Un método de análisis celular para el cóndilo Mandibular murino y morfométricos

El objetivo general de este experimento es observar los efectos de la carga compresiva en el cartílago condilar mandibular de ratones mediante mediciones morfométricas en radiografías y análisis histológico. Estas métricas pueden ayudar a responder preguntas clave sobre los cambios estructurales y celulares dentro del cóndilo mandibular de roedores. La principal ventaja de la técnica mostrada aquí es que podría utilizarse para analizar otros animales pequeños nacidos o participantes.

Para este protocolo, tenga mandíbulas de ratón aisladas y diseccionadas listas para usar. En una placa de Petri, transfiera las mandíbulas a un sistema de gabinete de rayos X. Luego, tome radiografías a 26 kilovoltios durante cinco segundos.

Ahora, abra las imágenes en el software de análisis para realizar mediciones morfométricas. Primero, use el botón de unidad para configurar la barra de escala. A continuación, seleccione seis puntos anatómicos utilizando el estilo de marcador 2.

Primero, seleccione los puntos más posteriores del cóndilo mandibular como punto uno. A continuación, seleccione el proceso incisivo como punto dos. Luego, seleccione el punto más profundo de la escotadura sigmoidea como punto tres.

A continuación, seleccione el punto más profundo en la concavidad del ramo mandibular, punto cuatro, y luego seleccione el punto más anterior de la superficie articular del cóndilo, punto cinco. Ahora, seleccione el punto más posterior de la superficie articular del cóndilo como punto seis y proceda a tomar mediciones de longitud utilizando la herramienta de longitud. A continuación, utilice la herramienta de línea perpendicular desde los puntos tres a cuatro para medir la longitud de la cabeza del cóndilo, que es la longitud de la perpendicular, desde el punto uno hasta la línea entre los puntos tres y cuatro.

Luego, mida la longitud mandibular, entre los puntos uno y dos. Por último, mida el ancho de la cabeza del cóndilo, que se encuentra entre los puntos cinco y seis. Para guardar los datos, copie la lista de mediciones en el lado derecho de la pantalla.

Antes de incluir las mandíbulas fijadas, pero no descalcificadas, sumérjalas durante la noche en una solución de sacarosa al 30 por ciento en PBS. Al día siguiente, elimine cualquier tejido blando sobrante y corte cuidadosamente el cóndilo mandibular. A continuación, coloque las muestras en moldes de plástico, con la superficie medial del cóndilo contra la base del molde y la muestra paralela al fondo del molde.

Luego, sumérjalos en resina de inclusión y enfríe la resina con un trozo de hielo seco. A continuación, rellene los moldes con más resina de inclusión. Trasfiera los moldes al metilbutano líquido frío, enfriado mediante congelador o hielo seco.

Una vez enfriadas, almacene las muestras a menos 20 grados Celsius o a menos 80 grados Celsius para su seccionado. Para cuantificar la expresión de Col10a1 en la MCC de secciones sagitales de los cóndilos, abra las imágenes histológicas en un paquete de software de análisis de imágenes y seleccione el área de interés utilizando la herramienta de lazo. En este caso, se selecciona la región de la MCC.

Tome nota del número de píxeles en el área, que se indica en el cuadro del histograma. A continuación, seleccione los píxeles rojos de Col10a1 ajustando el rango de color. Utilice la herramienta cuentagotas para seleccionar un píxel rojo de la imagen y haga clic en Aceptar. Luego, registre el número de píxeles rojos en el área, tal como se indica en el cuadro del histograma.

La fracción de píxeles rojos en el área representa la cantidad de expresión de Col10a1. Ahora, utilizando la misma técnica básica, cuantifique la actividad TRAP en el MCC y el hueso subcondral. Primero, seleccione el cartílago en las regiones del hueso subcondral como las áreas a analizar y anote el número total de píxeles.

Luego, seleccione los píxeles amarillos generados por el sustrato ELF97. Tenga en cuenta el número de píxeles positivos y calcule la fracción de píxeles positivos para TRAP. Ahora, cuantifique las células positivas para EDU que están contramarcadas en azul por DEPI.

De nuevo, seleccione el área de interés y luego cuantifique los píxeles azules dentro de ella. Utilice también este método para determinar el número de píxeles positivos para EDU en la misma región. Las mediciones morfométricas en ratones sometidos a carga compresiva en la ATM mostraron que la carga incrementó significativamente la longitud del maxilar y de la cabeza del cóndilo.

Sin embargo, la carga no resultó en un cambio significativo en el ancho del cóndilo. La cuantificación de la distribución de colágeno reveló un aumento significativo en la expresión de Col10a1 y en la MCC de los cóndilos de los animales sometidos a carga. Por otro lado, la expresión de Col2a1 no fue muy diferente respecto al control.

La actividad de TRAP aumentó en la región subcondral de los cóndilos y en los ratones sometidos a carga, al igual que la proliferación subcondral. La tinción con EDU indica el número de células proliferativas. La distribución de proteoglicanos en el MCC se cuantificó mediante la evaluación del área teñida con azul de toluidina y del mapa de distancias.

Hubo un aumento significativo en la distancia de mapeo en la MCC de los cóndilos del grupo cargado. Sin embargo, el área teñida de proteoglicanos no mostró diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar los cambios celulares y estructurales en el cóndilo mandibular de roedores.