Un método de análisis celular para el cóndilo Mandibular murino y morfométricos

El objetivo general de este experimento es observar los efectos de la carga compresiva en el cartílago condilar mandibular de ratones utilizando medidas morfométricas en radiografías y análisis histológicos. Estas métricas pueden ayudar a responder preguntas clave sobre los cambios estructurales y celulares dentro del cóndilo de la mandíbula de los roedores. La principal ventaja de la técnica que se muestra aquí es que podrían utilizarse para analizar otros animales nacidos o participantes de pequeño tamaño.

Para este protocolo, tenga mandíbulas de ratón aisladas y disecadas listas para su uso. En una placa de Petri, transfiera las mandíbulas a un sistema de gabinete de rayos X. Luego, tome radiografías a 26 kilovoltios durante cinco segundos.

Ahora, abra las imágenes en el software de análisis para realizar mediciones morfométricas. Primero, use el botón de la unidad para configurar la barra de escala. A continuación, seleccione seis puntos anatómicos con el estilo de marcador 2.

En primer lugar, seleccione los puntos más posteriores del cóndilo mandibular como punto uno. A continuación, seleccione el proceso incisivo para el punto dos. A continuación, seleccione el punto más profundo en la muesca sigmoidea para el punto tres.

A continuación, seleccione el punto más profundo de la concavidad de la rama mandibular, el punto cuatro y luego, seleccione el punto más anterior de la superficie articular condilar, el punto cinco. Ahora, seleccione el punto más posterior de la superficie articular condilar como punto seis y proceda a tomar medidas de longitud con la herramienta de longitud. A continuación, usa la herramienta de línea perpendicular desde los puntos tres a cuatro para medir la longitud de la cabeza del cóndilo, que es la longitud de la perpendicular, desde el punto uno hasta la línea entre los puntos tres y cuatro.

Luego, mide la longitud mandibular, entre los puntos uno y dos. Por último, mida el ancho de la cabeza del cóndilo, que está entre los puntos cinco y seis. Para guardar los datos, copie la lista de medidas en el lado derecho de la pantalla.

Antes de incrustar las mandíbulas fijas, pero no descalcificadas, sumérjalas durante la noche en sacarosa al 30 por ciento en PBS. Al día siguiente, disecciona el exceso de tejido blando y corta cuidadosamente el cóndilo mandibular. Ahora, coloque las muestras en moldes de plástico, con la superficie medial del cóndilo contra la base del molde y la muestra paralela al fondo del molde.

Luego, sumérgelos en resina de incrustación y enfría la resina con un trozo de hielo seco. A continuación, rellena los moldes con más resina de inclusión. Transfiéralos a dos metil butano fríos, enfriados por un congelador o por hielo seco.

Una vez fríos, almacene las muestras a menos 20 grados Celsius o a menos 80 grados Celsius para seccionarlas. Para cuantificar la expresión de Col10a1 en el CCM de secciones sagitales de cóndilos, abra las imágenes histológicas en un paquete de software de análisis de imágenes y seleccione el área de interés con la herramienta de lazo. En este caso, se selecciona la región MCC.

Tome nota del número de píxeles en el área, que se indica en el cuadro del histograma. A continuación, seleccione los píxeles rojos Col10a1 ajustando la gama de colores. Utilice la herramienta Cuentagotas para seleccionar un píxel rojo de la imagen y haga clic en Aceptar. A continuación, registre el número de píxeles rojos en el área, tal como se indica en el cuadro del histograma.

La fracción de píxeles rojos en el área representa la cantidad de expresión de Col10a1. Ahora, utilizando la misma técnica básica, se cuantifica la actividad de TRAP en el CCM y el hueso subcondral. En primer lugar, seleccione el cartílago de las regiones óseas subcondrales como áreas a analizar y tome nota del total de píxeles.

A continuación, seleccione los píxeles amarillos generados por el sustrato ELF97. Tome nota del número de píxeles positivos y calcule la fracción de píxeles positivos de TRAP. Ahora, cuantifique las células positivas de EDU que son contra-teñidas en azul por DEPI.

De nuevo, seleccione el área de interés y luego cuantifique los píxeles azules dentro de ella. Utilice también este método para determinar el número de píxeles positivos de EDU en la misma región. Las mediciones morfométricas de ratones, sometidos a una carga compresiva de la ATM, mostraron que la carga aumentó significativamente la longitud de la mandíbula y la cabeza del cóndilo.

Sin embargo, la carga no resultó en un cambio significativo en el ancho del cóndilo. La cuantificación de la distribución de colágeno reveló un aumento significativo en la expresión de Col10a1 y en el MCC de los cóndilos de los animales cargados. Por otro lado, la expresión de Col2a1 no fue muy diferente de la del control.

La actividad de TRAP aumentó en la región subcondral de los cóndilos y los ratones cargados, al igual que la subproliferación. La tinción EDU denota el número de células proliferativas. La distribución de proteoglicanos en el CCM se cuantificó evaluando el área teñida con azul de toluidina y el mapa de distancias.

Hubo un aumento significativo en el mapeo de distancias en el MCC de los cóndilos del grupo cargado. Sin embargo, el área teñida con proteoglicanos no fue estadísticamente diferente entre los grupos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo analizar los cambios celulares y estructurales en el cóndilo mandibular de los roedores.