Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

En este artículo se presenta un protocolo general para medir la duración de la vida de los nematodos mantienen en medios sólidos con UV-muertos alimentaria bacteriana.

Con el fin de medir la esperanza de vida en C Elgan, se genera una población sincronizada por edad utilizando un lang de huevos cronometrado reproductivamente. Los gusanos hermafroditas adultos activos se transfieren a placas de medios de crecimiento de nematodos sembrados con E. coli muerta por rayos UV, se les permite poner huevos durante seis a ocho horas y luego se retiran durante los próximos dos días, los gusanos eclosionan de estos huevos y crecen hasta la etapa larvaria L cuatro. Los cuatro gusanos L se transfieren a nuevas placas NGM que contienen ampicilina para evitar la contaminación bacteriana viva y FUDR para evitar la reproducción y se les permite convertirse en adultos.

A partir de este momento, los gusanos adultos se observan cada dos o tres días hasta que todos los gusanos han muerto. En cada punto de tiempo, los gusanos muertos se retiran de la placa y se registra el número de gusanos vivos y muertos. Soy George Seton, del laboratorio de Matt Capline en el Departamento de Patología de la Universidad de Washington.

Hoy vamos a mostrarte cómo medir la esperanza de vida y ver nuestra elegancia contra la hepatitis. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la genética del envejecimiento. Así que comencemos.

Un experimento básico de vida útil requiere dos tipos de placas, las placas NGM estándar, que no contienen aditivos, y las placas AMP FUDR, que tienen ampicilina y fluorodesoxiuridina añadidas a la NGM. Ambos tipos de placas están asentadas con la bacteria E. coli OP 50, que posteriormente se mata por la exposición a los rayos UV. Comience preparando 10 mililitros de solución de NGM.

Por placa de Petri de 60 milímetros, derrita completamente NGM sólido mediante microondas en alto en pulsos 32. Gire el medio entre los pulsos para evitar que se acumulen burbujas de gas presurizadas, coloque el NGM líquido en un baño de agua a 55 grados Celsius o en el banco para permitir que el medio se enfríe. Una vez que el medio se haya enfriado a 55 grados centígrados, momento en el que debería poder sostener cómodamente el recipiente de vidrio con las manos desnudas, está listo para que se le agreguen medicamentos.

Y para verter los platos para platos con medicamentos, agregue 33 microlitros de 150 milimolares FUDR y 100 microlitros de 100 miligramos por mililitro. La ampicilina por 100 mililitros de NGM y el remolino para mezclar la ampicilina se utiliza para evitar la contaminación bacteriana extraña y FUDR para evitar que los huevos eclosionen. Por lo tanto, no será necesario transferir los gusanos cada pocos días para separarlos de las larvas en crecimiento.

Ahora vierta el medio y deje que las placas se sequen en el banco durante dos días el día antes de que las placas terminaran de secarse el cultivo líquido LB de semillas con una sola colonia de una raya fresca de e. coli. Bacterias OP 50 en barrena LB. Prepare al menos 0,5 mililitros de cultivo por plato de 60 milímetros.

Coloque el cultivo OP 50 en un agitador a 37 grados centígrados y deje que las bacterias crezcan durante la noche. Al día siguiente, granule el OP 50 bacterias con 3.500 g de fuerza centrífuga durante 10 minutos. Decantar una cantidad suficiente del sobrenadante para resuspender las bacterias a una concentración de 10 veces.

Ahora inocule cada placa con 100 microlitros del cultivo concentrado. Evite tocar la superficie de la NGM con la punta de la pipeta, ya que los defectos en la superficie del medio permitirán que los gusanos excaven placas de remolino hasta que las bacterias cubran el área central de la NGM sin acercarse a las paredes de la placa y dejen que las placas se sequen en el banco durante 24 horas. Una vez secas, exponemos la superficie de las placas a una dosis UV lo suficientemente fuerte como para detener el crecimiento bacteriano, utilizamos un gen de estratos UV straddle linker 2, 400.

Comience cargando las placas en la carretilla pórtico sin las tapas puestas. Ahora presione energía. Introduzca 9 9 9 9 en el teclado y pulse start.

Las placas estarán expuestas a los rayos UV durante aproximadamente cinco minutos. Las placas con bacterias muertas por los rayos UV se pueden almacenar boca abajo a cuatro grados centígrados hasta por un mes. En esta sección se describe cómo generar una población de gusanos con una fecha de eclosión común.

Comience transfiriendo aproximadamente 20 gusanos adultos jóvenes a una placa NGM fresca sin medicamentos. Deje el plato a 25 grados centígrados durante aproximadamente una semana para permitir que los gusanos se propaguen y se coman todo el alimento bacteriano en una semana. Los gusanos recién eclosionados en la etapa de dote detenida deben aparecer transferidos de 20 a 30 larvas de dote a una placa de NGM fresca sin medicamentos e incubarlas a 25 grados centígrados en presencia de alimento.

Las larvas de dote se convertirán en adultos reproductivamente activos en dos días y permanecerán reproductivamente activas durante unos días después. Ahora transfiera de 10 a 15 de los adultos reproductivamente activos a una placa de NGM fresca sin medicamentos. Esta placa se conoce como puesta de huevos cronometrada o placa TEL.

Deje la placa TEL a 25 grados centígrados para que los gusanos puedan poner huevos. Los animales que eclosionen de estos huevos serán los animales de experimentación y su esperanza de vida se marcará después de seis horas. Inspeccione la placa TEL en busca de huevos.

Si aún no hay suficientes huevos, deje la placa TEL a 25 grados centígrados hasta por un total de 24 horas. Revisar periódicamente si hay huevos. Cuando se haya puesto un número suficiente de huevos, retire los adultos de la placa TEL.

Un experimento típico de vida útil requerirá de 30 a 90 huevos por grupo experimental, pero se pueden generar varios cientos de huevos en una sola placa TEL. Aproximadamente 150 huevos serán puestos por 10 a 15 adultos reproductivamente activos en seis a ocho horas. Al comparar grupos experimentales, se puede lograr significación estadística para grandes diferencias en la esperanza de vida con tan solo 30 animales.

Se deben usar más animales para distinguir diferencias más modestas. Ahora coloque la placa TEL sin adultos a 20 grados centígrados hasta que los huevos eclosionen y los gusanos se hayan desarrollado a la etapa larvaria L cuatro. Esto suele tardar dos días para la elegancia de tipo C salvaje, pero puede llevar más tiempo para las cepas con fenotipos de desarrollo lento.

En esta sección se describe cómo seguir la vida de una población sincronizada por edad. Primero, transfiera la larva L four de la placa TEL a las placas AMP FUDR sentadas. Para cada cepa o condición que se está probando, es típico colocar dos o tres placas con 25 a 30 gusanos por placa.

Incubar las placas AMP FUDR a 20 grados centígrados durante 24 horas. Y luego evalúe visualmente los gusanos, los medios y las bacterias transfieren los gusanos a las placas AMP FUDR frescas. Si los gusanos han comido la mayor parte de la comida bacteriana, esto generalmente ocurrirá una o dos veces por semana.

Al principio del experimento, si hay un número significativo de larvas presentes, esto generalmente indica que los gusanos fueron transferidos a las placas AMP FUDR como adultos jóvenes en lugar de como L cuatro. Los adultos jóvenes pueden poner huevos antes de que el FUDR haga efecto, y ocasionalmente las larvas escapan de los efectos del FUDR y se convierten en adultos. Estas larvas confundirán el experimento en esta situación, transferirán los gusanos adultos a platos frescos y desecharán los platos viejos que contienen las larvas.

Los gusanos también deben transferirse a platos frescos si se observan bacterias vivas en crecimiento. Por lo general, la combinación de AMP y eliminación de UV asegurará que ninguna bacteria viva contamine el experimento, pero ocasionalmente ocurre. Además, transfiere los gusanos.

Si se observa crecimiento de hongos en los medios. Si se detecta a tiempo, los hongos se pueden cortar con una punta de pipeta o una espátula. Una vez que crece hasta ser más grande que unos pocos milímetros de diámetro, generalmente es más fácil transferir los gusanos a una nueva placa.

Puntúa la vida útil de todos los gusanos cada dos o tres días. Usar un endoscopio de disección. Determina si cada gusano está vivo o muerto.

Golpee suavemente la placa. El gusano está vivo si se mueve en respuesta a los golpecitos. Si el gusano no responde al golpeteo de la placa, acérquese a la región de la cabeza, golpee suavemente la cabeza del gusano con una púa de transferencia de platino.

Marca el gusano como muerto. Si no responde moviendo la cabeza, retire el gusano muerto del plato. Después de revisar todos los gusanos, registre la fecha y el número de gusanos que están vivos y muertos.

Los gusanos mantenidos en medios sólidos ocasionalmente escaparán de la superficie de la placa excavando o arrastrándose por la pared. Los gusanos que huyen se omiten por completo del estudio. Cuando termine, regrese las placas a la incubadora a 20 grados centígrados.

Espere otros dos o tres días y luego vuelva a revisar las placas. Continúa este régimen hasta que todos los gusanos hayan muerto. El número de lombrices que mueren cada día generalmente se invierte para calcular la proporción de gusanos vivos en cada día, estos datos se trazan gráficamente como una curva de supervivencia con el día de la puesta de huevos cronometrada considerado.

Día cero. La mediana de vida típica para N dos. La cepa de tipo salvaje de Sea elgan mantenida en bacterias matadoras con rayos UV a 20 grados Celsius es de aproximadamente 25 días medidos a partir del huevo.

Acabamos de mostrarte cómo medir la esperanza de vida y ver la elegancia. Puede modificar este procedimiento básico para probar una variedad de condiciones ambientales, incluida la restricción dietética y la interferencia de ARN, que se analiza en el texto de apoyo. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tu experimento.