Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

El objetivo general de este procedimiento es acoplar el muestreo de productos frescos basado en cinta adhesiva con la detección molecular de células completas de especies de salmonela mediante fluorescencia rápida en la hibridación de C dos, también conocida como pez. Esto se logra aplicando primero cinta adhesiva al material deseado y extrayendo las celdas unidas a la superficie. Las cintas de carga de celdas pueden analizarse directamente o someterse a enriquecimientos en fase sólida o líquida.

El segundo paso del procedimiento es en cinta, la autofijación y la deshidratación en una serie de etanol para las células aludidas o enriquecidas en caldo. El segundo paso consiste en la fijación de células en suspensión, seguida de la suspensión Resus de las células en tampón de almacenamiento. El tercer paso del procedimiento es realizar un paso rápido de hibridación en cinta utilizando un cóctel de sonda de oligonucleótidos específico para salmonela, seguido de la eliminación del exceso de sonda con un enjuague con tampón de lavado para las muestras analizadas por fax, el paso de pescado se lleva a cabo en suspensión y el exceso de sonda puede eliminarse utilizando un paso de dilución simple antes del análisis.

El paso final del procedimiento es contrateñir las células hibridadas unidas a la cinta con DPI y examinarlas mediante microscopía de fluorescencia. Para los análisis basados en hechos, no es necesario un tinte contrario. En última instancia, este método proporciona un medio para la detección visual o citométrica de especies de salmonela que pueden estar presentes en los productos frescos muestreados.

La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando leí sobre un grupo italiano que utilizaba un enfoque similar para examinar las comunidades bacterianas en las reliquias romanas de piedra aerodinámica. Pero R y yo dirigimos una discusión sobre este trabajo en una clase que yo estaba enseñando sobre métodos rápidos en microbiología de alimentos. Unas semanas más tarde, un brote de salmonela rastreado a productos frescos comenzó a enfermar a casi 1500 personas en 43 estados diferentes.

Si bien nuestro enfoque experimental ofrece una vía oportuna y práctica para la detección de los tipos específicos de bacterias en los productos frescos, también es lo suficientemente portátil como para permitir pruebas en el campo o en un entorno de producción de alimentos. Comience seleccionando una cinta para usar como muestreo. Algunas opciones incluyen la cinta para hongos disponible en el mercado o contactada, que son estériles y también están empaquetadas para facilitar su uso.

Con un marcador permanente, dibuje cuadrados de un centímetro en el lado no enfermo de un trozo de cinta adhesiva de 10 centímetros con una plantilla de aluminio estéril. Esto servirá como una guía visual para anotar qué parte de la cinta se ha utilizado para tomar muestras de la superficie de los alimentos o del medio ambiente formando un bucle de cinta en forma de CS con el lado adhesivo orientado hacia la superficie que se va a muestrear. Para hacer esto, sostenga los extremos adhesivos con el pulgar y el dedo medio y coloque el dedo índice contra el cuadrado dibujado en la parte posterior de la cinta.

Coloque la cinta sobre la superficie que se va a muestrear y presione suavemente el área marcada contra la superficie sin soltar los bordes de la cinta. Utilice el dedo índice para asegurarse de que el lado adhesivo de la cinta entre en contacto completo con la superficie de la muestra. Evite las burbujas con un movimiento uniforme.

Retire lentamente la cinta de la muestra. La extracción física de microbios ligados a la superficie fija la carga celular. Tape con el lado adhesivo hacia arriba en un portaobjetos de microscopio de vidrio Con cinta de oficina transparente genérica, asegúrese de que la cinta tenga la tensión y el estiramiento adecuados para que se cree una superficie plana y no arrugada.

Esto ayudará a minimizar los problemas de deformación o curvatura de la cinta. Durante el calentamiento posterior. Durante la hibridación, coloque la cinta boca abajo sobre el tercil de corte de xilosa cuatro o las placas XLT cuatro agri de modo que las células muestreadas estén en contacto directo con la superficie agrícola para facilitar la extracción fácil de la cinta de la superficie agrícola.

Después del enriquecimiento, la parte de contacto de la cinta con la muestra moldeada se coloca al ras de la superficie agrícola y un extremo de la cinta se adhiere sin apretar. La pared lateral de las placas de la placa de Petri está invertida para evitar la condensación y se incuba a 35 grados centígrados. Para permitir un crecimiento suficiente de las especies de salmonela, la duración del período de incubación necesario para enriquecer las células a un nivel detectable dependerá de los niveles iniciales de contaminación por salmonela.

Después del período de enriquecimiento deseado, abra la placa de agar, la cinta conservará su pegajosidad durante la incubación. Presione suavemente la cinta contra el agar con el dedo índice para garantizar la máxima recuperación de las microcolonias formadas En la interfaz del agar cinta, agarre la cinta desde el borde unido a la pared de la placa de Petri y retírela con un movimiento lento y uniforme. Con cinta de oficina transparente genérica, monte la cinta de carga de celda con el lado adhesivo hacia arriba en un portaobjetos de microscopio para crear una superficie plana y no arrugada.

Realice la fijación de la celda de cinta durante 30 minutos a 25 grados centígrados cubriendo el área de contacto de la muestra con 500 microlitros de formina tamponada neutra al 10%. Deseche el fijador en un recipiente hermético debajo de una cubierta química para minimizar la exposición a vapores irritantes o tóxicos, lave la cinta una vez en una x solución salina tamponada con fosfato o PBS inundando suavemente la superficie de la cinta con PBS para deshidratar la muestra. Usando una serie de etanol progresivo, prepare la hibridación previa a la hibridación y los tampones de lavado utilizando el filtro comercial de soluciones de grado de biología molecular con una jeringa de punto de 22 micrómetros y precaliente los tampones de hibridación y lavado a 55 grados Celsius.

Agregue sondas de oligonucleótidos marcados con fluorescencia al tampón de hibridación precalentado para obtener una concentración final de la sonda de cinco nanogramos por microlitro, superponga el área de contacto de la muestra con plantilla de la cinta con 300 microlitros de tampón de hibridación que contiene el cóctel de sonda y las células unidas con cinta hibridada en una cámara de incubación sellada húmeda a 55 grados Celsius para una incubadora de contacto directo, como el instrumento de modo deslizante hibridado durante 15 minutos. Después de la hibridación, se retiran los portaobjetos y se descarta la sonda que contiene la superposición de tampón de hibridación. Enjuague breve y suavemente con tampón de lavado precalentado mediante pipeteo.

Un pequeño volumen de tampón sobre un portaobjetos inclinado permite que los portaobjetos se sequen al aire para la detección inmediata de especies de salmonela mediante microscopía de fluorescencia. Superponga el portaobjetos con unos 10 microlitros de escudo vectorial H 1200, medio de montaje que contenga ppp, la contramancha nuclear se incuba en la oscuridad durante 10 minutos. Coloque aceite de inmersión en la cubierta, deslice y examine las muestras con un objetivo de aceite de gran aumento.

El filtro DPI se utiliza para enfocar la muestra. A continuación, el microscopio se cambia al filtro adecuado y las células de salmonela se puntúan visualmente según su fluorescencia verde o roja, dependiendo del colorante que se utilice para marcar las sondas. La detección previa de cítricos transfiere muestras suspendidas de PBS a tubos de muestreo de fondo redondo de cinco mililitros y examina utilizando un citómetro de flujo con excitación a 647 nanómetros.

Analice los datos con el software FlowJo. El muestreo con cinta adhesiva de serovar terica, Ty Murium de la superficie de un tomate contaminado artificialmente, facilita el análisis directo posterior a los peces mediante microscopía o carga celular de citometría de flujo. Las cintas se procesaron para una rápida fluorescencia en la hibridación de C dos utilizando una combinación de sondas de ADN específicas de salmonela y se marcaron con Texas Red, dependiendo de la concentración local inicial de células de salmonela en la cinta.

El enriquecimiento en fase sólida arrojó resultados que van desde microcolonias aisladas hasta crecimiento confluente. Las células muestreadas con cinta podrían analizarse mediante citometría combinada de peces y flujo, ya sea inmediatamente después del muestreo o después de una superficie líquida de cinco horas. Mini enriquecimiento de la cultura a 35 grados centígrados.

Aunque hemos descrito el uso de la técnica del pez cinta para la inocuidad de los alimentos, el método también tiene un buen potencial para su uso en otras disciplinas, como la microbiología ambiental, la fitopatología o la microbiología clínica. Paralelamente a este procedimiento, se pueden realizar experimentos adicionales como pruebas bioquímicas o PCR en enriquecimientos en fase sólida o líquida a partir de muestras extraídas con cinta. Las pruebas se pueden utilizar para responder preguntas sobre una salmonela que puede estar presente, preguntas que están más allá del alcance del procedimiento con peces.