Cuantificación de la información codificada por el Gene expresión niveles durante la vida útil modulación bajo amplia gama dieta restricción en C. elegans

El objetivo general de este marco es identificar los genes implicados en la restricción dietética de amplio rango, cuantificar la información ambiental codificada por sus niveles de expresión y comprender la estrategia de codificación subyacente que vincula el medio ambiente con la esperanza de vida. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología del envejecimiento, como qué genes transmiten información del medio ambiente para modular la esperanza de vida. Aunque este marco puede proporcionar información sobre el sistema sensorial de C. Elegan , también se puede aplicar de manera más general a cualquier sistema biológico cuyos componentes cooperen para procesar la información ambiental.

La principal ventaja de esta técnica es que cuantifica la información ambiental codificada por los grupos de neuronas y determina la estrategia de codificación empleada por los neuroselquites para transmitir esta información a los objetivos posteriores. Después de cultivar OP50 en placas MGM de acuerdo con el protocolo de texto, prepare 500 mililitros de medio LB en cada uno de los matraces erlenmeyer de dos litros y autoclave. Inocular cada matraz con una sola colonia de OP50 y cultivar los cultivos a 37 grados centígrados y 200 RPM durante unas 14 horas.

A continuación, suplementar los cultivos con 50 microgramos por mililitro de estreptomicina. A continuación, agite los matraces durante 30 minutos más a 37 grados centígrados, antes de colocar los matraces en hielo durante 15 minutos. Transfiera 450 mililitros de cada cultivo a botellas de centrífuga estériles separadas de 500 mililitros, conserve el cultivo sobrante en hielo, ya que se utilizará para determinar la concentración de las bacterias.

Gire las botellas a 4500 x G y cuatro grados centígrados durante 25 minutos, luego deseche el sobrenadante y guarde las botellas en hielo. Con 900 microlitros de LB estéril, diluya 100 microlitros de cultivo sobrante de cada matraz. Utilice un mililitro de LB estéril para poner a cero el espectrofotómetro y, a continuación, determine el OD600 de la dilución de 10 veces de cada cultivo.

Si, por ejemplo, el OD600 de la dilución de 10 veces del cultivo nocturno es 0,28, entonces el cultivo tenía un OD600 real de 2,8. A partir de este ejemplo, para llegar a una solución madre de trabajo de 1,12 x 10 a la décima célula OP50 por mililitro, lo que equivale a un OD600 de 56, vuelva a suspender el pellet del cultivo de 450 mililitros en una vigésima parte del volumen original o 22,5 mililitros de solución basal estéril de S o SB, suplementada con 50 microgramos por mililitro de estreptomicina. Efectúe todas las concentraciones subsiguientes utilizadas en los experimentos con SB y estreptococos, a partir de diluciones en serie del material de trabajo, utilizando los factores de dilución enumerados en esta tabla.

Después de cultivar y sincronizar las cepas reporteras de C Elegans de acuerdo con el protocolo de texto, use 15 mililitros de SB para lavar en serie los gusanos de las tres placas y recoja el líquido en un tubo estéril de 15 mililitros. Permita que las larvas L4 sedimenten naturalmente y luego aspiren todo menos aproximadamente 0,5 mililitros del líquido. En las cepas reporteras de tipo salvaje, este tipo elimina cualquier larva más joven que L4.In antecedentes mutantes, este paso ayuda en la eliminación de cualquier larva detenida, como la nuestra, en el caso de muertes de un OK3125.

A continuación, use nueve mililitros de SB para volver a suspender los gusanos. Una vez más, controle la velocidad de sedimentación de las larvas L4 y luego aspire todo menos aproximadamente 0,5 mililitros del sobrenadante una vez que la mayoría de las larvas L4 se hayan granulado antes de repetir el proceso. Añadir 10 microlitros de medio basal S estéril, suplementado con F127 plurónico al 0,1% al líquido que contiene las larvas L4.

Esto actúa como tensioactivo y evita que las larvas se adhieran a la superficie interior de las puntas de pipeta de plástico. Con una punta de pipeta de baja retención P200, vuelva a suspender suavemente las larvas y, a continuación, alícuota 150 microlitros en tres placas de ARNi de 10 centímetros que se siembran con 5 x 225 microlitros de bacterias de ARNi de huevo cinco. Asegúrese de que los gusanos se distribuyan por igual en los cinco céspedes bacterianos.

Una vez que el líquido se haya absorbido en el agar, retire las larvas no L4 de las placas que no hayan sido eliminadas por el procedimiento de lavado, retirándolas manualmente. Luego guarde los platos a 20 grados centígrados durante 24 horas. Para iniciar una RD de amplio rango, recoja cualquier larva joven que haya escapado del paso de eliminación manual anterior, dejando solo a los adultos de un día en las placas.

Para cada cepa, use 15 mililitros de estreptococo SB estéril, para lavar a los adultos de un día de edad de las tres placas, en un tubo de 15 mililitros. Permita que las lombrices se sedimenten naturalmente y luego aspire todo menos 0,5 mililitros del sobrenadante. Vuelva a suspender los gusanos con 9,5 mililitros de estreptococo SB y repita los pasos de sedimentación y lavado.

Después del lavado final y la aspiración de todo el sobrenadante, excepto 0,5 mililitros, agregue 10 microlitros de SB Plu y use una punta de pipeta P200 para volver a suspender suavemente las larvas. Alícuota de 100 microlitros de las larvas en una placa NSC, sembrada con 5 x 225 microlitros de bacterias, a una concentración de 2 x 10 a la novena celda por mililitro. Distribuya los 100 microlitros de manera uniforme en los cinco céspedes de bacterias.

Bajo un microscopio, estime el número de animales presentes en la placa, apuntando a entre 100 y 150 gusanos por placa. Determine el volumen de líquido requerido para lograr una densidad de gusano dentro de este rango y luego alícuota en dos placas adicionales. Ajuste el número de gusanos en la primera placa para que también caigan en este rango.

Y luego guarde las placas a 20 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, recoja los adultos de dos días de edad y distribuya los gusanos a nuevas placas de NSC sembradas con el deseo de experimentar la concentración de alimentos. Una vez que el líquido se haya absorbido en el agar, cambie las placas a la temperatura experimental deseada durante 24 horas.

Al día siguiente, recoja a los adultos de tres días y distribúyalos en platos frescos de NSC, sembrados con la misma concentración experimental de alimento. Una vez que el líquido se absorbe en el agar, devuelva las placas a la temperatura experimental durante 48 horas. Por último, utilice un dispositivo microfluídico para obtener imágenes de los animales antes de ensamblar y cuantificar los datos de acuerdo con el protocolo de texto.

Como se muestra aquí, la vida media de la cepa n2 de tipo salvaje muestra una respuesta compleja a la DR de amplio rango. La magnitud de esta respuesta se atenúa en un mutante del gen daf-7, lo que sugiere que este gen afecta la capacidad del gusano para responder correctamente a los cambios en la abundancia de alimentos. Los niveles medios de expresión de un reportero transcripcional para el gen daf-7 y el fondo de tipo salvaje, también muestran una respuesta compleja no monótona a una amplia gama DR.In el fondo genético daf-7(, la expresión de este reportero transcripcional está altamente atenuada y muestra poca respuesta a los cambios en el nivel de alimentos. Esta figura ilustra la estimación de la distribución conjunta de la expresión de TPH1 en las neuronas ADF y la expresión de daf-7 en las neuronas ASI para un nivel de alimento dado.

Estos gráficos de barras presentan la información alimentaria codificada, ya sea combinatoria o individualmente, por las neuronas ADF, ASI y NSM, en función de los niveles de expresión génica de TPH1 y daf-7. Caracteres redundantes y sinérgicos de la codificación, resultado de la comparación entre la información combinatoria e individual codificada por las neuronas representadas por la diferencia de altura de las barras apiladas a la derecha y la información codificada por el circuito completo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la replicación de la teoría de la información para cuantificar la estrategia de codificación requiere una estimación precisa de las distribuciones de expresión génica.

Por esta razón, el tamaño de la muestra es un factor crítico para la aplicabilidad general de este marco. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de restricción dietética de amplio espectro para identificar y caracterizar nuevos genes que vinculan la abundancia de alimentos con la esperanza de vida.