Name: Comportamiento de la fase de vesículas cargadas en solución simétrica y asimétrica condiciones monitoreadas con microscopía de fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprende a evaluar el comportamiento de fase de vesículas GUV bajo condiciones de alta salinidad y asimetría transmembrana usando microscopía de fluorescencia. Este método permite estudiar propiedades de membranas en condiciones fisiológicas.

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Este trabajo forma parte del consorcio MaxSynBio, que es financiado conjuntamente por el Ministerio Federal de educación y de investigación de Alemania y de la sociedad Max Planck.

Los autores no tienen nada que revelar.

Exitosa producción de 2.fino observaciones estado de fase en condiciones de alta salinidad simétricas y asimétricas
Los protocolos presentados aquí presenta una estrategia para evaluar la influencia de la asimetría de tampón y la solución de alta salinidad en el estado de la fase de membrana de 2.fino cargada sobre una amplia gama de composiciones. Uno de los retos más importantes hacia el logro de este objetivo era la producción de 2.fino cargada en tampones de alta salinidad.
Produjo con éxito 2.fino en solución de sacarosa y alta-solución salina tampón por un simple acercamiento inflamación espontáneo, que incluye un paso de la hidratación previa de la película de lípidos depositados y un paso final de la hidratación durante la noche para el crecimiento de la vesícula. Es importante tener en cuenta que la deposición de lípidos debe hacerse en una placa PTFE rugosa para asegurar incluso lípidos que se separa para producir vesículas unilaminar. Además, es esencial para llevar a cabo cada paso durante la preparación de la vesícula a una temperatura donde la película lipídica está en un estado de fase homogénea y fluida. Otra cosa, la población de vesícula puede polidispersas en composición y sesgar el análisis de estado de fase final de la población. El protocolo específico para la inflamación espontánea de 2.fino rendimientos un bosquete de vesícula que por un lado ofrece la posibilidad de volver a suspenderlo en pequeños volúmenes para obtener dispersiones de vesícula de alta concentración y por otro lado proporciona solución asimétrica condiciones a través de la membrana y reducir al mínimo la dilución de las vesículas8,28. Es esencial que durante la dilución de la vesícula o solución externa de intercambio, dentro y fuera de osmolarities permanecen emparejados como morfología cambios causados por desajustes de la osmolaridad pueden inducir o evitar Lo + Ld fase separación41 o, en caso de hipotónica condiciones, puede conducir a la ruptura de la vesícula.
Aquí, intenta optimizar protocolos de electroformation en la solución de alta salinidad resultó en la producción de no 2.fino mientras hinchazón PVA-asistida rindió las vesículas multilamellar. Aunque requiere tiempo de preparación y resultados en lotes de vesícula de inferior calidad10,17, la exitosa producción de vesículas cargadas de espontánea inflamación viene con ventajas adicionales. Exige un esfuerzo mínimo y resultando en rendimientos suficientes para los análisis estadísticos por lotes y, a diferencia de electroformation, equipos sofisticados ni optimización no fueron requeridos. Por otra parte, no hay contaminación por oxidación de lípidos se han observado42,43. Según la literatura existen diferencias entre las composiciones lipídicas de las vesículas y las acciones correspondientes de que ellos crecieron7,17. Además, la formación de vesículas sobre un sustrato PTFE no pide la inclusión de cualquier contaminación en contraste con métodos hinchazón asistida gel donde las moléculas extranjeras pueden introducirse por el sustrato23. Electroformation viene con más inconvenientes relacionados con la dilución excesiva de la vesícula al crear las condiciones de solución asimétrica. 2.fino producida por electroformation está generalmente presente como una dispersión homogénea (en contraste con la suspensión de vesícula altamente concentrada en la forma de un grupo formado durante inflamación espontánea). Cualquier dilución de la solución externa diluiría considerablemente el número de vesículas así. Además, en el transcurso de este trabajo que se observó que DOPG/eSM/Chol 2.fino producido por electroformation de sacarosa llegó a ser inestable si diluido en buffer de alta salinidad. Fluorescencia de parches de lípidos en el portaobjetos del microscopio indica que las vesículas estallaría antes de su inspección visual posible. Esa inestabilidad puede atribuirse a una tensión elevada de la membrana de las vesículas preparado por electroformation en comparación con los obtenidos por inflamación espontánea10.
Aunque la dilución de la vesícula es un enfoque fácil y rápido para crear condiciones de solución GUV asimétricas, sólo logra un intercambio parcial solución externa, aunque con una alta fracción (aquí: 95%, figura 2), como sobre la dilución, las huellas de la hinchazón de la solución permanecerá. La elección del grado del cambio de la solución externa es una relación inversa entre pipeteado hasta el grupo de vesícula junto con la solución hinchazón (sección 2) y no diluir demasiado. Por lo tanto, hemos introducido un enfoque alternativo microfluídicos discutido en otros lugares en detalle37 que permite un intercambio rápido y completa solución externa durante observaciones de estado GUV fase para comprobar las fase estado observaciones para diluir vesículas. Las observaciones de las variaciones de estado de fase al cambiar de simétrico a las condiciones de solución asimétrica de hecho fueron observadas para estar de acuerdo. Además, ambos métodos para generar condiciones de solución asimétrica son comparable rápido (Comparar Ref.8) y vienen con ningún riesgo conocido de las alteraciones de composición local (Comparar referencias30,31), aumento de tensión (Comparar referencia32) de membrana, o calentamiento local (Comparar referencia33), en cuanto a los métodos alternativos discutida en la introducción. Durante la captura de microfluidos, un balance osmótico entre la vesícula interior y exterior no es esenciales sólo para evitar artefactos de estado de fase como se mencionó anteriormente, sino la deflación causada por las condiciones de solución hipertónica pueden causar el atrapado 2.fino deslizarse a través de los postes después de un intercambio de solución externa.
Aunque inflamación espontánea ha sido aplicado con éxito para crecer sin cargar las vesículas de un sistema eSM/DOPC/Chol, en otros casos, la ausencia de cargos pueden perjudicar a GUV hinchazón debido a la consiguiente falta de repulsión entre las bicapas individuales44 . Extender el período de la hinchazón o la introducción contiene lípidos voluminosos puede contrarrestar este tema45. Además, puede variar la estabilidad de la vesícula después de su dilución en soluciones diferentes a la que se usa para hinchazón de lípidos diferentes composiciones y los medios de dilución, que no hemos investigado aquí. También no hemos explorado la posibilidad de templar el diámetro promedio de GUV con el método de preparación presentado aquí. Pero parámetros tales como la composición de la vesícula e inflamación solución son capaces de influir en los resultados. La aplicación de métodos alternativos46 puede producir grandes vesículas de lípidos y soluciones utilizadas aquí, sin embargo, vienen con otros inconvenientes asociados con el método. El enfoque descrito anteriormente para producir a 2.fino en condiciones de alta salinidad simétricas y asimétricas proporciona una herramienta potencial para futuros estudios de vesículas de composiciones de diferentes lípidos y dispersa en diferentes medios de comunicación. Como no hemos explorado las posibilidades, los ensayos futuros mostrará cómo generalmente pueden aplicarse los métodos de preparación y dilución de GUV.
Observación de la separación de la fase a diferentes temperaturas
Existen diferentes configuraciones experimentales adecuadas estudiar a 2.fino a diferentes temperaturas. Aunque estas configuraciones no son comúnmente se describe en detalle dentro de la literatura, el presente trabajo presenta un montaje básico aplicable para dichos estudios.
_content "> control mediciones muestran que la temperatura de este en el local diseñado y construido cámara precisamente es controlada por un termostato y gradientes de temperatura dentro de la cámara dentro de la resolución experimental de la temperatura. Se asegura que las condiciones térmicas experimentales son consistentes con la lectura del termostato.
Durante la evaluación de GUV Estados de fase en un rango amplio de temperatura, es importante que las vesículas observadas están bien equilibradas después de que la temperatura ha cambiado. Una forma posible de asegurar esto es verificar la histéresis. Si hay histéresis, deben reducirse las medidas de temperatura o aumentaron de tiempos de equilibrado. Como temperatura control en este trabajo se establece por un termostato a base de agua, la gama de temperaturas de trabajo es ideal limitada 0 - 100 ° C. Esta gama se puede ampliar mediante el uso de otros líquidos de control de temperatura tales como aceite o mediante el empleo de otras configuraciones, por ejemplo, un dispositivo Peltier. En la práctica, la temperatura de trabajo está limitada también por la posible condensación o evaporación. Además, para temperaturas lejos de temperatura, la ocurrencia de un gradiente de temperatura de estado estacionario a través de la cámara de observación se convierte en más. Además, el equipo de proyección de imagen puede resultar lesionado en las temperaturas extremas. Para rangos de temperatura típicos del apropiada para estudios de vesícula lipídica (~ 10-50 ° C7,9) daños a los equipos de observación se deben considerar pero por lo general no se espera.
Artefactos de observación de dominio de vesícula
Hay un número de fuentes para los artefactos de observación mediante microscopía de fluorescencia de campo amplio. En primer lugar, uno debe ser consciente de que la resolución máxima r del objeto aplicado para la inspección visual de los Estados de fase de vesícula determina el límite de detección de los dominios de lípidos según: 
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56034/56034eq2v2.jpg"> donde λ es la longitud de onda de emisión, y NA es la apertura numérica del objetivo. Un objetivo típico con una de 40 aumentos y un NA de 0,6 que detecta la emisión verde luz alrededor 560 nm alcanzaría una resolución óptica de ~0.6 μm. por lo tanto, estudios que comparan los Estados de la fase de vesículas de mezclas de lípidos particularmente entre diferentes condiciones deben utilizar el mismo objetivo para la misma mezcla de lípidos.
Otro artefacto es la aparición de los dominios de lípidos como consecuencia de la foto-oxidación lipídica debido a una exposición prolongada a la luz de excitación41. Foto daño ocurre preferentemente en moléculas de lípidos de hidrocarburo no saturado. De hecho, algunas composiciones de lípidos, tal formación dominio de vesículas inicialmente homogéneas se observó aquí tras un largo periodo de exposición a la luz la excitación (~ 30 s). Para contrarrestar este problema, la luz de excitación se mantuvo enfocada en un campo de visión durante sólo unos segundos para la evaluación de estado de fase. Por lo tanto, DiIC18 era conveniente para nuestros propósitos. Otros tintes, sin embargo, pueden ser mucho más sensibles y pueden necesitar manejar intensidades de excitación más bajas y con tiempos más cortos de exposición a la luz de excitación.
Tensión de esquileo mecánico de la transmisión de la pipeta de las vesículas potencialmente mezcla dominios temporalmente, de tal modo que distorsionan el comportamiento de fase de vesícula evidente. Algunos lotes, vesículas diferentes mostraron comportamientos diferentes fase 0 min y 5 min después de la pipeta de transferencia sobre el cubreobjetos microscopio. También se ha demostrado el esfuerzo cortante inducido por el flujo flúido en el dispositivo de microfluidos en dominio mezcla47. Vesículas se deben dejar tranquilas para una cantidad suficiente de tiempo para equilibrar antes de observación. Dentro de este estudio, vesículas atrapadas en el dispositivo de microfluidos quedaron inalteradas durante 1 h después de la carga de la vesícula y los intercambios de solución antes de observación.
Para evitar algunas de las dificultades antes mencionadas, así como la restricción impuesta por el límite de difracción de luz, métodos alternativos como la resonancia magnética nuclear espectroscopia48 o de técnicas de microscopía de resolución super49 podría ser empleado.
Conclusión y perspectivas
El trabajo presentado muestra un conjunto de métodos que permite el análisis de la influencia de las condiciones de alta salinidad solución simétrica y asimétrica en la separación de la fase de membrana. Todos los métodos presentados son adecuados para otras aplicaciones. Por ejemplo, el dispositivo de microfluidos ofrece una plataforma para estudiar la cinética de formación del dominio y la desaparición en la inducción de la asimetría de la solución. Además, apariencia de dominio como función de la concentración de la sal podría ser examinado así. Todos los métodos podrían utilizarse también mirar la influencia en el comportamiento de fase con otras soluciones de interés.

Desde la observación de los dominios de tamaño micrométrico en vesículas de líquido-líquido separados fase gigante unilaminar (2.fino) por microscopía de fluorescencia, 2.fino se han utilizado como sistema modelo para investigar los lípidos balsa hipótesis1,2 , 3 . Como el área de su bicapa independiente miente en la gama eso de células biológicas, son imitadores adecuados de las membranas del plasma con las balsas hipotéticas. Se han realizado numerosos estudios en tal 2.fino con vesículas dispersadas en agua pura, sacarosa o con soluciones de baja salinidad4,5,6,7,8. Estas condiciones, sin embargo, no reflejan exposición fisiológicamente relevante de biomembranas a ambientes de alta salinidad y trans membrana solución asimetría como son las condiciones para las células.
En este trabajo y en una publicación anterior de nuestro grupo9, los Estados de la fase de carga multicomponente 2.fino fueron examinados en función de la presencia de asimetría sal y solución a través de la membrana. 2.fino fueron preparado de mezclas de diferentes proporciones de dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), huevo esfingomielina (eSM) y colesterol (Chol) en solución de sacarosa (con osmolaridad de 210 mOsm/kg) o buffer de alta salinidad (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 210 mOsm/kg). La elección de lípidos fue justificada por los datos ya obtenidos en el diagrama de fase de esta mezcla6,8.
Un número de métodos para la preparación de 2.fino está disponible en la literatura10,11,12 (tenga en cuenta que aquí, no consideramos aquellos que impliquen transferencia de lípidos de una base de aceite a una fase acuosa 13 , 14 debido al peligro inherente de los residuos de aceite restante en la membrana que puede afectar el comportamiento de fase). La preparación de 2.fino en buffer de alta salinidad se asocia a desafíos específicos. Para las soluciones de baja fuerza iónica, el método de electroformation15,16 presenta una forma rápida de preparar a 2.fino en altos rendimientos con poco defectos10,17. El método se basa en depositar una capa de lípidos en una superficie conductora (el electrodo), secado de los mismos y les hidratante con una solución acuosa durante la aplicación de un campo AC. Sin embargo, este método requiere ajustes si la sal está presente en la solución acuosa18,19. Se supone que la fuerza impulsora para el crecimiento de la vesícula por electroformation es de electroosmosis16 que se ve dificultada en alta conductividad20. Por lo tanto, electroswelling de 2.fino en soluciones de alta salinidad no es un enfoque sencillo ya que requiere optimización para diferentes concentraciones de sal presentes en la solución de hinchazón. Gel-asistida vesícula inflamación21,22 es una alternativa potencial a electroformation con los tiempos de formación aún más rápidos. Este enfoque se basa en la hidratación de la película de lípidos mejorado cuando un gel (agarosa o alcohol de polivinilo (PVA)) se utiliza como sustrato. Estos enfoques, sin embargo, vienen con el riesgo de contaminación de la membrana en el caso basado en la agarosa hinchazón23 y temperatura límites como en el caso de la hinchazón basadas en PVA. Asimismo, un protocolo para crecer a 2.fino sobre un sustrato de papel de celulosa ha sido recientemente establecido24. Cuestiones generales de este método son la falta de control sobre la pureza del sustrato, así como el uso de grandes cantidades de lípidos. En este trabajo, vamos a introducir y presentar las ventajas del método más tradicional para la preparación de GUV, a saber, la espontánea inflamación método25,26. Consiste en una capa de lípidos en un sustrato lipophobic, hidratante en atmósfera de vapor de agua y la posterior hinchazón en la deseada solución hinchazón de secado (ver figura 1 y detalle en la sección de protocolo). Este método no ofrece control sobre la distribución de tamaño de la vesícula y resulta en general más pequeñas vesículas en comparación con los métodos donde la producción es asistida por campo eléctrico, sustrato de polímero o microfluídicos significan. Sin embargo, la calidad de la vesícula y el tamaño es apropiado para examinar el estado de fase de membrana como explorada aquí.
Creación de asimetría entre las soluciones a través de la membrana de la vesícula se asocia con ciertos retos. Un método comúnmente usado es la dilución directa de la suspensión de la vesícula en la deseada solución externa27,28. Sin embargo, esto también disminuye la densidad de la distribución de vesículas. Otra estrategia es cambiar lentamente la solución externa alrededor 2.fino colocado en la parte inferior de una celda de flujo que permite la solución dentro y saliente. Para evitar molestar o incluso perder las vesículas con el flujo, las tasas de flujo bajas son aplicada8, que representa este enfoque tiempo ineficiente. Por otra parte, ninguno de estos métodos garantiza intercambio de solución completa externa. Una solución obvia es inmovilizar las vesículas con el fin de evitar la pérdida durante un intercambio de solución externa. Por ejemplo, biotinilado 2.fino puede ser atado a una superficie recubierta estreptavidina29. Sin embargo, este enfoque puede conducir a variaciones composicionales en la adherida y por lo tanto la membrana no adherido segmentos30,31. La aplicación de magnéticos o campos eléctricos para retener resultados de vesículas en la imposición de la membrana de tensión32. Empleando pinzas ópticas para atrapar una vesícula requiere tener una manija unida (es decir, un cordón), mientras que el uso de separadores ópticos puede incluir calefacción local33. Captura de 2.fino puede lograrse también por cultivo en alambres de platino sin desprendimiento final34. Sin embargo esto produce vesículas que no son aislados y que generalmente están conectados a los cables u otras vesículas por los tubos del lípido fina (amarres).
El trabajo presentado destaca estrategias para superar las limitaciones mencionadas. En primer lugar presentamos una descripción detallada del método inflamación espontánea adaptado y optimizado para la producción de 2.fino en almacenadores intermediarios de alta salinidad. A continuación presentamos dos enfoques para crear eficientemente condiciones asimétricas solución por dilución simple o la utilización de un dispositivo de microfluidos. Porque nuestro objetivo es el análisis del membrana fase estado 2.fino en condiciones diferentes de la solución, las secciones siguientes describen criterios para el análisis estadístico exitoso y presente sugerencias para evitar falsa categorización.
Los análisis se realizaron bajo condiciones isotérmicas como en diferentes temperaturas. Mientras que la temperatura de control se emplea comúnmente, información sobre cámaras de control de la temperatura experimental es raramente descrita. Aquí, se presenta una configuración construida casa observar 2.fino en diferentes condiciones de temperatura.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol), sal sódica</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>840475C</td><td>abreviado como DOPG en el texto</td></tr><tr><td>esfingomielina de huevo de gallina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td>860061 abreviado como eSM</td></tr><tr><td>colesterol (lana ovina, > 98 %)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>abreviado como Chol</td></tr><tr><td>Perclorato molecular de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina</td><td>Sondas moleculares</td><td>D-282</td><td>abreviadas como DiIC18</td></tr><tr><td>Cloroformo, grado HPLC (&ge; 99,8 %)</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (> 99,8 %)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl (37 %)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris (&ge; 99,9 %)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa (&ge; 99,5 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vial roscado 45x27 mm, 15 mL</td><td>Kimble</td><td></td><td>Soda fondo plano, tapón de rosca blanco</td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Mettler Toledo</td><td>MP220</td><td></td></tr><tr><td>Osmómetro</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat030</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer D1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Objective 40x, 0,6 NA</td><td>Zeiss</td><td>LD Achroplan</td><td></td></tr><tr><td>Objective 40x, 0,75 NA</td><td>Leica</td><td>506174</td><td></td></tr><tr><td>Objective 63x, 0,9 NA</td><td>Leica</td><td>506148</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio, 56x26 mm, 0,17 &plusmn; 0,01 mm</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos, 22x22 mm, 0,17 &plusmn; 0,01 mm</td><td>Menzel-Gl&auml; aser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td><td>Bremix Jeringas de Empaque Flexible</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 5 mL, 10 mL</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 y micro; m filtro de jeringa</td><td>GVS North America</td><td>Cameo 25AS, 1213723</td><td>Acetato, estéril</td></tr></tbody></table>

comportamiento de la fase de vesículas cargadas en solución simétrica y asimétrica condiciones monitoreadas con microscopía de fluorescencia

Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy

Separados por fase gigante unilaminar vesículas (2.fino) exponiendo que coexiste líquido-ordenaron y dominios trastorno del líquido son una herramienta común biofísica para investigar la hipótesis de balsa lipídica. Numerosos estudios, sin embargo, descuidan el impacto de las condiciones de solución fisiológica. Por eso, el presente trabajo presenta el efecto de la asimetría de solución tampón y trans membrana alta salinidad sobre la separación de fases líquido-líquido en 2.fino cargada de dioleylphosphatidylglycerol, huevo de esfingomielina y colesterol. Los efectos fueron estudiados bajo condiciones de temperatura isotérmica y variables.
Describimos el equipo y estrategias experimentales aplicables para el monitoreo de la estabilidad de dominios líquidas coexistentes en vesículas cargadas bajo condiciones de la solución de alta salinidad simétricos y asimétricos. Esto incluye un enfoque para preparar carga 2.fino multicomponente en buffer de alta salinidad a altas temperaturas. El protocolo implica la opción de realizar un cambio parcial de la solución externa por un paso de la simple dilución y reducir al mínimo la dilución de la vesícula. Un enfoque alternativo se presenta utilizando un dispositivo de microfluidos que permite un intercambio de solución externa completa. También se estudiaron los efectos de la solución en la separación de la fase bajo diferentes temperaturas. Con este fin, presentamos el diseño básico y la utilidad de una cámara de control de temperatura construido casa. Además, reflexionamos sobre la evaluación del estado de fase GUV, trampas asociada y cómo evitarlos.

Experimentos en fase separado unilaminar gigantes vesículas (2.fino) con frecuencia descuidan las condiciones de solución fisiológica. Este trabajo presenta enfoques para estudiar el efecto de tampón de alta salinidad en separación de la fase líquido-líquido en 2.fino multicomponente cargada como una función de asimetría de membrana trans-solución y la temperatura.

Comportamiento de la fase de vesículas cargadas en solución simétrica y asimétrica condiciones monitoreadas con microscopía de fluorescencia

Phase-separated giant unilamellar vesicles (GUVs) exhibiting coexisting liquid-ordered and liquid-disordered domains are a common biophysical tool to ...

El objetivo general de este protocolo es evaluar cuantitativamente el efecto de los ambientes de alta salinidad y la asimetría de la solución transmembranal presentes en condiciones fisiológicas sobre los estados de fase de la membrana. Las soluciones dentro y fuera de las células son muy diferentes. Nuestros métodos ayudan a comprender el efecto de la asimetría de la solución sobre las propiedades de la membrana y su comportamiento de fase.La principal ventaja de nuestro enfoque es que las vesículas pueden prepararse en condiciones fisiológicas de tampón y el dispositivo microfluídico puede utilizarse para crear condiciones de tampón asimétricas. Para comenzar el procedimiento, lije ligeramente una cara de una placa de PTFE con papel de lija fino. Lave la placa, un vial de vidrio de 15 mililitros y un recipiente de vidrio sellable con detergente comercial para lavavajillas, etanol y cloroformo.Utilice una jeringa de vidrio de 25 microlitros para depositar de 10 a 15 microlitros de solución madre de lípidos en cloroformo sobre el lado áspero de la placa de PTFE limpia y seca. Extienda la solución madre de lípidos con la aguja de la jeringa para crear una película uniforme de lípidos. Utilice pinzas para transferir la placa al vial de 15 mililitros.Caliente la placa a 60 grados Celsius y seque durante dos horas para evaporar el solvente. Luego, agregue agua desionizada a un recipiente de vidrio hasta una altura de aproximadamente un centímetro. Coloque el vial con la placa dentro del recipiente, asegurándose de que permanezca estable y en posición vertical, y selle el recipiente.Deje que la bicapa lipídica prehinche a 60 grados Celsius durante cuatro horas. Luego, retire el vial del recipiente. Aspire cinco mililitros de solución de hinchamiento en una jeringa de plástico y coloque un filtro de 0,45 micrómetros en la punta de la jeringa.Añada la solución de hinchamiento filtrada al vial para hidratar la película lipídica. Tape el vial y séllelo con una película de parafina plástica. Almacene el vial a 60 grados Celsius durante la noche para obtener el agregado de GUV.Enfríe las vesículas a temperatura ambiente dentro de una hora después de retirarlas del calor. Corte el extremo de una punta de micropipeta plástica de 200 microlitros para que el agregado de GUV pueda aspirarse dentro de la punta. Utilice la punta de pipeta recortada para transferir el agregado y 50 microlitros de solución de hinchamiento a un vial limpio y seco de dos mililitros.Agregue al vial 950 microlitros de solución de hinchamiento fresca o una solución isotónica para obtener condiciones simétricas o asimétricas, respectivamente. Aspire y expulse la mezcla varias veces con la pipeta y luego invierta suavemente el vial varias veces para resuspender las GUV. Para comenzar la evaluación, coloque una alícuota de la suspensión de GUV en un aislador de silicona sobre un portaobjetos para microscopio.Selle la cámara con una laminilla. Deje que la muestra se reequilibre durante cinco minutos. A continuación, coloque el portaobjetos en la platina de un microscopio de fluorescencia y adquiera imágenes de al menos 30 GUV por lote.Inspeccione las imágenes para determinar los estados de fase de las GUVs en la imagen. Las GUVs en un estado de fase líquida única serán esféricas y lisas, con una etiqueta fluorescente distribuida homogéneamente a través de la membrana. Las GUVs en un estado de dos fases, ordenada y desordenada, serán esféricas con una etiqueta fluorescente particionada en dominios con límites suaves dentro de la membrana.Verifique que los dominios sean libres de difundirse sobre las superficies de las vesículas y puedan coalescer. Las GUV en un estado de fase líquida sólida de dos o tres fases tendrán forma redondeada con algunos límites angulares. Los dominios líquidos sobre un fondo sólido no deben mostrar difusión, pero los dominios sólidos deben difundirse libremente sobre un fondo líquido.Una vez que se haya identificado el estado de fase de cada GUV en la imagen, determine el estado de fase predominante para el lote. Repita el proceso con muestras independientes si el estado de fase predominante representa una mayoría estrecha. Antes de utilizar el dispositivo microfluídico, prepare al menos cinco mililitros de cada solución de hinchamiento de sacarosa y sal.Filtre cada solución a través de un filtro de 0,45 micrómetros. A continuación, recorte los extremos de puntas de pipeta plásticas de 200 microlitros y coloque una punta de pipeta en cada canal del dispositivo. Añada al depósito del dispositivo 100 microlitros de solución de hinchamiento fresca y filtrada del mismo tipo utilizada para preparar las GUVs.Agregue cinco microlitros de la solución de hinchamiento a cada punta de pipeta. Centrifugue el dispositivo a 900 × g durante 10 minutos para llenar los canales del dispositivo. Luego, llene una jeringa de vidrio de un mililitro con la misma solución de hinchamiento filtrada.Conecte un tramo de tubo al jeringa. Pase la solución de hinchamiento a través del tubo hasta que el émbolo esté completamente presionado y el tubo esté lleno de solución. A continuación, conecte el tubo al canal de salida y monte la jeringa en una bomba de jeringa.A continuación, conecte la unidad de control de presión a las entradas del canal microfluídico. Asegúrese de que las válvulas estén cerradas y luego ajuste la presión a tres bares. Coloque el dispositivo microfluídico sobre la platina de un microscopio confocal invertido.Utilice una pipeta para retirar la solución de hinchamiento del depósito del dispositivo hasta que solo queden entre 25 y 50 microlitros de solución. Añada 150 microlitros de la suspensión de GUV al depósito y mezcle la suspensión mediante pipeteo suave. Ejecute la bomba de jeringa en modo de retracción a 10 microlitros por minuto durante 20 minutos o hasta que más del 90% de las trampas del dispositivo estén ocupadas.A continuación, abra las válvulas de la unidad de control de presión para cerrar las válvulas anulares en el dispositivo microfluídico. Detenga la bomba de jeringa y deje reposar el dispositivo durante una hora antes de adquirir imágenes confocales de las GUV en el dispositivo. A continuación, use una pipeta para retirar la suspensión de GUV del depósito, dejando únicamente entre 25 y 50 microlitros.Agregue al depósito 150 microlitros del otro tipo de solución de hinchamiento filtrada y pipetee suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo. Repita este proceso al menos cinco veces para reemplazar completamente la solución en el depósito. Ejecute la bomba de jeringa en modo de extracción a 10 microlitros por minuto durante 10 minutos para reemplazar la solución en los microcanales.A continuación, reduzca la velocidad de flujo a un microlitro por minuto. Cierre las válvulas de la unidad de control de presión durante dos segundos y luego abra las válvulas y detenga la bomba de jeringa. Deje reposar el dispositivo durante una hora antes de registrar las imágenes confocales.Para comenzar la preparación de la cámara de control de temperatura, primero conecte accesorios de tubo con punta a un ensamblaje de flujo de calor de aluminio que tenga ventanas de cubreobjetos de dos milímetros de espesor. Fije un espaciador de goma a uno de los cubreobjetos para formar la cámara de observación. Introduzca 100 microlitros de la suspensión de GUV en la cámara de observación y selle la cámara con un cubreobjetos.Invierta lentamente el conjunto. Conecte la cámara de aluminio a un baño de agua externo. Monte el conjunto sobre la platina de muestra del microscopio.Configure el baño de agua externo a la temperatura más baja deseada y deje que el sistema se equilibre durante 10 a 15 minutos. Adquiera imágenes de las GUV y determine los estados de fase a diversas temperaturas. Las GUV se prepararon a partir de diferentes proporciones de DOPG y esfingomielina de huevo y colesterol en soluciones simétricas de sacarosa o sal.Sus estados de fase dominantes se determinaron mediante microscopía de fluorescencia. Luego, se transfirieron composiciones seleccionadas a condiciones asimétricas mediante dilución para evaluar el efecto de las condiciones de solución sobre el comportamiento de fase. Para investigar más a fondo el comportamiento de fase de los GUV en soluciones asimétricas, se atraparon los GUV en un dispositivo microfluídico para permitir el intercambio completo de la solución externa.Las GUV atrapadas se evaluaron mediante microscopía confocal antes y después del intercambio de fluidos. Se monitoreó la fracción de GUV homogéneas frente a GUV con separación de fases a lo largo de un rango de temperaturas para evaluar el efecto de la temperatura sobre el comportamiento de fases de las GUV. Se observó un patrón sigmoideo en los datos, los cuales luego se ajustaron a un modelo de Boltzmann.La temperatura a la cual la fracción de GUVs separados por fases fue 0,5 se determinó a partir de la curva ajustada. Aunque este método puede proporcionar información sobre el comportamiento de fase de la membrana, las aplicaciones también pueden utilizarse para otros experimentos, como estudiar las interacciones entre membranas y biomoléculas en condiciones fisiológicas.

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Investigación

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Describimos un protocolo para la preparación de bicapas lipídicas soportadas y su caracterización utilizando microscopía de fuerza atómica y espectroscopía de fuerza.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Aquí se muestra la preparación de bicapas lipídicas planas funcionalizadas con proteínas, la determinación de la movilidad de las proteínas en su interior y la medición de las densidades de las proteínas. Se esboza una hoja de ruta para la construcción de un microscopio de reflexión interna total con reducción de ruido, que permite visualizar fluorocromos residentes de una sola capa con alta resolución espacio-temporal.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

A continuación, se presenta un protocolo para detectar eventos individuales, SNARE mediada por liposomas y de fusión entre bicapas soportadas en los canales de microfluidos utilizando TIRFM polarizado, con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución. Lípidos y liberación de carga solubles se pueden detectar de forma simultánea. tamaño de los liposomas, de difusividad de los lípidos, y poro de fusión propiedades se miden.

La fusión mediada por SNARE de proteoliposomas individual con bicapas soportadas atados en una celda de flujo de microfluidos supervisado por microscopía TIRF polarizada

Presentamos una técnica de micromanipulación sin contacto de vesículas, con gradientes del ion de calcio localizada. Microinyección de una solución de iones de calcio, en las cercanías de una vesícula lipídica gigante, se utiliza para remodelar la membrana lipídica, dando como resultado la producción de protuberancias tubulares de membrana.

Remodelación de membrana de vesículas gigantes en respuesta a gradientes del Ion de calcio localizada

Aquí, presentamos un protocolo para estudiar el mecanismo molecular de la translocación de protones a través de membranas lipídica de liposomas sola, usando citocromo bo3  como ejemplo. Combinación electroquímica y microscopia de fluorescencia, cambios en el pH en el lumen de las vesículas individuales, contienen solo o múltiples enzimas, puede ser detectado y analizado individualmente.

Medidas solo de liposomas para el estudio de enzimas de membrana bombas de protones usando electroquímica y microscopia fluorescente

El objetivo del protocolo es medir de forma fiable las propiedades mecánicas de membrana de las vesículas gigantes por aspiración de micropipetas.

Obtención de vesículas híbridas unilamelares gigantes por electroformación y medición de sus propiedades mecánicas por aspiración de micropipeta

Este protocolo describe la formación de vesículas unilipídicas y multilipídicas que imitan a las células, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Estos modelos in vitro se pueden adaptar para incorporar una variedad de tipos de lípidos y se pueden utilizar para investigar diversas interacciones de moléculas y macromoléculas.

Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares

La reconstitución libre de células ha sido una herramienta clave para comprender el ensamblaje del citoesqueleto, y el trabajo en la última década ha establecido enfoques para estudiar la dinámica de la septina en sistemas mínimos. Aquí se presentan tres métodos complementarios para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos de membrana: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla.

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Aprende a evaluar el comportamiento de fase de vesículas GUV bajo condiciones de alta salinidad y asimetría transmembrana usando microscopía de fluorescencia. Este método permite estudiar propiedades de membranas en condiciones fisiológicas.

Comportamiento de la fase de vesículas cargadas en solución simétrica y asimétrica condiciones monitoreadas con microscopía de fluorescencia (Video) | JoVE Journal

Comportamiento de la fase de vesículas cargadas en solución simétrica y asimétrica condiciones monitoreadas con microscopía de fluorescencia

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