Comportamiento de la fase de vesículas cargadas en solución simétrica y asimétrica condiciones monitoreadas con microscopía de fluorescencia

El objetivo general de este protocolo es evaluar cuantitativamente el efecto de los ambientes de alta salinidad y la asimetría de la solución transmembrana que se encuentran en condiciones fisiológicas sobre los estados de fase de la membrana. Las soluciones dentro y fuera de la célula son muy diferentes. Nuestros métodos ayudan a comprender el efecto de la asimetría de la solución en las propiedades de la membrana y el comportamiento de la fase.

La principal ventaja de nuestro enfoque es que las vesículas se pueden preparar en condiciones de tampón fisiológicas y el dispositivo microfluídico se puede utilizar para crear condiciones de tampón asimétricas. Para comenzar el procedimiento, raspe un lado de una placa de PTFE con papel de lija fino. Lave el plato, un frasco de vidrio de 15 mililitros y un recipiente de vidrio hermético con detergente para lavar platos comercial, etanol y cloroformo.

Use una jeringa de vidrio de 25 microlitros para depositar de 10 a 15 microlitros de caldo lipídico en cloroformo en el lado rugoso de la placa de PTFE limpia y seca. Extienda el caldo lipídico con la aguja de la jeringa para crear una película lipídica uniforme. Use pinzas para transferir la placa al vial de 15 mililitros.

Calentar la placa a 60 grados centígrados y desecar durante dos horas para que se evapore el disolvente. Luego, agregue agua desionizada a un recipiente de vidrio a una altura de aproximadamente un centímetro. Coloque el vial con la placa en el recipiente, asegurándose de que permanezca estable y en posición vertical y selle el recipiente.

Deje que la bicapa lipídica se hinche previamente a 60 grados centígrados durante cuatro horas. A continuación, retire el vial del recipiente. Extraiga cinco mililitros de solución de hinchazón en una jeringa de plástico y coloque un filtro de 0,45 micrómetros en la punta de la jeringa.

Agregue la solución de hinchazón filtrada al vial para hidratar la película lipídica. Tape el vial y selle el vial con una película plástica de parafina. Almacene el vial a 60 grados centígrados durante la noche para obtener el agregado GUV.

Enfríe las vesículas a temperatura ambiente dentro de una hora después de retirarlas del fuego. Corte el extremo de una punta de micropipeta de plástico de 200 microlitros, de modo que el agregado GUV pueda introducirse en la punta. Utilice la punta de pipeta recortada para transferir el agregado y 50 microlitros de solución de hinchazón a un vial limpio y seco de dos mililitros.

Añadir al vial 950 microlitros de solución de hinchamiento fresca o una solución isotónica para conseguir condiciones de solución simétricas o asimétricas, respectivamente. Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo y luego invertir suavemente el vial varias veces para volver a suspender los GUV. Para comenzar la evaluación, coloque una alícuota de suspensión de GUV en un aislador de silicona en un portaobjetos de microscopio.

Selle la cámara con un cubreobjetos. Deje que la muestra se reequilibre durante cinco minutos. A continuación, coloque el portaobjetos en la platina de muestra de un microscopio de fluorescencia y adquiera imágenes de al menos 30 GUV por lote.

Inspeccione las imágenes para determinar los estados de fase de los GUV de imagen. Los GUV en un solo estado de fase líquida serán esféricos y lisos con una etiqueta fluorescente distribuida homogéneamente por toda la membrana. Los GUV en un estado bifásico líquido ordenado y desordenado serán esféricos con una etiqueta fluorescente dividida en dominios con límites suaves dentro de la membrana.

Verifique que los dominios estén libres para difundirse en las superficies de las vesículas y puedan fusionarse. Los GUV en un estado de fase sólida líquida bifásico o trifásico se redondearán con algunos límites angulares. Los dominios líquidos sobre un fondo sólido no deben mostrar difusión, pero los dominios sólidos deben difundirse libremente sobre un fondo líquido.

Una vez que se haya identificado el estado de fase de cada GUV de imagen, determine el estado de fase dominante para el lote. Repita el proceso con muestras independientes si el estado de fase dominante es una mayoría estrecha. Antes de usar el dispositivo microfluídico, prepare al menos cinco mililitros de soluciones de hinchazón de sacarosa y sal.

Filtre cada solución a través de un filtro de 0,45 micrómetros. A continuación, recorte los extremos de las puntas de pipeta de plástico de 200 microlitros y coloque una punta de pipeta en cada canal del dispositivo. Añada al depósito del dispositivo 100 microlitros de solución de hinchamiento fresca filtrada del mismo tipo que se utiliza para preparar los GUV.

Añada cinco microlitros de la solución de hinchamiento a cada punta de pipeta. Centrifugar el dispositivo a 900 veces G durante 10 minutos para llenar los canales del dispositivo. Luego, llene una jeringa de vidrio de un mililitro con la misma solución de hinchazón filtrada.

Conecte un trozo de tubo a la jeringa. Empuje la solución hinchada a través del tubo hasta que el émbolo esté completamente presionado y el tubo se llene con solución. Luego, conecte el tubo al canal de salida y monte la jeringa en una bomba de jeringa.

A continuación, conecte la unidad de control de presión a las entradas del canal microfluídico. Asegúrese de que las válvulas estén cerradas y luego ajuste la presión a tres bares. Coloque el dispositivo microfluídico en la platina de muestra de un microscopio confocal invertido.

Utilice una pipeta para eliminar la solución inflamatoria del depósito del dispositivo hasta que solo queden de 25 a 50 microlitros de solución. Agregue 150 microlitros de la suspensión GUV al depósito y mezcle la suspensión con un pipeteo suave. Haga funcionar la bomba de jeringa en modo de extracción a 10 microlitros por minuto durante 20 minutos o hasta que más del 90% de las trampas del dispositivo estén ocupadas.

Luego, abra las válvulas de la unidad de control de presión para cerrar las válvulas de anillo en el dispositivo microfluídico. Detenga la bomba de jeringa y deje reposar el dispositivo durante una hora antes de adquirir imágenes confocales de los GUV en el dispositivo. A continuación, utilice una pipeta para retirar la suspensión GUV del depósito y dejar sólo de 25 a 50 microlitros.

Agregue al depósito 150 microlitros del otro tipo de solución de hinchazón filtrada y pipetee suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo. Repita este proceso al menos cinco veces para reemplazar completamente la solución en el depósito. Haga funcionar la bomba de jeringa en modo de extracción a 10 microlitros por minuto durante 10 minutos para reemplazar la solución en los microcanales.

Luego, disminuya el caudal a un microlitro por minuto. Cierre las válvulas de la unidad de control de presión durante dos segundos y luego abra las válvulas y detenga la bomba de jeringa. Deje que el dispositivo permanezca reposando durante una hora antes de grabar imágenes confocales.

Para comenzar a preparar la cámara de control de temperatura, primero conecte los accesorios de tubo de púas a un conjunto de flujo de calor de aluminio con ventanas de cubreobjetos de dos milímetros de grosor. Coloque un espaciador de goma en uno de los cubreobjetos para formar la cámara de observación. Cargue 100 microlitros de la suspensión GUV en la cámara de observación y selle la cámara con un cubreobjetos.

Invierta lentamente el ensamblaje. Conecte la cámara de aluminio a un baño de agua externo. Monte el conjunto en una platina de muestra de microscopio.

Ajuste el baño de agua externo a la temperatura más baja deseada y deje que el sistema se equilibre durante 10 a 15 minutos. Adquiera imágenes de los GUV y determine los estados de fase a varias temperaturas. Los GUV se prepararon a partir de proporciones variables de DOPG y esfingomielina de huevo y colesterol en soluciones simétricas de sacarosa o sal.

Sus estados de fase dominantes se determinaron mediante microscopía de fluorescencia. A continuación, las composiciones seleccionadas se transfirieron a condiciones asimétricas por dilución para evaluar las condiciones efectivas de la solución en el comportamiento de la fase. Para investigar más a fondo el comportamiento de la fase GUV en soluciones asimétricas, los GUV se atraparon en un dispositivo microfluídico para permitir el intercambio completo de la solución externa.

Los GUVs atrapados fueron evaluados por microscopía confocal antes y después del intercambio fluídico. La fracción de GUV homogéneos a separados por fase se monitoreó en un rango de temperaturas para evaluar la temperatura efectiva en el comportamiento de fase del GUV. Se observó un patrón sigmoidal en los datos, que luego se ajustaron a un modelo de Boltzmann.

La temperatura a la que la fracción de GUV separados por fase fue de 0,5 se determinó a partir de la curva ajustada. Aunque estos métodos pueden proporcionar información sobre el comportamiento de la fase de membrana, las aplicaciones también se pueden utilizar para otros experimentos, como el estudio de las interacciones entre membranas en biomoléculas en condiciones fisiológicas.