Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

El objetivo general de la fabricación de microcriogellos macroporosos elásticos en 3D mediante criogelación es facilitar la terapia regenerativa inyectable y el cribado de fármacos de alto rendimiento in vitro. Este video presenta los protocolos para fabricar microtejidos 3D versátiles y aplicarlos a la terapia regenerativa y la detección de medicamentos. La técnica de terapia regenerativa mejora la retención de células madre, la supervivencia y las funciones terapéuticas después de la inyección en el sitio de la herida.

El cribado de fármacos también se ha mejorado debido a la facilidad de uso y al potencial de cribado de alto rendimiento. Por lo general, las personas nuevas en la cultura 3D tienen dificultades debido a los complicados protocolos. Esta técnica simplifica el cultivo 3D y ofrece a los investigadores un mayor control de los microtejidos 3D resultantes.

En la demostración de estos procedimientos asistirán Zhou Lyu, Liu Wei, Li Yaquian y You Zhifeng, cuatro estudiantes graduados de nuestro laboratorio. Lave los chips de la matriz de microplantillas de PMMA con agua desionizada para eliminar los residuos que quedan del grabado láser. A continuación, seque los chips de la matriz de microplantillas a 60 grados centígrados.

A continuación, trate las patatas fritas secas en un limpiador de plasma en grupos de cuatro. En primer lugar, haga funcionar la bomba de vacío durante dos minutos. A continuación, utilice 18 vatios de potencia de RF durante tres minutos para aumentar la hidrofilicidad de los chips.

Ahora, haga un mililitro de solución precursora de gelatina por cada cinco papas fritas. Disuelve la gelatina en un baño de agua a 60 grados centígrados e incuba la solución en hielo durante cinco minutos. Una vez que se haya enfriado un poco pero aún esté líquido, mezcle bien el glutaraldehído en la solución precursora de gelatina hasta una concentración final de 0,3% de glutaraldehído.

Ahora, pipetee 200 microlitros de solución preparada en la superficie superior de cada chip. Distribuya la solución uniformemente sobre las virutas usando una varilla de vidrio doblada. A continuación, transfiera inmediatamente los chips de matriz cargados con solución a un congelador de menos 20 grados Celsius durante 16 horas para la criogelación.

Al día siguiente, enfríe un liofilizador a menos 40 grados centígrados durante unos 30 minutos. A continuación, cargue los chips de matriz y liofícelos durante dos horas al vacío. El hielo se sublimará en estas condiciones, y las virutas estarán listas para su uso.

Comience cosechando microcriogénicos individuales de los chips. Comience superponiendo el chip de matriz de microcriogénico fabricado sobre la matriz de pines eyectores PDMS fabricada. Alinee cada microcryogel con un pin eyector.

A continuación, presione el chip de la matriz de microcriogénicos en la matriz para desplazar los microcriogeles de sus pocillos. Ahora, recoja los microcriogénicos expulsados en un baño de agua y recójalos con la ayuda de un colador de células. Use un colador para recolectar todos los microcriogeles de un chip.

A continuación, lave los microcriogeles con borohidruro de sodio con hielo. Deje que los residuos de aldehído no reticulado se enfríen durante unos 20 minutos. Luego, desecha el borohidruro de sodio y lava los microcriogeles con cinco mililitros de agua desionizada durante 15 minutos.

Realice un total de tres a cinco lavados con agua antes de continuar. Después de quitar los microcriogeles del último lavado con agua, use pinzas para transferirlos del filtro de células a una placa de Petri de 35 milímetros. Cada colección de microcriogeles constituye un grupo.

Ahora, agregue de 50 a 70 microlitros de agua desionizada a cada grupo de microcriogeles y cubra el plato. A continuación, golpee suavemente el plato para nivelar los microcriogeles apilados. Luego, congele los microcriogeles a menos 20 grados Celsius durante cuatro a 16 horas.

Posteriormente, liofilizarlos durante dos horas como antes. El siguiente paso es hacer los microtejidos en 3D. Primero, esteriliza los microcriogeles.

Luego, cosecha las células con tripsina, cuantifica su densidad y vuelve a suspenderlas a ocho millones de células por mililitro en medio de crecimiento. A continuación, pipetee 60 microlitros de suspensión celular en cada grupo de microcriogeles. Mantenga los platos en una cámara humidificada e incube a 37 grados centígrados durante dos horas para que las células se absorban en los geles.

Después de la incubación, agregue dos mililitros de medio de cultivo a cada plato y continúe el cultivo, cambiando el medio cada dos días. En dos días, se habrán formado microtejidos en 3D. Para inyectar los microtejidos 3D en un ratón, primero transfiéralos a una pipeta de cinco mililitros y luego cárguelos en un colador de células para filtrar el medio de cultivo.

A continuación, vuelva a suspender los microtejidos 3D en una solución de gelatina al 15%. Después de preparar al animal para la implantación, inyecte por vía intramuscular los microtejidos en tres lugares del músculo gracilis. Cada inyección debe contener 150 microcriogeles en 150 microlitros de solución.

Use una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 23. Después de ensamblar la matriz de microcriogue para el cultivo celular en chip, colóquela con cuidado en una cámara de humedad precalentada sin mojarla. A continuación, alícuota cuidadosamente tres microlitros de suspensión celular bien mezclada directamente sobre cada pocillo de microcriogel.

Deje que la punta de la pipeta toque ligeramente la superficie del microcryogel antes de expulsar la solución. No siembre los pozos periféricos. Después de cargar los pocillos, agregue 10 microlitros de medio selectivo a cada pocillo y agregue medio a los pocillos periféricos para ralentizar la evaporación usando un dispensador de líquido de 96 canales.

A continuación, cultive los chips en la cámara de humedad durante 24 horas para formar microtejidos 3D. Al día siguiente, utilizando el dispensador de líquido de 96 canales, agregue 10 microlitros de medicamentos a cada pocillo en un gradiente de concentración cuatro veces para completar la adición de los 384 pocillos, incluidos los controles de DMSO. Luego, continúe el cultivo durante 24 horas.

Después de 24 horas de tratamiento farmacológico, agregue cuatro microlitros de solución madre de resazurina a cada pocillo e incube la placa durante dos horas, permitiendo que las células metabolicen la resazurina. Para analizar el metabolismo de la resazurina en las células, utilice un lector de placas. Los microcriogeles de gelatina recolectados tenían formas y tamaños predefinidos.

El análisis mediante SEM mostró que los microcriogeles contenían estructuras macroporosas interconectadas con tamaños de poro en el rango de 30 a 80 micras. La inyectabilidad de los microcriogeles de gelatina se evaluó cuantitativamente mediante su cultivo después de la inyección. Se inyectaron 1.000 por mililitro a seis newtons menos que la fuerza clínicamente aceptable de 10 newtons.

Las células madre de los microcriogeles conservaron una alta viabilidad y una gran capacidad proliferativa tras la inyección durante cinco días de cultivo. Utilizando estas células, se trató terapéuticamente el modelo de isquemia de la extremidad del ratón y se examinó el estado fisiológico de las extremidades isquémicas 28 días después de la cirugía. El tratamiento con microtejidos con 100.000 células madre mejoró el salvamento de las extremidades.

Solo el 25% de los ratones mostraron amputación espontánea de un dedo del pie después de 28 días. En una aplicación diferente, se utilizó la matriz de microtejidos 3D para pruebas de fármacos de alto rendimiento. Las células de carcinoma hepatocelular se trataron con doxorrubicina y las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas se trataron con IMMLG-8439.

En ambos casos, la resistencia a los medicamentos se incrementó mediante el cultivo en 3D. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar microcriogeles microporosos elásticos en 3D para el cultivo 3D fuera del chip utilizando terapia regenerativa inyectable o matrices de cultivo celular 3D en el chip para el cribado de fármacos in vitro de alto rendimiento. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia regenerativa basada en células y el cribado de fármacos, hicieran uso del cultivo celular en 3D, avanzando así en ambos campos de investigación.

No olvide que trabajar con glutaraldehído y borohidruro de sodio puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar prendas protectoras adecuadas y trabajar bajo una capucha de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.