Preparación de hidroxi-Paam hidrogeles para desacoplar los efectos de mecanotransducción Cues

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar una estrategia simple y eficiente para inmovilizar cualquier proteína de interés en hidrogeles de poliacrilamida con el fin de controlar de forma independiente varios parámetros del microambiente celular. Esto se logra extendiendo primero la solución de proteína a través de la superficie del sello PDMS. El segundo paso es secar cuidadosamente la superficie estructurada del sello PDMS con un flujo constante de gas nitrógeno de alta pureza.

A continuación, el sello recubierto de proteínas se coloca con una superficie estructurada en contacto con la superficie de hidrogel seca y se aplican breves puntos de presión en la parte superior del sello PDMS para garantizar un buen contacto entre las microcaracterísticas del sello y la superficie de hidrogel, el paso final es quitar suavemente el sello PDMS de la superficie del hidrogel y limpiar el sello después de la ción de las zonas no impresas. Con BSA, las células se pueden asentar en la superficie de hidrogel de micropatrón. En última instancia, se utiliza un microscopio de fluorescencia invertida para observar las características de las microproteínas .

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la transducción mecánica, como la contribución relativa de las propiedades de la matriz extracelular, por ejemplo, la rigidez, la densidad de ligones celulares o la naturaleza de las proteínas. En el proceso de transacción ano, se recomienda que este procedimiento se realice en una campana de gases químicos. Comience colocando cubreobjetos de vidrio circulares de 25 milímetros de diámetro en una placa de Petri y untando una solución de hidróxido de sodio 0,1 molar sobre ellos durante cinco minutos.

Retire la solución de hidróxido de sodio y sumerja completamente los cubreobjetos en DD H2O estéril, balancee suavemente durante 20 minutos en una placa mecedora, drene el DDH estéril dos O, agregue más DDH estéril dos O para sumergir completamente los cubreobjetos y balancee suavemente durante otros 20 minutos. Retire los cubreobjetos con pinzas estériles y colóquelos en una nueva placa de Petri. Con el lado activado hacia arriba, seco, la cubierta se desliza con un flujo constante de gas nitrógeno de alta pureza.

Una vez que los cubreobjetos estén secos, llévelos de nuevo a la funda de cultivo estéril y unte una capa delgada de tres trimetilpropilacrl en el lado activado de cada cubrebocas. Deslícese durante una hora después de una hora. Lave bien los cubreobjetos de vidrio con DD H2O estéril.

A continuación, sumerja los cubreobjetos en DD H2O estéril en una nueva placa de Petri. Selle la placa de Petri con una película para y colóquela en una placa mecedora bajo agitación suave durante 10 minutos. Por último, utilice pinzas estériles con puntas finas para transferir los cubreobjetos del DDH dos O a una nueva placa de Petri.

Con la activada boca arriba. Cubra el plato con papel de aluminio para evitar que el polvo se adhiera a los cubreobjetos y guárdelo a temperatura ambiente en un lugar seco. Para comenzar este procedimiento, prepare cinco mililitros de una solución estéril de hidrogel de hidroxipoliacrilamida y 100 microlitros de una solución fresca de amonio al 10% por sulfato.

Como se describe en el texto del protocolo, agregue 2,5 microlitros de tetrametileno diamina y 25 microlitros de amonio por solución de sulfato a la solución de hidrogel de hidroxipoliacrilamida. Para iniciar la polimerización, mezcle la solución mediante tres pipeteos sucesivos sin introducción de burbujas en condiciones estériles bajo una campana estéril, coloque una gota de 25 microlitros de la solución de hidrogel de hidroxipoliacrilamida en un cubreobjetos circular de 25 milímetros e inmediatamente coloque un cubreobjetos de vidrio circular de 22 milímetros encima de la gota para exprimir la solución de hidrogel de hidroxipoliacrilamida. El cubreobjetos de vidrio de 22 milímetros se activó previamente mediante una exposición de siete minutos en un limpiador de ozono UV.

Centre el cubreobjetos de vidrio con pinzas estériles y alise las burbujas. Deje que el hidrogel de hidroxipoliacrilamida polimerice a temperatura ambiente durante 15 minutos. Invierta manualmente la solución de hidrogel de hidroxipoliacrilamida restante en el tubo.

Para seguir la finalización del proceso de polimerización, sumerja completamente los cubreobjetos con D DH estéril dos o. Separe cuidadosamente el cubreobjetos de vidrio de 22 milímetros insertando el borde de una cuchilla de afeitar entre el cubreobjetos de vidrio de 22 milímetros y la capa de hidrogel de hidroxipoliacrilamida. Lave el hidrogel de hidroxipoliacrilamida tres veces con PBS estéril y deje el gel completamente sumergido en PBS estéril para mantener la hidratación.

Los microsellos de polidimetil soane o PDMS utilizados en este procedimiento se fabricaron como se describe en el protocolo de texto. Coloque los microsellos PDMS en una solución de agua de etanol de 50 a 50 y sonique durante 15 minutos. Seque los sellos con un vapor de flujo de nitrógeno y colóquelos en un limpiador de ozono UV durante siete minutos.

Bajo una campana estéril, coloque una gota de 150 microlitros de una solución proteica deseada sobre la superficie microestructurada de A-P-D-M-S. En esta demostración se utiliza el sello FI nin. Extienda la solución de proteínas por la superficie de la estampilla moviéndola con una punta de pipeta estéril hacia cada esquina de la estampa.

Deje que la solución de proteína se absorba en el sello PDMS durante 60 minutos. Debajo de esta campana estéril, apague las lámparas para evitar daños en las proteínas. A continuación, transfiera los cubreobjetos recubiertos de hidrogel de hidroxipoliacrilamida a una nueva placa de Petri.

Elimine el exceso de PBS de la superficie de los sustratos de hidrogel de poliacrilamida con la corriente de nitrógeno baja en condiciones estériles. Detenga el procedimiento. Tan pronto como no se observe evidencia de agua estancada en la superficie del gel.

El gel no debe secarse completamente en esta etapa. Seque cuidadosamente la superficie estructurada del sello PDMS con un flujo constante de gas nitrógeno de alta pureza. Sujete el sello recubierto de proteínas con pinzas de tejido de apósito y coloque una superficie estructurada en contacto con la superficie de hidrogel seco.

Aplique breves puntos de presión con la punta de las pinzas en la parte superior del sello PDMS para garantizar un buen contacto entre las microcaracterísticas del sello y la superficie del hidrogel, deje el sello PDMS en la superficie del hidrogel durante una hora a temperatura ambiente después de una hora. Retire suavemente el sello de PDMS del hidrogel de hidroxipoliacrilamida con pinzas de tejido de vendaje y limpie el sello fornicando en una solución de agua con etanol durante 15 minutos. Lave abundantemente el hidrogel de hidroxipoliacrilamida estampado mediante tres intercambios de PBS en condiciones estériles durante 10 minutos por intercambio.

Después del último lavado de PBS, agregue una solución estéril de BSA e incube durante la noche a cuatro grados centígrados bajo una agitación suave en una placa mecedora. Esto se comerá las zonas no impresas al día siguiente. Lave abundantemente el hidrogel de hidroxipoliacrilamida estampado mediante tres intercambios de PBS en condiciones estériles durante 10 minutos por intercambio.

Los hidrogeles de hidroxipoliacrilamida estampados pueden almacenarse a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana. Los resultados muestran una correlación lineal entre la evolución de la rigidez de los hidrogeles de poliacrilamida y la cantidad de reticulante de acrilamida bis, imágenes epifluorescentes de micropatrones rectangulares laminados depositados en hidrogeles de poliacrilamida de tres rigideces diferentes demuestran el ajuste independiente de la geometría del micropatrón y la rigidez de la matriz. La densidad del ligando celular se puede modular variando la concentración de la solución proteica utilizada para incubar los sellos de PDMS.

Aquí se muestran dos imágenes fluorescentes de impresiones secuenciales de micro contacto. Tiras de fibronectina en rojo y laminina en verde, cruzadas a 90 grados y rayas de laminina de fibrina y colágeno microimpresas secuencialmente sobre un sustrato de hidrogel de poliacrilamida de 25 kilos de pascales. Cuando las células primarias se sembraron en superficies de hidrogel de hidroxi acrilamida con recubrimiento homogéneo y micropatrón, la viabilidad celular fue de al menos el 80% hasta tres días después de la siembra.

También se observó que las células proliferan más en sustratos rígidos en comparación con sustratos blandos. Cuando se recubre con fibronectina rectangular, micro patrones depositados sobre hidrogeles de poliacrilamida de tres rigideces diferentes. Las células endoteliales primarias exhiben una baja densidad de fibras de actina y un núcleo redondeado en las blandas.

Los sustratos sobre sustratos más rígidos, las fibras de actina son más rectas y gruesas y el núcleo se deforma después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la transducción mecánica exploraran el papel individual de los parámetros de los microambientes celulares en una amplia gama de sistemas celulares, como células primarias o madre, a nivel de tejido, organismo modelo, moda, demografía o sistemas de órganos.