Name: Un método de análisis celular para el cóndilo Mandibular murino y morfométricos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprende a analizar cambios morfométricos y celulares en el cóndilo mandibular de ratones mediante radiografías e histología. Este protocolo permite evaluar los efectos de la carga compresiva en el cartílago articular.

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Los autores desean agradecer a Dr. David Rowe por amablemente que los ratones transgénicos y Li Chen la asistencia histológica.
La investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Dental & investigación craneofacial de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número K08DE025914 y por la Asociación Americana de ortodoncia Fundación a Sumit Yadav.

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<li>Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+temporomandibular+joint+changes+in+Twin+Block+and+Bionator+appliance+therapy%3A+a+magnetic+resonance+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Orthod%22%5BJournal%5D)">Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study.</a> Prog Orthod. 15 (57), (2014).</li>
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<li>Benjamin, M., Ralphs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+fibrocartilage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Biology of fibrocartilage cells.</a> Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).</li>
<li>Shen, G., Darendeliler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Adaptive+Remodeling+of+Condylar+Cartilage-+A+Transition+from+Chondrogenesis+to+Osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis.</a> J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).</li>
<li>Utreja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+matrix+response+of+temporomandibular+cartilage+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading.</a> Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).</li>
<li>Kaul, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Altered+Loading+on+Mandibular+Condylar+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage.</a> PLoS ONE. 11 (7), 0160121(2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+Multi-Image+Cryohistology+of+Mineralized+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues.</a> J Vis Exp. , e54468(2016).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
<li>Hayman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tartrate-resistant+acid+phosphatase+%28TRAP%29+and+the+osteoclast%2Fimmune+cell+dichotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy.</a> Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).</li>
</ol>

Los autores tienen intereses financieros que compiten.

Este manuscrito describe métodos para la medición morfométrica y análisis celular de cóndilos mandibulares murinos y mandíbulas. Las mediciones radiográficas morfométricas también pueden utilizarse para analizar otros huesos de animales pequeños. Además, el análisis celular (celular cuantificación y mapeo de distancia cartílago) no se limitan a cóndilo mandibular roedor, pero puede utilizarse para cuantificar las secciones histológicas de numerosos tejidos.
Modelos de ratón transgénico expresa...

La ATM es una articulación de carga única situada en la región craneofacial y está formada por fibrocartílago. El MCC de la ATM es esencial para la función de las articulaciones, incluyendo movimiento de mandíbula sin trabas al hablar y masticar, pero comúnmente es afectado por enfermedades degenerativas, incluyendo artrosis1. La ATM tiene la capacidad de adaptarse a estímulos externos y alteraciones de la carga, conduce a cambios estructurales y celulares para los componentes del MCC2,3,4,5. Las propiedades de carga de la MCC se pueden explicar por las interacciones entre sus componentes, incluyendo el agua, la red de colágeno y densamente poblado de proteoglicanos. El MCC tiene cuatro zonas de celulares distintas que expresan diferentes tipos de proteínas no colágeno y colágeno: 1) la zona superficial o articular; 2) la zona proliferativa, compuesto por células mesenquimales indiferenciadas y responde a la carga de demandas; 3) la zona de prehypertrophic, compuesto por condrocitos maduros expresan colágeno de tipo 2; y 4) la hipertrófica de la zona, la región donde los condrocitos hipertróficos expresan colágeno tipo mueren 10 y someterse a la calcificación. La región no mineralizado es rica en proteoglicanos que ofrecen resistencia a fuerzas de compresión6.
Existe mineralización continua en la zona hipertrófica de la MCC, donde se produce la transición de condrogénesis osteogénesis, garantizando la robusta estructura mineral del hueso subcondral del cóndilo mandibular7. Cambios celulares en las regiones mineralizadas y no mineralizadas en última instancia conducen a cambios morfológicos y estructurales en el cóndilo mandibular y la mandíbula. Mantenimiento de la homeostasis de todas las regiones celulares del MCC y la mineralización de la porción subcondral son esenciales para la salud, capacidad de carga e integridad de la ATM.
El modelo de ratón transgénico de colágeno múltiple (según lo descrito por Utreja et al.) 8 es una gran herramienta para entender los cambios en la expresión de colágeno porque todos los transgenes se expresan en el MCC. Para una evaluación histológica a fondo, manchas histológicas se utilizan para estudiar la deposición de matriz, mineralización, proliferación celular y apoptosis, así como expresión de la proteína en las diferentes capas del MCC.
En este manuscrito, histológico y análisis morfométrico se utilizan para evaluar los cambios celulares y estructurales en el MCC y subcondral del hueso del cóndilo mandibular de los ratones. Además, se describe un método de cuantificación de células, para el análisis de imágenes histológicas fluorescentes y para el mapeo de portaobjetos de microscopio de luz. La resistencia a la compresión ATM estática carga del método, que causa cambios celulares y morfológicos en el MCC y subcondral hueso9, se ilustra también para validar nuestros métodos.
Los métodos descritos aquí pueden utilizarse para determinar la morfometría y cambios histológicos en el cóndilo mandibular y la mandíbula de roedores o analizar otras regiones de la osificación endocondral y la morfología de los tejidos mineralizados adicionales.

<table><tbody><tr><td>MX20 Sistema de radiografía</td><td>Faxitron X-Ray LLC&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de imagen Digimezizer&nbsp;</td><td>MedCalc Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cryomatrix resina de inclusión</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio manual Axio Imager Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>208562</td><td></td></tr><tr><td>filtro de proteínas fluorescente amarillo&nbsp; - EYFP</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>filtro de proteína fluorescente cian - ECFP</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>filtro de proteína fluorescente rojo - Cy5</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>acetato de sodio anhidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>L-tartrato de sodio dibásico dihidratado&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>nitrito de sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>ELF97 sustrato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E6600</td><td></td></tr><tr><td>ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit</td><td>Life Technologies</td><td>C10339&nbsp;</td><td>incluye EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina)&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Azul de toluidina O&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop&nbsp;</td><td>Adobe Systems Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabletas de solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Research Products International</td><td>P32080-100T</td><td></td></tr><tr><td>CNA Beta III Nickel-Free</td><td>Archwire Ortho Organizers, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prisma GraphPad&nbsp;</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un método de análisis celular para el cóndilo mandibular murino y morfométricos

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

La articulación temporomandibular (ATM) tiene la capacidad de adaptarse a estímulos externos, y cambios de carga puede afectar la posición de los cóndilos, así como los componentes celulares y estructurales del cartílago condilar mandibular (MCC). Este manuscrito describe métodos para el análisis de estos cambios y un método para alterar la carga de la ATM en ratones (es decir, a la compresión estática ATM carga). La evaluación estructural ilustrada aquí es un enfoque morfométrico simple que utiliza el software Digimizer y se realiza en las radiografías de huesos pequeños. Además, el análisis de celulares cambia principales alteraciones en la expresión de colágeno, el remodelado óseo, la división celular y se describe la distribución de proteoglicanos en el MCC. La cuantificación de estos cambios en las secciones histológicas - contando los pixeles fluorescentes positivos utilizando software y la cartografía de la distancia de medición de la imagen y manchado la zona con Digimizer - también se demuestra. Los métodos que se muestran aquí no están limitados a la ATM murina, pero podrían ser utilizados en los huesos más pequeños de animales de experimentación y en otras regiones de la osificación endocondral.

Se realizaron estadísticas descriptivas para examinar la distribución de las mediciones morfométricas (longitud mandibular, cóndilo longitud, anchura condilar) y análisis histológicos. Se compararon los resultados entre el grupo cargado (es decir, ratones sometidos a una carga compresiva con el resorte de titanio beta) y el grupo de control (es decir, que los ratones control que no recibió ningún procedimiento). Diferencias estadísticamente significativas entre los medio...

Este manuscrito presenta métodos para el análisis morfométrico y cambios celulares en el cóndilo mandibular de roedores.

Un método de análisis celular para el cóndilo Mandibular murino y morfométricos

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

El objetivo general de este experimento es observar los efectos de la carga compresiva en el cartílago condilar mandibular de ratones mediante mediciones morfométricas en radiografías y análisis histológico. Estas métricas pueden ayudar a responder preguntas clave sobre los cambios estructurales y celulares dentro del cóndilo mandibular de roedores. La principal ventaja de la técnica mostrada aquí es que podría utilizarse para analizar otros animales pequeños nacidos o participantes.Para este protocolo, tenga mandíbulas de ratón aisladas y diseccionadas listas para usar. En una placa de Petri, transfiera las mandíbulas a un sistema de gabinete de rayos X. Luego, tome radiografías a 26 kilovoltios durante cinco segundos.Ahora, abra las imágenes en el software de análisis para realizar mediciones morfométricas. Primero, use el botón de unidad para configurar la barra de escala. A continuación, seleccione seis puntos anatómicos utilizando el estilo de marcador 2.Primero, seleccione los puntos más posteriores del cóndilo mandibular como punto uno. A continuación, seleccione el proceso incisivo como punto dos. Luego, seleccione el punto más profundo de la escotadura sigmoidea como punto tres.A continuación, seleccione el punto más profundo en la concavidad del ramo mandibular, punto cuatro, y luego seleccione el punto más anterior de la superficie articular del cóndilo, punto cinco. Ahora, seleccione el punto más posterior de la superficie articular del cóndilo como punto seis y proceda a tomar mediciones de longitud utilizando la herramienta de longitud. A continuación, utilice la herramienta de línea perpendicular desde los puntos tres a cuatro para medir la longitud de la cabeza del cóndilo, que es la longitud de la perpendicular, desde el punto uno hasta la línea entre los puntos tres y cuatro.Luego, mida la longitud mandibular, entre los puntos uno y dos. Por último, mida el ancho de la cabeza del cóndilo, que se encuentra entre los puntos cinco y seis. Para guardar los datos, copie la lista de mediciones en el lado derecho de la pantalla.Antes de incluir las mandíbulas fijadas, pero no descalcificadas, sumérjalas durante la noche en una solución de sacarosa al 30 por ciento en PBS. Al día siguiente, elimine cualquier tejido blando sobrante y corte cuidadosamente el cóndilo mandibular. A continuación, coloque las muestras en moldes de plástico, con la superficie medial del cóndilo contra la base del molde y la muestra paralela al fondo del molde.Luego, sumérjalos en resina de inclusión y enfríe la resina con un trozo de hielo seco. A continuación, rellene los moldes con más resina de inclusión. Trasfiera los moldes al metilbutano líquido frío, enfriado mediante congelador o hielo seco.Una vez enfriadas, almacene las muestras a menos 20 grados Celsius o a menos 80 grados Celsius para su seccionado. Para cuantificar la expresión de Col10a1 en la MCC de secciones sagitales de los cóndilos, abra las imágenes histológicas en un paquete de software de análisis de imágenes y seleccione el área de interés utilizando la herramienta de lazo. En este caso, se selecciona la región de la MCC.Tome nota del número de píxeles en el área, que se indica en el cuadro del histograma. A continuación, seleccione los píxeles rojos de Col10a1 ajustando el rango de color. Utilice la herramienta cuentagotas para seleccionar un píxel rojo de la imagen y haga clic en Aceptar. Luego, registre el número de píxeles rojos en el área, tal como se indica en el cuadro del histograma.La fracción de píxeles rojos en el área representa la cantidad de expresión de Col10a1. Ahora, utilizando la misma técnica básica, cuantifique la actividad TRAP en el MCC y el hueso subcondral. Primero, seleccione el cartílago en las regiones del hueso subcondral como las áreas a analizar y anote el número total de píxeles.Luego, seleccione los píxeles amarillos generados por el sustrato ELF97. Tenga en cuenta el número de píxeles positivos y calcule la fracción de píxeles positivos para TRAP. Ahora, cuantifique las células positivas para EDU que están contramarcadas en azul por DEPI.De nuevo, seleccione el área de interés y luego cuantifique los píxeles azules dentro de ella. Utilice también este método para determinar el número de píxeles positivos para EDU en la misma región. Las mediciones morfométricas en ratones sometidos a carga compresiva en la ATM mostraron que la carga incrementó significativamente la longitud del maxilar y de la cabeza del cóndilo.Sin embargo, la carga no resultó en un cambio significativo en el ancho del cóndilo. La cuantificación de la distribución de colágeno reveló un aumento significativo en la expresión de Col10a1 y en la MCC de los cóndilos de los animales sometidos a carga. Por otro lado, la expresión de Col2a1 no fue muy diferente respecto al control.La actividad de TRAP aumentó en la región subcondral de los cóndilos y en los ratones sometidos a carga, al igual que la proliferación subcondral. La tinción con EDU indica el número de células proliferativas. La distribución de proteoglicanos en el MCC se cuantificó mediante la evaluación del área teñida con azul de toluidina y del mapa de distancias.Hubo un aumento significativo en la distancia de mapeo en la MCC de los c&oacute;ndilos del grupo cargado. Sin embargo, el &aacute;rea te&ntilde;ida de proteoglicanos no mostr&oacute; diferencias estad&iacute;sticamente significativas entre los grupos. Despu&eacute;s de ver este video, deber&iacute;a tener una buena comprensi&oacute;n de c&oacute;mo analizar los cambios celulares y estructurales en el c&oacute;ndilo mandibular de roedores.

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Investigación

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Biology

Biología

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Muchas estructuras biológicas carecen de puntos de referencia fácilmente definibles, por lo que es difícil aplicar métodos morfométricos modernas. Aquí se ilustran métodos para estudiar la baculum ratón (un hueso en el pene), incluyendo la disección y el escaneo microCT, seguido de métodos computacionales para definir semirremolques puntos de referencia que se utilizan para cuantificar el tamaño y la forma de la variación.

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