oficina de diapositivas evaporación e incubar a 35 -37 ° C, según sea necesario para el enriquecimiento suficiente. A pesar de todas las operaciones deben realizarse de acuerdo a buenas prácticas de muestreo y la manipulación, la esterilidad del puerto cinta aislante o cámaras de perfusión no es necesario durante miniculture superficie del líquido. La combinación de FISH y citometría de flujo permitirá una clara discriminación de Salmonella spp. a partir de bacterias que no son objeto de que puedan estar presentes, con la mayor contribución de la flora no objetivo espera que provenga de la propia muestra. Proceder a la "fijación y deshidratación" un paso adelante. </li></ol> 3. La fijación y deshidratación <ol><li> Para el muestreo de superficie directa o para el enriquecimiento de la fase sólida de Salmonella spp. en XLT-4 agar, lleve a cabo en la cinta de fijación de células durante 30 min a 25 ° C, cubriendo el área de contacto de la muestra con 500 l 10% de formol tamponado neutro. </li><li> Deseche fijador en un recipiente hermético (bajo una campana de productos químicos para minimizar la exposición a irritantes / vapores tóxicos). </li><li> Deshidratar en una serie de etanol (50%, 80% y 95%, 300 l / min 3 cada concentración). Proceder a la "hibridación" un paso adelante. </li><li> Para la fijación de 500 l de muestra de líquido miniculture superficies, cámaras de perfusión son abiertos, flexibles y un gel de carga punta de la pipeta se utiliza para extraer la enrichate. Pipeteo rápido arriba y hacia abajo se utiliza para ayudar a asegurar la eliminación efectiva de los restantes obligados cinta de las células. </li><li> A continuación, todo el volumen de 500 l miniculture se transfiere a un tubo de microcentrífuga y centrifuga a 2.000 xg (5 min). Se desecha el sobrenadante, el pellet se agita vigorosamente durante 30 a 60 s, luego resuspendido en un volumen igual de 10% de formol tamponado neutro. Se fijan las células durante 30 min a 25 ° C. </li><li> Fijador A continuación, se retira y la muestra se resuspendió en tampón de celda de almacenamiento, de la siguiente manera. La muestra se centrifuga a 2.000 xg (5 min, 25 ° C) se desecha el sobrenadante, el pellet se agita vigorosamente durante 30 - 60 s, la volvieron a suspender en un volumen igual de 50%, no desnaturalizado, etanol 50% de fosfato solución salina tamponada. Las células fijadas se pueden almacenar por tiempo indefinido (año) a -20 ° C. Nota: Cuando se cambian los líquidos (por ejemplo, al introducir un buffer de fijador o diferentes), es importante para volver a suspender completamente (con agitación) el sedimento celular en una mínima parte (~ 10 a 20 l) del sistema de "salida" líquido . Esto ayudará a prevenir el agrupamiento y asegurar que las suspensiones de células individuales, incluso se obtienen. Proceder a la "hibridación" un paso adelante. </li></ol> 4. Hibridación <ol><li> Prepare la hibridación / tampón de lavado con el comercial grado biología molecular de soluciones indica en la Tabla de Materiales. Final de las concentraciones de componentes de amortiguación son 0,7 M NaCl, 0,1 M TRIS [pH 8.0], 10 mM EDTA, 0,1% dodecilsulfato de sodio, hasta alcanzar el volumen final deseado con molecular calidad del agua y se filtra con una jeringa de 0,22 micras o filtro de la taza. El mismo tampón, sin la adición de sondas (ver más abajo) se utiliza como un tampón de lavado. Precaliente la hibridación y tampones de lavado a 55 º C. </li><li> Añadir fluorescente marcada con Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5'-AAT CAC TTC CAC TAC GTG-3 ') y Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5'-GAC TCG ACT TTC TCC AGC-3' ) sondas de oligonucleótidos (Tabla de Materiales) de tampón de hibridación precalentada. La concentración total de la sonda de 5 ng l -1 se utiliza (por ejemplo, 2,5 ng l -1 de cada sonda, Bisha y Brehm-Stecher, 2009a). </li><li> Para las muestras de directo-a-cinta y sólida fase de enriquecimiento, cubrir el área de contacto de la muestra de plantilla de la cinta con 300 L de tampón de hibridación que contiene el cóctel de hibridación de la sonda y atado de cintas de las células en una cámara húmeda, la incubación sellada ajustado a 55 ° C. Si una incubadora de contacto directo, como el instrumento Foso de diapositivas (Tabla de Materiales) se utiliza, las muestras se hibridó durante 15 min y&gt; 20 diapositivas se pueden procesar de forma simultánea. Si un horno de hibridación giratorio al estilo, como el instrumento Bambino (Tabla de Materiales) se utiliza, las diapositivas se colocan en tubos de 50 ml de centrífuga de polipropileno para la hibridación, una diapositiva por tubo. Debido a la transferencia de calor no es directa, estas muestras se hibridó durante períodos más largos (hasta 30 min). </li><li> Tras la hibridación, las diapositivas se eliminan y la sonda que contienen superposición de tampón de hibridación se descarta. Portaobjetos se sea breve y suave enjuagarse con buffer de lavado precalentado pipeteando un pequeño volumen de tampón sobre un portaobjetos inclinado (3 enjuagues de 300 cada l), o el agua de manera formal (hasta 30 min), ya sea con una capa de tampón de lavado precalentado o inmersión en un tubo de polipropileno de centrífuga de 50 ml que contiene el buffer de lavado precalentado. En nuestra experiencia, a pesar de un lavado formales proporcionará los mejores resultados (menos neblina de la sonda no unido), un simple enjuague es adecuado para la detección inequívoca de Salmonella spp. A continuación, los portaobjetos se secaron al aire antes de pasar a la "detección" un paso adelante. </li><li> La hibridación de muestras de la superficie líquida miniculture se realiza girando por las muestras (recién fija o se mantiene en el buffer de almacenamiento a -20 ° C) durante 5 min a 2.000 xg seguido por agitación vigorosa de la pastilla y resuspensión en buffer de 100 l de hibridación precalentada que contiene el cóctel de la sonda. Las muestras se hibridó a 55 ° C durante 30 minutos en un bloque de calor o de otra estación de incubación adecuado (Tabla de Materiales), seguido por la adición de 500 l buffer de lavado precalentado. Al igual que con la cinta con destino las muestras, estas muestras pueden ser formalmente lavado de hasta 30 minutos con incubación a 55 ° C en el tampón de lavado, con agitación intermitente. Por otra parte, las muestras pueden ser completamente vortex después de la adición de 500 l buffer de lavado precalentado, seguido de la cosecha inmediata para el análisis (abajo). </li><li> En preparación para la detección de Salmonella spp. mediante citometría de flujo, líquido muestras miniculture superficie se centrifuga a 2.000 g durante 5 min, se desecha el sobrenadante y las muestras se resuspenden en 300 l temperatura ambiente (~ 25 ° C) PBS. Si las muestras requieren transporte a una instalación a distancia, o si el retraso se espera entre la hibridación y el análisis, las muestras se pueden refrigerar o mantenidos en hielo antes de analisis. Por otra parte, las muestras podrán ser transferidos a buffer de almacenamiento de células (una mezcla de 50:50 de la PBS y etanol absoluto) y se mantiene a -20 ° C hasta una semana sin pérdidas apreciables en la sonda confiere fluorescencia (Bisha y Brehm-Stecher, 2009b) . </li></ol> 5. Detección <ol><li> Para la detección en la cinta de Salmonella spp. a través de microscopía de fluorescencia, directo a cinta o sólidas muestras de enriquecimiento fase se superpone con aproximadamente 10 l Vectashield H-1200 montaje de soporte de la nuclear de contraste 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), montado con una hoja de cubierta, después se incuban en la oscuridad durante 10 min. </li><li> Aceite de inmersión se coloca en la hoja de la cubierta, y las muestras se analizan utilizando un objetivo de gran aumento (63x o 100x). El filtro de DAPI se utiliza para transportar la muestra en el foco, el microscopio se cambia entonces con el filtro correspondiente (verde o rojo, dependiendo del medio de contraste utilizado para las sondas de la etiqueta final) y las células de Salmonella se anotó visualmente de acuerdo con su fluorescencia (Figuras 2 y 3). </li><li> Para la detección por citometría de líquido muestras de la superficie miniculture, diversos instrumentos se pueden utilizar, dependiendo de la disponibilidad local. En nuestro laboratorio, PBS-suspendido muestras se transfieren a 5 ml de tubos redondos de muestreo inferior (BD Falcon) y se examinaron con un citómetro de flujo FACSCanto con excitación a 647 nm (Tabla de Materiales). Para las muestras enriquecidas que contienen un alto número de bacterias totales, la "baja tasa de flujo" de ajuste (10 min l -1) se utiliza y 5.000-50.000 eventos se recogen. Los datos se analizaron mediante FlowJo software (versión 8.8.6, Árbol Star, Inc., Ashland, Oregón) u otro software de análisis adecuado (Figura 4, los grupos A y B). </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. El uso de cinta adhesiva para el muestreo de Salmonella spp. de la superficie de un tomate contaminado artificialmente. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Los resultados típicos de muestreo directo a cinta y de detección de peces de Salmonella Typhimurium ATCC 14028 de la superficie de un tomate (100 objetivo de aceite X). Un cóctel de dos sondas de Texas Red marcado con sondas (Sal3/Salm-63) se utilizó para etiquetar estas células. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Microcolonias de Salmonella Typhimurium ATCC 14028 forman en la superficie de la xilosa lisina Tergitol-4 (XLT-4) agar después de 8 h en cinta de enriquecimiento a 37 ° C. El inóculo inicial se tomaron muestras de la superficie de un tomate contaminado artificialmente. En fase sólida de enriquecimiento aumenta el número de células disponibles para la detección y también mejora el contenido celular rRNA. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. El uso de cinta adhesiva para recoger muestras de S. enterica serovar Typhimurium en la superficie de un tomate contaminadas artificialmente, seguido por el análisis directo mediante FISH y citometría de flujo (panel A) o después de 5 h no selectivo de enriquecimiento líquido miniculture superficie en una cámara de perfusión llena con 500 l de caldo de soja tripticasa (panel B ).

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</ol>

Métodos sencillos y rápidos para la detección de patógenos en las superficies de los productos pueden ayudar a mitigar las enfermedades transmitidas por los alimentos, proporcionando información oportuna y procesable. Adhesivo a base de cinta de métodos de muestreo se han utilizado en el medio ambiente, clínica y microbiología de los alimentos desde la década de 1950 e implican apremiantes de &quot;Scotch&quot; al estilo de la cinta a la superficie para la eliminación de microorganismos, seguido por el examen microscópi...

<table><tbody><tr><td>Cinta de muestreo Fungi-Tape</td><td>Laboratorio de Dispositivos Científicos</td><td>745</td><td>http://www.scientificdevice.com/</td></tr><tr><td>cinta de muestreo Con-Tact-It</td><td>Birko Corporation, Denver, CO</td><td></td><td>http://www.birkocorp.com/</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva transparente para oficina, genérica</td><td>Varios</td><td></td><td>Debe ser ópticamente claro y tener baja fluorescencia intrínseca</td></tr><tr><td>Superficie de los alimentos</td><td>Tienda de comestibles local</td><td></td><td>Tomar&amp;#8211;s (tomate rojo&amp;#8211;en la vid, no enceradas ni aceitadas) utilizadas aquí</td></tr><tr><td>Caldo de soja tripticasa</td><td>Difco Laboratories</td><td>211768</td><td>Para el enriquecimiento de minicultivos en superficie líquida no selectivo</td></tr><tr><td>Base de agar Xilosa-lisina-Tergitol 4</td><td>Difco Laboratories</td><td>223420</td><td>Para &lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt;agar selectivo (XLT-4)</td></tr><tr><td>Suplemento de agar Xylose-lysine-Tergitol 4</td><td>Difco Laboratories</td><td>235310</td><td>Para&lt;em&gt; Salmonella&lt;/em&gt;agar selectivo (XLT-4)</td></tr><tr><td>Solución de formalina </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td>solución al 10 %, neutra, tamponada (fijador celular)</td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Grado de biología molecular (desecado previo a la hibridización)</td></tr><tr><td>tubos microcentrífugos de 1,5 ml</td><td>Varios</td><td></td><td>Libre de RNasas y DNasas</td></tr><tr><td>Láminas y cubreobjetos para microscopio</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solución de NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>Grado biología molecular, solución 5 M (componente del tampón de hibridación)</td></tr><tr><td>Solución tampón Tris-EDTA (concentrado 100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>1 M Tris [pH 8,0], 0,1 M EDTA (componente del tampón de hibridación)</td></tr><tr><td>Solución de dodecilsulfato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td>solución al 10 % en agua de 18 megohmios (componente del tampón de hibridación)</td></tr><tr><td>Sondas de oligonucleótidos Sal3 y Salm-63</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-etiquetado con 6-carboxifluoresceína (FAM) o Texas Red (para microscopía) o Cy5 (para citometría), purificado por HPLC</td></tr><tr><td>Microcentrífuga de velocidad variable</td><td>Varios</td><td></td><td>Utilice el diámetro del rotor para calcular las RPM necesarias para los valores de RCF descritos en el protocolo</td></tr><tr><td>Cámara de perfusión CoverWell </td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>PC1R-2.0</td><td>No estéril</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta para carga de geles (FS MultiFlex)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>05-408-151</td><td>Puntas largas y delgadas para un fácil acceso a orificios de muestreo pequeños y maniobrabilidad dentro de la cámara</td></tr><tr><td>Bloque calefactor de aluminio o estación de calentamiento de control preciso</td><td>Varios</td><td></td><td>Agitador con bloque seco calefactor y refrigerante Eppendorf Thermomixer R utilizado en este procedimiento</td></tr><tr><td>Horno de hibridación Bambino mini</td><td>Boekel Scientific</td><td>Modelo 230300</td><td>Los portaobjetos se colocan en tubos cónicos de polipropileno de 50 ml para la hibridización, con transferencia de calor indirecta</td></tr><tr><td>Hibridador de portaobjetos Slide Moat</td><td>Boekel Scientific</td><td>Modelo 240000</td><td>Proporciona transmisión rápida y directa del calor a través de la lámina de vidrio</td></tr><tr><td>Medio de montaje Vectashield H-1200 con 4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Minimiza el apagado de la fluorescencia durante la microscopía, proporciona tinción contraste con DAPI</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Varios</td><td></td><td>Leitz Laborlux S utilizado aquí</td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>Varios</td><td></td><td>Cámara Canon PowerShot A640 utilizada aquí</td></tr><tr><td>Software de adquisición de imágenes</td><td>Varios</td><td></td><td>Software Axiovision v. 4.6 (Carl Zeiss) utilizado</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>Para el procesamiento mínimo de imágenes (superposición de imágenes tomadas en diferentes canales)</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>Varios</td><td></td><td>Citómetro de flujo FACSCanto (BD Biosciences, San Jose, CA) con excitación roja (647 nm) utilizada</td></tr><tr><td>Software de análisis de citometría de flujo</td><td>Varios</td><td></td><td>Software FlowJo v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) utilizado</td></tr></tbody></table>

combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia in situ la hibridación para la detección rápida de salmonella en los productos frescos

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Este protocolo describe un método sencillo para que el adhesivo, la cinta basada en el muestreo de tomate y otras superficies de los productos frescos, seguido por fluorescencia en cinta de hibridación in situ (FISH) para un rápido cultura independiente de la detección de Salmonella spp. Cintas cargadas de células también puede ser colocado boca abajo en agar selectivo para la fase sólida de enriquecimiento antes de la detección. Por otra parte, bajo volumen de enriquecimiento líquido (miniculture superficie del líquido) se puede realizar en la superficie de la cinta en el no selectivo caldo, seguidos por el pescado y el análisis mediante citometría de flujo. Para comenzar, cinta adhesiva estéril se pone en contacto con productos frescos, se aplica presión leve, y de retirar la cinta, de extraer físicamente los microbios presentes en estas superficies. Las cintas están montadas pegajoso hacia arriba en portaobjetos de vidrio y las células de la muestra se fijan con formol al 10% (30 min) y deshidratados mediante una serie gradual de etanol (50, 80, y 95%, 3 min cada concentración). A continuación, las células cargadas las cintas se han manchado con un tampón que contiene un cóctel de ADN de Salmonella objetivo de la sonda y se hibridaron durante 15 - 30 min a 55 ° C, seguido de una breve aclaración en un tampón de lavado para eliminar la sonda no unido. Adherente, PESCADO marcado células se contrastados con el ADN tinte 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y los resultados se ven usando la microscopía de fluorescencia. Para la fase sólida de enriquecimiento, las células cargadas las cintas se colocan boca abajo sobre una superficie de agar selectivo adecuado y se incuban para permitir el crecimiento in situ de microcolonias Salmonella, seguidos por el pescado y la microscopia como se describió anteriormente. Para miniculture superficie del líquido, las células cargadas las cintas se colocan lado pegajoso hacia arriba y una cámara de perfusión de silicona se aplica para que la cinta y la forma del portaobjetos del microscopio la parte inferior de una cámara hermética en la que un pequeño volumen (≤ 500 l) de tripticasa de soja caldo (TSB) se introduce. Los puertos de entrada están cerrados y las cámaras se incuban a 35 - 37 ° C, permitiendo que el crecimiento basado en la amplificación de extraer la cinta-microbios. Después de la incubación, los puertos de entrada son sin sellar, las células se separan y se mezclan con la espalda vigorosa y pipeteo adelante, cosechadas por centrifugación y se fija en 10% neutros formalina tamponada. Finalmente, las muestras se hibridan y se examina a través de citometría de flujo para revelar la presencia de Salmonella spp. Como se describe aquí, nuestra &quot;cinta-FISH&quot; enfoque puede proporcionar un muestreo simple y rápida y la detección de Salmonella en las superficies de tomate. También hemos utilizado este enfoque para el muestreo de otros tipos de productos frescos, como la espinaca y chiles jalapeños.

Este protocolo describe un simple adhesivo cinta enfoque basado en el muestreo de tomate y otras superficies de los productos frescos, seguido por la rápida detección de células enteras de<em&gt; Salmonella</em&gt; Mediante fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; Hibridación (FISH).

Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

Este protocolo describe un enfoque sencillo para el muestreo mediante cinta adhesiva de superficies de tomates y otros productos frescos, seguido de fluorescencia sobre la cinta en...

El objetivo general de este procedimiento es acoplar el muestreo de productos frescos mediante cinta adhesiva con la detección molecular de células completas de especies de Salmonella utilizando hibridación rápida de fluorescencia en dos híbridos, también conocida como FISH. Esto se logra primero aplicando cinta adhesiva al material deseado y extrayendo las células unidas a la superficie. Las cintas con células adheridas pueden analizarse directamente o someterse a enriquecimientos en fase sólida o líquida.El segundo paso del procedimiento consiste en la fijación directa sobre cinta y deshidratación en una serie de etanol para células aludidas o enriquecidas en caldo. El segundo paso implica la fijación de las células en suspensión, seguida de la resuspensión de las células en tampón de almacenamiento. El tercer paso del procedimiento es realizar una hibridación rápida sobre cinta utilizando un cóctel de sondas de oligonucleótidos específicas para Salmonella, seguido de la eliminación del exceso de sonda mediante un lavado con tampón de enjuague; para muestras analizadas mediante fax, el paso de FISH se lleva a cabo en suspensión, y el exceso de sonda puede eliminarse mediante un simple paso de dilución antes del análisis.El paso final del procedimiento consiste en contratinjar las células unidas a la cinta hibridada con DPI y examinarlas mediante microscopía de fluorescencia. Para análisis basados en hechos, no se requiere una tinción de contraste. En última instancia, este método proporciona un medio para la detección visual o citométrica de especies de Salmonella que podrían estar presentes en productos frescos muestreados.La primera vez que tuve la idea para este método fue al leer sobre un grupo italiano que utilizaba un enfoque similar para examinar comunidades bacterianas en reliquias de piedra aerófila romana. Pero r e inicié una discusión sobre este trabajo en una clase que estaba impartiendo sobre métodos rápidos en microbiología de alimentos. Unas semanas después, comenzó un brote de salmonela asociado a productos frescos que finalmente enfermó a casi 1500 personas en 43 estados diferentes.Aunque nuestro enfoque experimental ofrece una vía oportuna y práctica para la detección de tipos bacterianos específicos en productos frescos, también es lo suficientemente portátil como para permitir pruebas en el campo o en un entorno de producción de alimentos. Comience seleccionando una cinta para usar en el muestreo. Algunas opciones incluyen la cinta para hongos disponible comercialmente o contactos que son estériles y además están envasados para facilitar su uso.Con un marcador permanente, dibuje cuadrados de un centímetro de lado sobre el lado no adhesivo de una tira de cinta adhesiva de 10 centímetros de longitud, utilizando una plantilla estéril de aluminio. Esto servirá como guía visual para indicar qué porción de la cinta se ha utilizado para tomar la muestra de la superficie alimentaria o ambiental, formando un lazo con forma de C con el lado adhesivo enfrentado hacia la superficie a muestrear. Para ello, sostenga los extremos adhesivos con el pulgar y el dedo medio, y coloque el dedo índice contra el cuadrado dibujado en la parte posterior de la cinta.Coloque la cinta sobre la superficie que se va a muestrear y presione suavemente el área marcada contra la superficie sin soltar los bordes de la cinta. Utilice el dedo índice para asegurar que el lado adhesivo de la cinta entre en contacto completo con la superficie de la muestra. Evite las burbujas utilizando un movimiento uniforme.Extraiga lentamente la cinta de la muestra. Para extraer físicamente los microbios unidos a la superficie, asegure la carga celular. Coloque la cinta con el lado adhesivo hacia arriba sobre un portaobjetos de vidrio. Utilizando una cinta transparente de oficina común, asegúrese de aplicar la tensión y estiramiento adecuados de la cinta para crear una superficie plana y sin arrugas.Esto ayudará a minimizar problemas de deformación o encogimiento de la cinta durante el calentamiento posterior. Durante la hibridación, coloque la cinta con la cara hacia abajo sobre placas de agarosa XLT4 (xylose slicing tertile four o XLT4) de modo que las células muestreadas estén en contacto directo con la superficie de agarosa para facilitar la eliminación sencilla de la cinta de la superficie de agarosa.Tras el enriquecimiento, la porción de la cinta con la muestra enriquecida se coloca al ras con la superficie del agar, y un extremo de la cinta se adhiere ligeramente. Los platos de Petri se invierten para evitar la condensación y se incuban a 35 grados Celsius. Para permitir un crecimiento suficiente de especies de Salmonella, la duración del período de incubación necesario para enriquecer las células hasta un nivel detectable dependerá de los niveles iniciales de contaminación por Salmonella.Después del periodo de enriquecimiento deseado, abra la placa de agar, la cinta conservará su adherencia durante la incubación. Presione suavemente la cinta contra el agar utilizando el dedo índice para asegurar la recuperación máxima de microcolonias formadas. En la interfase entre la cinta y el agar, tome la cinta desde el borde adherido a la pared de la placa de Petri y retírela con un movimiento lento y uniforme. Utilizando cinta adhesiva transparente común, monte la cinta cargada con células con el lado adhesivo hacia arriba sobre un portaobjetos de microscopio, de modo que se cree una superficie plana y sin arrugas.Realice la fijación celular en cinta durante 30 minutos a 25 grados Celsius cubriendo el área de contacto de la muestra con 500 microlitros de formalina tamponada neutra al 10 %. Deseche el fijador en un recipiente hermético bajo una campana química para minimizar la exposición a vapores irritantes o tóxicos. Lave la cinta una vez con solución salina tamponada con fosfato 1x o PBS, inundando suavemente la superficie de la cinta con PBS para deshidratar la muestra. Mediante una serie progresiva de etanol, prepare los tampones de prehibridación, hibridación y lavado utilizando soluciones comerciales de grado biología molecular, filtre mediante una jeringa de 0,22 micrómetros y caliente previamente los tampones de hibridación y lavado a 55 grados Celsius.Añada sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia al tampón de hibridación precalentado para obtener una concentración final de sonda de cinco nanogramos por microlitro. Cubra el área de contacto de la muestra en la cinta con 300 microlitros del tampón de hibridación que contiene la mezcla de sondas e incube las células adheridas a la cinta en una cámara de incubación sellada y húmeda ajustada a 55 grados Celsius; para un incubador de contacto directo, como el instrumento en modo portaobjetos, hibridice durante 15 minutos. Tras la hibridación, se retiran los portaobjetos y se descarta la capa de tampón de hibridación que contiene la sonda. Enjuague brevemente y con suavidad con tampón de lavado precalentado mediante pipeteo.Un pequeño volumen de tampón sobre una laminilla inclinada permite que las laminillas se sequen al aire para la detección de especies de *Salmonella* mediante microscopía de fluorescencia. Cubra la laminilla con aproximadamente 10 microlitros de Vector Shield H 1200, medio de montaje que contiene DAPI, el contraste nuclear, e incube en la oscuridad durante 10 minutos. Coloque aceite de inmersión sobre la cubierta, deslice y examine las muestras utilizando un objetivo de inmersión de alta magnificación.El filtro DPI se utiliza para enfocar la muestra. Luego, el microscopio se cambia al filtro adecuado, y las células de Salmonella se cuentan visualmente según su fluorescencia verde o roja, dependiendo del colorante utilizado para marcar las sondas. Para la detección por citometría, transfiera las muestras suspendidas en PBS a tubos de muestreo redondos de cinco mililitros y examine usando un citómetro de flujo con excitación a 647 nanómetros.Analice los datos utilizando el software FlowJo. El muestreo con cinta adhesiva de la serovariedad terica, Ty Murium, desde la superficie de un tomate artificialmente contaminado, facilita el análisis directo posterior a la muestra mediante microscopía o citometría de flujo de carga celular. Las cintas se procesaron para fluorescencia rápida en hibridación C dos, utilizando una combinación de sondas de ADN específicas para Salmonella marcadas con Texas Red, dependiendo de la concentración local inicial de células de Salmonella en la cinta.El enriquecimiento en fase sólida produjo resultados que variaron desde microcolonias aisladas hasta crecimiento confluyente. Las células obtenidas mediante cinta pudieron analizarse mediante citometría de flujo y FISH combinada, ya sea inmediatamente después del muestreo o tras un enriquecimiento líquido de cinco horas en superficie a 35 grados Celsius.Aunque hemos descrito el uso de la técnica de la cinta de pescado para la seguridad alimentaria, el método también tiene un buen potencial para su uso en otras disciplinas, incluyendo microbiología ambiental, patología vegetal o microbiología clínica. En paralelo con este procedimiento, se pueden realizar experimentos adicionales como pruebas bioquímicas o PCR en enriquecimientos de fase sólida o líquida a partir de muestras extraídas con cinta. Las pruebas pueden utilizarse para responder preguntas sobre una salmonella que pueda estar presente, preguntas que están fuera del alcance del procedimiento de pescado.

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Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

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