Preparación de hidroxi-Paam hidrogeles para desacoplar los efectos de mecanotransducción Cues

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar una estrategia sencilla y eficiente para inmovilizar cualquier proteína de interés en hidrogeles de poliacrilamida con el fin de controlar independientemente diversos parámetros del microentorno celular. Esto se logra primero extendiendo la solución proteica sobre la superficie del sello de PDMS. El segundo paso consiste en secar cuidadosamente la superficie estructurada del sello de PDMS con un flujo constante de gas nitrógeno de alta pureza.

A continuación, se coloca el sello recubierto de proteína con la superficie estructurada en contacto con la superficie del hidrogel seco, y se aplican brevemente puntos de presión sobre la parte superior del sello de PDMS para asegurar un buen contacto entre las microestructuras del sello y la superficie del hidrogel; el paso final consiste en retirar suavemente el sello de PDMS de la superficie del hidrogel y limpiar el sello tras la eliminación de las zonas no impresas. Con BSA, las células pueden adherirse a la superficie de hidrogel con microestructuras. En última instancia, se utiliza un microscopio de fluorescencia invertido para observar las microestructuras proteicas.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la transducción mecano, como la contribución relativa de las propiedades de la matriz extracelular, por ejemplo, rigidez, densidad de ligandos celulares o naturaleza de las proteínas. En el proceso de ano transacción, se recomienda realizar este procedimiento en una campana extractora química. Comience colocando cubreobjetos circulares de vidrio de 25 milímetros de diámetro en una placa de Petri y untando sobre ellos una solución de hidróxido de sodio 0,1 molar durante cinco minutos.

Retire la solución de hidróxido de sodio y sumerja completamente las laminillas en agua estéril DD H2O; agite suavemente durante 20 minutos en una placa agitadora. Drene el DDH2O estéril, añada más DDH2O estéril para sumergir completamente las laminillas y agite suavemente durante otros 20 minutos. Retire las laminillas con pinzas estériles y colóquelas en una nueva placa de Petri. Con el lado activado hacia arriba, seque las laminillas con un flujo constante de gas nitrógeno de alta pureza.

Una vez que las laminillas estén secas, llévelas de vuelta a la campana de cultivo estéril y extienda una capa fina de tres trimetil propil acrl sobre el lado activado de cada laminilla. Deje reposar durante una hora. Lave extensamente las laminillas de vidrio con agua destilada estéril (DD H2O).

Luego, sumerja las laminillas en agua estéril DD H2O en una placa de Petri nueva. Selle la placa de Petri con película de parafina y colóquela sobre una placa oscilante con agitación suave durante 10 minutos. Por último, utilice pinzas estériles de puntas finas para transferir las laminillas del DDH dos O a una placa de Petri nueva.

Con la cara activada hacia arriba. Cubra el recipiente con papel de aluminio para evitar que el polvo se adhiera a las laminillas y guárdelo a temperatura ambiente en un lugar seco. Para comenzar este procedimiento, prepare cinco mililitros de una solución estéril de hidrogel de hidroxi poliacrilamida y 100 microlitros de una solución fresca de persulfato de amonio al 10%.

Como se describe en el texto del protocolo, añada 2,5 microlitros de tetra metileno diamina y 25 microlitros de la solución de sulfato de amonio a la solución de hidrogel de hidroxi poli acrilamida. Para iniciar la polimerización, mezcle la solución mediante tres pipeteados sucesivos sin introducir burbujas, en condiciones estériles bajo una campana estéril, coloque una gota de 25 microlitros de la solución de hidrogel de hidroxi poli acrilamida sobre un cubreobjetos circular de 25 milímetros e inmediatamente coloque un cubreobjetos circular de vidrio de 22 milímetros encima de la gota para comprimir la solución de hidrogel de hidroxi poli acrilamida. El cubreobjetos de vidrio de 22 milímetros se activó previamente mediante una exposición de siete minutos en un limpiador de ozono UV.

Centre la laminilla de vidrio con pinzas estériles y alise cualquier burbuja. Deje polimerizar el hidrogel de hidroxipoliacrilamida a temperatura ambiente durante 15 minutos. Invierta manualmente la solución restante de hidrogel de hidroxipoliacrilamida en el tubo.

Para seguir la finalización del proceso de polimerización, sumerja completamente las laminillas en D DH estéril o. Separe cuidadosamente la laminilla de vidrio de 22 milímetros insertando el borde de una hoja de bisturí entre la laminilla de vidrio de 22 milímetros y la capa de hidrogel de hidroxi poliacrilamida. Lave el hidrogel de hidroxi poliacrilamida tres veces con PBS estéril y deje el gel completamente sumergido en PBS estéril para mantener la hidratación.

Los microtroqueles de poli(dimetilsiloxano) o PDMS utilizados en este procedimiento se fabricaron según se describe en el protocolo escrito. Coloque los microtroqueles de PDMS en una solución de etanol y agua al 50 a 50 y sométalos a sonicación durante 15 minutos. Seque los troqueles con un flujo de nitrógeno y colóquelos con el patrón hacia arriba en un limpiador de ozono UV durante siete minutos.

Bajo una campana estéril, coloque una gota de 150 microlitros de una solución proteica deseada sobre la superficie microestructurada de A-P-D-M-S. En esta demostración se utiliza el sello FI nin. Extienda la solución proteica sobre la superficie del sello moviéndola con la punta estéril de una pipeta hacia cada esquina del sello.

Deje que la solución de proteína absorba en el sello de PDMS durante 60 minutos. Bajo esta campana estéril, apague las lámparas para evitar daños en la proteína. A continuación, transfiera las cubreobjetos recubiertos con hidrogel de hidroxi poliacrilamida a una nueva placa de Petri.

Elimine el exceso de PBS de la superficie de los sustratos de hidrogel de hidroxipoliacrilamida con una corriente baja de nitrógeno en condiciones estériles. Detenga el procedimiento tan pronto como no se observe evidencia de agua acumulada en la superficie del gel.

El gel no debe secarse completamente en esta etapa. Seque cuidadosamente la superficie estructurada del sello de PDMS con un flujo constante de gas de nitrógeno de alta pureza. Sujete el sello recubierto de proteína con pinzas de gasa y coloque la superficie estructurada en contacto con la superficie de hidrogel seca.

Aplique puntos de presión breves con la punta de las pinzas en la parte superior del sello de PDMS para asegurar un buen contacto entre las microcaracterísticas del sello y la superficie del hidrogel. Deje el sello de PDMS sobre la superficie del hidrogel durante una hora a temperatura ambiente. Retire suavemente el sello de PDMS del hidrogel de hidroxi poli acrilamida utilizando pinzas para apósitos y limpie el sello agitándolo en una solución acuosa de etanol durante 15 minutos. Lave extensamente el hidrogel de hidroxi poli acrilamida estampado mediante tres cambios de PBS en condiciones estériles, durante 10 minutos por cada cambio.

Después del último lavado con PBS, agregue una solución estéril de BSA e incube durante la noche a cuatro grados Celsius bajo agitación suave en una placa oscilante. Esto atenuará las zonas no impresas al día siguiente. Lave extensamente el hidrogel de hidroxipoliacrilamida estampado mediante tres cambios de PBS en condiciones estériles, durante 10 minutos por cada cambio.

Los hidrogeles de hidroxipoliacrilamida estampados pueden almacenarse a cuatro grados Celsius durante hasta una semana. Los resultados muestran una correlación lineal entre la evolución de la rigidez de los hidrogeles de hidroxipoliacrilamida y la cantidad de entrecruzador de bisacrilamida. Imágenes epi-fluorescentes de microestructuras rectangulares laminadas depositadas sobre hidrogeles de hidroxipoliacrilamida con tres rigideces diferentes demuestran el ajuste independiente de la geometría de la micropatrón y la rigidez de la matriz. La densidad de ligandos celulares puede modularse variando la concentración de la solución proteica utilizada para incubar los sellos de PDMS.

Se muestran aquí dos imágenes fluorescentes procedentes de impresiones por microcontacto secuenciales. Franjas de fibronectina en rojo y laminina en verde, cruzadas a 90 grados, e impresión por microcontacto secuencial de laminina en fibrina y franjas de colágeno sobre un sustrato de hidrogel de hidroxipoliacrilamida de 25 kilopascales. Cuando se sembraron células primarias sobre superficies de hidrogel de hidroxipoliacrilamida recubiertas de manera homogénea y con microdiseños, la viabilidad celular fue de al menos el 80 % hasta tres días posteriores a la siembra.

También se observó que las células proliferan más en sustratos rígidos en comparación con sustratos blandos. Cuando se siembran en patrones microscópicos rectangulares recubiertos con fibronectina depositados sobre geles de hidroxipoliacrilamida hidrofílicos de tres rigideces diferentes, las células endoteliales primarias exhiben baja densidad de fibras de actina y un núcleo redondeado en el sustrato blando.

En sustratos más rígidos, las fibras de actina son más rectas y gruesas, y el núcleo se deforma tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la transducción mecánica exploraran el papel individual de los parámetros del microentorno celular en una amplia gama de sistemas celulares, como células primarias o células madre, tejidos, organismos modelo, sistemas orgánicos, aspectos demográficos o modelos tridimensionales.