Name: Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Aprenda a medir la longevidad en Caenorhabditis elegans utilizando medios sólidos con bacterias E. coli inactivadas por UV. Este protocolo permite sincronizar poblaciones y monitorear la mortalidad de gusanos adultos de manera sistemática.

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Este trabajo fue apoyado por una Glenn / AFAR avances en la concesión de Gerontología y Subvenciones del NIH 1R01AG031108-01 a MKGS es apoyado por el NIH formación conceder P30AG013280. MK es una Ellison Medical Foundation de Nueva Académico en el envejecimiento.

Parte 1: Preparar nematodo crecimiento de los medios (NGM) placas En esta sección se describe la preparación de los platos NGM sólida para su uso en el experimento de vida. Un experimento de vida útil básica requiere dos tipos de placas: las placas estándar NGM, que no contienen aditivos, y las placas Amp / FUDR, que tienen la ampicilina (Amp) y fluorodesoxiuridina (FUDR) añadido a la NGM. La ampicilina se utiliza para prevenir la contaminación bacteriana externa. FUDR inhibe la división celular, reduce la producción de huevos, y evita que los huevos de incubar. El uso de FUDR para el análisis de la longevidad no afecta vida adulta y elimina la necesidad de transferir los gusanos cada pocos días con el fin de separarlos de la larva en crecimiento. Ambos tipos de placas se siembran con E. coli OP50 bacterias, que posteriormente asesinado por la exposición a los rayos UV. <ol><li> Prepare NGM (véase la Sección 5 de la receta y notas de almacenamiento) y placas de identificación de Petri. Usted tendrá una placa de Petri de 60 mm por cada 10 ml de NGM. Si usted está comenzando con NGM previamente preparados sólidos, continúe con el paso 1.2. Si usted está comenzando con NGM recién autoclave, vaya al paso 1.4. </li><li> Fundir completamente NGM sólida en el microondas en alto en 30 pulsos de segundo. Los medios de comunicación remolino entre los pulsos para evitar burbujas de gas a presión se acumule. </li><li> NGM en lugar de líquido 55 ° C baño de agua o en el banco que se enfríe. </li><li> Una vez NGM alcanza los 55 ° C añadir 33 l de FUDR 150 mm y 100 L de 100 mg / ml de ampicilina por cada 100 ml NGM (por Amp / FUDR placas) y agitar para mezclar. Para placas NGM sin medicamentos adicionales vaya directamente al paso 1.5. </li><li> Utilizando una técnica estéril, pipeta de 10 mL en cada NGM 60 mm placa de Petri. Evitar la formación de burbujas, si es posible. Si se forman burbujas, que se pueden hacer estallar con una punta de la pipeta. </li><li> Deja los platos en la mesa con tapa para permitir que el NGM para solidificar y secar. Si es posible, dejar las placas en el banco durante 2 días antes de la adición de bacterias, pero un día va a funcionar si las placas son necesarios antes. </li><li> El día antes de terminar de secar los platos, líquido de semilla cultura LB con una colonia de una racha dulce de E. coli OP50 bacterias en agar LB. Usted debe preparar por lo menos 1 ml de una noche a la mañana OP50 cultura por placa de 60 mm. </li><li> Lugar OP50 cultura en 37 ° C agitador y permitir que las bacterias crecen durante la noche (la cultura debe llegar a la saturación). </li><li> Pellet OP50 bacterias al girar a 3.500 g durante 10 minutos. </li><li> Eliminar el 90% de las bacterias sobrenadante y resuspender a concentrar la cultura de 10x. </li><li> Pipetear 100 L de 10x concentrada OP50 la cultura en el centro de las placas NGM solidificado. Placas de agitar suavemente para extender cultivo de bacterias, si es necesario (lo ideal bacteria debe cubrir el área central de la NGM sin llegar cerca de las paredes de placas). Trate de no tocar la punta de la pipeta a la superficie de la NGM, como defectos en la superficie de los medios de comunicación permiten que las lombrices se introducen en la NGM. </li><li> Deja los platos en la mesa durante la noche para permitir que la cultura bacterias se seque en la NGM sólida (por lo general tarda aproximadamente 24 horas). </li><li> Una vez seco, exponer la superficie de las placas a una dosis UV suficiente para detener el crecimiento de las bacterias. Si estás utilizando un Stratalinker UV Stratagene 2400: <ul><li> Coloque las placas en la Stratalinker y quite las tapas </li><li> Cierre la puerta y encender el Stratalinker </li><li> "Energía" de prensa </li><li> Introduzca '9999 'usando el teclado </li><li> "Inicio" de prensa </li><li> Las placas estarán expuestas a los rayos UV durante unos 5 minutos </li></ul></li><li> Las placas con las bacterias muertas por UV se pueden almacenar al revés a 4 ° C durante un máximo de un mes. </li></ol> Parte 2: Realizar un huevo de tiempo por la que se adquieren a una edad sincronizado población de animales En esta sección se genera una población de gusanos con una escotilla común-la fecha. Esto se logra al permitir que los adultos reproductivamente activas para poner los huevos en un plato por un período definido de tiempo y permitiendo que los huevos para desarrollarse. <ol><li> (Opcional) Transferencia de aproximadamente 20 gusanos adultos jóvenes a una placa de NGM fresco sin FUDR. Deja las placas a 25 ° C a fin de que los gusanos se propaguen y que comer a través de todo el alimento de bacterias. Después de la comida bacteriana que se ha consumido gusanos recién nacidos entrará en la etapa de crecimiento arrestado Dauer. Usted empezará a ver larva Dauer todo dentro de una semana, dependiendo de cómo muchos gusanos que transfiera a la placa inicial. Dauer larvas se pueden utilizar para los próximos pasos para un máximo de un mes. </li><li> (Opcional) Transferencia de 20 a 30 Dauer larva de una placa de NGM fresco sin FUDR. En presencia de alimentos larva Dauer se convertirán en adultos reproductivamente activas dentro de 2 días y siguen siendo reproductivo activos por unos pocos días después a 25 ° C. </li><li> Transferencia de 10 a 15 adultos reproductivamente activos a una placa de NGM fresco sin FUDR. Este plato se conoce como la puesta de huevos tiempo (TEL) de placas. </li><li> Deje la placa de TEL a 25 ° C durante 6 horas a fin de que tque el tiempo los gusanos para poner sus huevos. </li><li> Eliminar los gusanos adultos de la placa TEL. Placa puede ser inspeccionada visualmente para detectar los huevos antes de retirar los adultos. Si los gusanos no han establecido un número suficiente de huevos de la placa de TEL se puede dejar a 25 ° C hasta un total de 24 horas antes de la eliminación de los gusanos adultos. </li><li> Coloque la placa de TEL a 20 ° C hasta que los huevos han eclosionado y los gusanos se han desarrollado hasta la etapa larval L4 (esto por lo general, toma 2 días de tipo silvestre de C. elegans, pero puede tomar más tiempo para las cepas con fenotipos de desarrollo lento). </li></ol> Parte 3: Puntuación de los animales vida En esta sección seguimos la edad sincronizado población de gusanos en la parte 2 hasta que mueren. Los gusanos se mantienen en Amp / FUDR placas para evitar que la producción de huevos y la contaminación bacteriana y se considera muerto cuando no responden a los estímulos externos. <ol><li> Transferencia L4 larva de semillas Amp / FUDR placas. Para cada cepa o afección que se estudia, es típico para configurar 2-3 placas con 25 a 30 gusanos por placa. Imágenes de la C. etapas de la vida elegans se proporcionan para los de referencia (Figura 1) 1. </li><li> Lugar Amp / FUDR placas a 20 ° C durante 24 horas. </li><li> Después de 24 horas, visualmente evaluar los gusanos, los medios de comunicación, y las bacterias. Transferencia de gusanos a un nuevo amplificador / FUDR placas si alguno de los siguientes se observa: <ul><li> Los gusanos se han comido la mayoría de los alimentos bacteriana. A principios de los gusanos experimento duración de la vida tendrá que ser transferido 1 a 2 veces a la semana para evitar que las bacterias están agotando. </li><li> Un número significativo de larvas presentes. Esto es generalmente un indicio de que los gusanos fueron trasladados a las placas Amp / FUDR como adultos jóvenes en lugar de L4s y fueron capaces de poner unos huevos antes de la FUDR entró en vigor. El FUDR suele prevenir las larvas de llegar a ser adultos completa, pero de vez en cuando unos pocos se convierten en adultos y se confunden con los animales de experimentación. </li><li> Bacterias vivas / cada vez se observan. En general, la combinación de amplificador y UV-matar se asegurará de que ninguna bacteria viva contaminar el experimento, pero a veces ocurre. </li><li> El crecimiento de hongos que se observa en los medios de comunicación. Si se detecta a tiempo, el crecimiento de hongos por lo general se puede cortar con una punta de la pipeta o una espátula. Una vez que crece hasta ser más grande que unos pocos milímetros de diámetro, por lo general es más fácil de transferir a los gusanos a una nueva placa. </li><li> Utilizar las posibilidades que la disección, determinar si cada gusano está vivo o muerto. </li><li> Golpear suavemente la placa. El gusano está vivo si se mueve en respuesta a la interceptación. </li><li> Si el gusano de ellos no responden a tocar la placa, zoom en la región de la cabeza. </li><li> Golpee suavemente la cabeza del gusano con el pico de platino de transferencia. Puntuación del gusano como muerta si no responde moviendo su cabeza. </li><li> Gusanos muertos pueden ser retirados de la placa. </li></ul></li><li> Anote la fecha y el número de gusanos que están vivos y los muertos. </li><li> Volver placas a 20 ° C. </li><li> Repita los pasos 3.3 a 3.6 cada 2 ó 3 días hasta que todos los gusanos han muerto. </li></ol> Parte 4: Los resultados representativos. Los datos en bruto producido por un experimento de nematodos vida es una lista de fechas con los números correspondientes de los gusanos que están vivos y los muertos de cada cepa ensayada. El número de gusanos que se mueren cada día suele ser invertido para calcular la proporción de gusanos vivos en todos los días (Figura 2A), que se representa gráficamente como una curva de supervivencia (Figura 2B, el día de la puesta de huevos tiempo se considera el día 0 ). La esperanza de vida para cada individuo del gusano en el estudio se puede calcular a partir del recuento de los gusanos que mueren cada día y se utiliza para el cálculo de tiempo de vida media y la mediana para la comparación entre las cepas. El recuento del número de gusanos vivos en cada día no se utiliza directamente en el análisis de vida útil. Gusanos mantenidos en medios sólidos de vez en cuando 'huir', o se arrastran hacia arriba la pared de la placa o por debajo de la media. El número de gusanos vivos en cada día se puede utilizar para determinar cómo los gusanos, muchos huyeron a lo largo del experimento. Gusanos que huyen normalmente se extirpan de análisis. Como punto de referencia, la duración de vida típica de la mediana de N2, el C. elegans cepa de tipo salvaje, mantenidos en el UV-mató a las bacterias a 20 ° C es de aproximadamente 25 días como medida de huevo. Parte 5: Soluciones <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Nematodo de crecimiento de los medios (NGM), 100 ml: </td></tr><tr><td colspan="2"> Combine: </td></tr><tr><td> 0,3 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,25 g </td><td> Peptona </td></tr><tr><td> 2 g </td><td> Agar </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave durante 40 minutos y dejar enfriar a 55 ° C, a continuación, añadir: </td></tr><tr><td> 100 L </td><td> 1 M MgSO 4 </td></tr><tr><td> 100 L </td><td> 5 mg / ml de colesterol </td></tr><tr><td> 100 L </td><td> 1 M de CaCl2 </td></tr><tr><td> 1.625 ml </td><td> 1,5 M pH 6,0 KPI </td></tr><tr><td colspan="2"> NGM líquido puede ser utilizado de inmediato para verter en las placas o se deja solidificar y se almacenan a largo plazo a temperatura ambiente </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Caldo Luria (LB), 1 litro: </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> BactoTryptone </td></tr><tr><td> 5 g </td><td> Extracto de levadura </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> 1 M Tris pH 8,0 </td></tr><tr><td> 1 L </td><td> agua desionizada </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave y almacenar a temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M MgSO 4, 300 ml: </td></tr><tr><td> 73,95 g </td><td> MgSO4 </td></tr><tr><td> 300 ml </td><td> agua desionizada </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave y almacenar a temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 5 mg / ml de colesterol, 200 ml: </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> colesterol </td></tr><tr><td> 200 ml </td><td> 100% de etanol </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtro de esterilizar y almacenar a temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M CaCl 2, 500 ml: </td></tr><tr><td> 27,75 g </td><td> CaCl2 </td></tr><tr><td> 500 ml </td><td> agua desionizada </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtro de esterilizar y almacenar a temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1,5 M pH 6,0 KPI, 1L: </td></tr><tr><td colspan="2"> Combine: </td></tr><tr><td> 31,4 g </td><td> KPI dibásico </td></tr><tr><td> 179,6 g </td><td> KPI monobásico </td></tr><tr><td> 850 ml </td><td> agua desionizada </td></tr><tr><td colspan="2"> Calor mientras se mezcla para permitir KPI en disolverse. Ajustar el pH a 6.0 con NaOH 10 N. </td></tr><tr><td colspan="2"> Añadir agua desionizada hasta 1 L. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave y almacenar a temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M Tris, pH 8,0: </td></tr><tr><td> 60,57 g </td><td> Tris </td></tr><tr><td> 400 ml </td><td> agua desionizada </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajustar el pH a 8.0 con HCl. </td></tr><tr><td colspan="2"> Añadir agua desionizada hasta 500 ml. </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtro de esterilizar y almacenar a temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 150 mM fluorodesoxiuridina (FUDR), 10 ml: </td></tr><tr><td> 0,3693 g </td><td> FUDR </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> agua destilada estéril </td></tr><tr><td colspan="2"> Almacenar a -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 100 mg / ml de ampicilina (Amp), 10 ml: </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> Ampicilina </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> agua destilada estéril </td></tr><tr><td colspan="2"> Almacenar a -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 50 mg / ml carbenicilina (CARB), 10 ml: </td></tr><tr><td> 500 mg </td><td> Carbenicilina </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> agua destilada estéril </td></tr><tr><td colspan="2"> Almacenar a -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M isopropílico β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), 10 ml: </td></tr><tr><td> 2,38 g </td><td> IPTG </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> agua destilada estéril </td></tr><tr><td colspan="2"> Almacenar a -20 ° C. </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/1152/Figure%201.png" alt="la figura 1"> Figura 1. Imágenes de campo claro de la C. elegans etapas de la vida, incluyendo huevos, de los cuatro estadios larvales (L1 - L4) y adulto. Todos los paneles muestran hermafroditas, excepto la esquina inferior derecha, que muestra a un hombre adulto (Imagen de madera (1988)). <img src="/files/ftp_upload/1152/Figure%202.png" alt="la figura 2"> Figura 2. Los resultados representativos de una C. la vida elegans experimento lapso comparar salvaje N2 tipo de cepa a cepa que contiene una mutación en el gen daf-2. (A) Una tabla que muestra los datos recogidos, incluyendo el número de días desde que los gusanos fueron los huevos, el número de gusanos muertos observados cada día, y el porcentaje de la muestra original que permanecen vivos en cada día (calculada a partir de los recuentos diarios de los gusanos muertos) . (B) Supervivencia curvas correspondientes a los datos de vida útil previsto en (A). <imgsrc alt='"figura'></imgsrc> Figura 3. Comparación Representante de la lipofuscina entre adultos jóvenes y viejos C. elegans. Imágenes brillantes de campo se muestran a la izquierda y DAPI imágenes del canal de fluorescencia a la derecha. Los paneles superiores muestran un gusano de 4 días de edad y paneles inferiores muestran un gusano de 11 días de edad (medida a partir de huevo).

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</ol>

El control genético de la longevidad se ha estudiado extensamente en C. elegans, en gran parte debido a la facilidad y rapidez con que puede ser tiempo de vida determinado. El protocolo discutido en este artículo se describe un marco básico para la obtención de datos reproducibles esperanza de vida en C. elegans y también se puede aplicar a las especies relatednematode. 2 Al hacer algunos cambios sencillos estos procedimientos pueden ser adaptados para medir duración de la vida bajo una vari...

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Reactivo</td><td>MidSci</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>BactoTryptone</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3 (211705)</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptona</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9699248 (1332-01)</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilina</td><td>Reactivo</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C75209</td><td></td></tr><tr><td>Fluorodesoxiuridina (FUDR)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Isopropilo &amp;#946;-d-Tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Reactivo</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C5</td><td></td></tr><tr><td>KPi dibásico</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>5087862 (3252-01)</td><td></td></tr><tr><td>KPi monobásico</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>5087861 (3246-01)</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9561800 (2500-01)</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>S251</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr></tbody></table>

medición caenorhabditis elegans duración de la vida en el medio sólido

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

El envejecimiento es un proceso degenerativo caracterizado por un deterioro progresivo de los componentes celulares y orgánulos que resulta en la mortalidad. El nematodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Se ha convertido en un modelo principal utilizado para estudiar la biología del envejecimiento. Debido a que prácticamente todos los subsistemas biológico sufre deterioro funcional que aumenta la edad, duración de la vida es el objetivo primario de interés cuando se considera la tasa total de envejecimiento. En los nematodos, esperanza de vida se define normalmente como el número de días que un animal sigue siendo sensible a los estímulos externos. Los nematodos pueden propagarse, ya sea en medios líquidos o en el medio sólido en placas, y se han desarrollado técnicas para medir la duración de la vida en ambas condiciones. Aquí se presenta un protocolo generalizado para medir la duración de la vida de los nematodos mantienen en medios sólidos nematodo crecimiento y alimentados con una dieta de muertos UV-bacterias. Estos procedimientos se pueden adaptar fácilmente para abarcar ensayo de la vida bajo diversas condiciones comunes, incluyendo una dieta a base de bacterias vivas, la restricción dietética, y la interferencia de ARN.

En este artículo se presenta un protocolo general para medir la duración de la vida de los nematodos mantienen en medios sólidos con UV-muertos alimentaria bacteriana.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

El envejecimiento es un proceso degenerativo caracterizado por un deterioro progresivo de los componentes y orgánulos celulares que desemboca en la mortalidad. El nematodo ...

Para medir la longevidad en C. elegans, se genera una población sincronizada por edad mediante una puesta de huevos controlada en el tiempo. Se transfieren gusanos hermafroditas adultos activos a placas de medio de crecimiento para nematodos sembradas con E. coli inactivada por UV, se les permite poner huevos durante seis a ocho horas y luego se eliminan. Durante los dos días siguientes, los gusanos eclosionan de estos huevos y crecen hasta el estadio larval L4. Los gusanos L4 se transfieren a nuevas placas NGM que contienen ampicilina para prevenir la contaminación bacteriana viva y FUDR para evitar la reproducción, y se les permite desarrollarse hasta la etapa adulta.A partir de este momento, los gusanos adultos se observan cada dos o tres días hasta que todos los gusanos hayan muerto. En cada punto temporal, se retiran los gusanos muertos de la placa y se registra el número de gusanos vivos y muertos. Soy George Seton del laboratorio de Matt Capline en el Departamento de Patología de la Universidad de Washington.Hoy les vamos a mostrar cómo medir la longevidad y observar nuestra elegancia hepática. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la genética del envejecimiento. Así que comencemos.Un experimento básico de duración de vida requiere dos tipos de placas: placas NGM estándar, que no contienen aditivos, y placas AMP FUDR, que tienen añadidos ampicilina y fluorodesoxiuridina al NGM. Ambos tipos de placas se siembran con bacterias e coli OP 50, que posteriormente se inactivan mediante exposición a UV. Comience preparando 10 mililitros de solución de NGM.Por cada placa de Petri de 60 milímetros, derrita completamente el NGM sólido en el microondas a potencia máxima en pulsos de 32 segundos. Agite el medio entre pulsos para evitar la acumulación de burbujas de gas presurizado; coloque el NGM líquido en un baño de agua a 55 grados Celsius o sobre la bancada para permitir que el medio se enfríe. Una vez que el medio haya enfriado a 55 grados Celsius, temperatura a la cual debería poder sostener el recipiente de vidrio con las manos desnudas cómodamente, estará listo para agregarle los fármacos.Y para verter las placas con fármacos, añada 33 microlitros de FUDR 150 milimolar y 100 microlitros de ampicilina al 100 miligramos por mililitro por cada 100 mililitros de NGM y agite suavemente para mezclar. La ampicilina se utiliza para prevenir la contaminación bacteriana externa y el FUDR para impedir que los huevos eclosionen, de modo que los gusanos no necesiten ser transferidos cada pocos días con el fin de separarlos de las larvas en crecimiento.Ahora vierta el medio y deje secar las placas sobre la bancada durante dos días. El día anterior a que las placas terminen de secarse, siembre un cultivo líquido de LB con una colonia aislada de una siembra fresca de e coli. OP 50 bacterias en agar LB. Prepare al menos 0,5 mililitros de cultivo por placa de 60 milímetros.Coloque el cultivo OP 50 en un agitador a 37 grados Celsius y deje crecer las bacterias durante la noche. Al día siguiente, pelletice las bacterias OP 50 con una fuerza centrífuga de 3.500 × g durante 10 minutos. Deseche por decantación la cantidad suficiente del sobrenadante para resuspender las bacterias a una concentración 10 ×.Ahora inocule cada placa con 100 microlitros de la cultura concentrada. Evite tocar la superficie del NGM con la punta de la pipeta, ya que imperfecciones en la superficie del medio permitirían que los gusanos se entierren. Gire las placas hasta que las bacterias cubran la zona central del NGM sin acercarse a las paredes de la placa y deje las placas secar sobre la bancada durante 24 horas. Una vez secas, exponga la superficie de las placas a una dosis de UV suficientemente fuerte como para detener el crecimiento bacteriano; utilizamos un estratagema UV straddle linker 2, 400.Comience cargando las placas en el enlazador de tipo straddle sin sus tapas. Ahora presione energía. Ingrese 9 9 9 9 en el teclado numérico y presione inicio.Las placas se expondrán a UV durante aproximadamente cinco minutos. Las placas con bacterias muertas por UV se pueden almacenar boca abajo a cuatro grados Celsius durante hasta un mes. Esta sección describe cómo generar una población de gusanos con una fecha de eclosión común.Comience transfiriendo aproximadamente 20 gusanos adultos jóvenes a una placa NGM fresca sin fármacos. Deje la placa a 25 grados Celsius durante aproximadamente una semana para permitir que los gusanos se propaguen y consuman toda la comida bacteriana en una semana. Deben aparecer gusanos recién eclosionados en la etapa de crecimiento arrestado de dauer; transfiera 20 a 30 larvas de dauer a una placa NGM fresca sin fármacos e incúbelas a 25 grados Celsius en presencia de alimento.Las larvas adultas se volverán reproductivamente activas dentro de dos días y permanecerán activas reproductivamente durante unos días más. Ahora transfiera de 10 a 15 adultos reproductivamente activos a una placa fresca de NGM sin fármacos. Esta placa se denomina placa de puesta de huevos programada o placa TEL.Deje la placa TEL a 25 grados Celsius para que los gusanos pongan huevos. Los animales que eclosionen de estos huevos serán los animales experimentales y se evaluará su longevidad después de seis horas. Inspeccione la placa TEL en busca de huevos.Si aún no hay suficientes huevos, deje la placa TEL a 25 grados Celsius durante un máximo de 24 horas en total. Revise periódicamente la presencia de huevos. Cuando se haya depositado un número suficiente de huevos, retire los adultos de la placa TEL.Un experimento típico de longevidad requerirá de 30 a 90 huevos por grupo experimental, pero se pueden generar varios cientos de huevos en una sola placa TEL. Aproximadamente 150 huevos serán puestos por 10 a 15 adultos reproductivamente activos en seis a ocho horas. Al comparar grupos experimentales, puede alcanzarse significancia estadística para diferencias grandes en longevidad con tan solo 30 animales.Se deberían utilizar más animales para distinguir diferencias más modestas. Ahora, coloque la placa TEL sin adultos a 20 grados Celsius hasta que los huevos eclosionen y los gusanos hayan desarrollado hasta el estadio larval L4. Esto generalmente tarda dos días para el tipo salvaje C. elegans, pero puede tardar más en cepas con fenotipos de desarrollo lento.Esta sección describe cómo seguir la vida de una población sincronizada por edad. Primero, transfiera las larvas L4 desde la placa TEL a placas AMP FUDR preparadas. Para cada cepa o condición que se pruebe, es habitual preparar de dos a tres placas con entre 25 y 30 gusanos por placa.Incubar las placas AMP FUDR a 20 grados Celsius durante 24 horas. Luego evaluar visualmente los gusanos, el medio y la bacteria, y transferir los gusanos a placas AMP FUDR frescas. Si los gusanos han consumido la mayor parte del alimento bacteriano, esto generalmente ocurrirá una o dos veces por semana.Al principio del experimento, si hay un número significativo de larvas presentes, esto generalmente indica que los gusanos se transfirieron a las placas con AMP y FUDR como adultos jóvenes en lugar de como L4. Los adultos jóvenes pueden poner huevos antes de que el FUDR haga efecto, y ocasionalmente las larvas escapan a los efectos del FUDR y crecen hasta convertirse en adultos. Estas larvas alterarán el experimento en esta situación; transfiera los gusanos adultos a placas nuevas y deseche las placas antiguas que contengan las larvas.Los gusanos también deben transferirse a placas frescas si se observan bacterias vivas en crecimiento. Por lo general, la combinación de AMP y eliminación mediante UV garantizará que ninguna bacteria viva contamine el experimento, aunque ocasionalmente puede ocurrir. Asimismo, transfiera los gusanos.Si se observa crecimiento fúngico en el medio. Si se detecta a tiempo, el hongo puede eliminarse utilizando la punta de una pipeta o una espátula. Una vez que crece hasta alcanzar un diámetro mayor de unos pocos milímetros, generalmente es más sencillo transferir los gusanos a una placa nueva.Evalúe la longevidad de todos los gusanos cada dos o tres días. Utilizando un microscopio estereoscópico, determine si cada gusano está vivo o muerto.Toque suavemente la placa. El gusano está vivo si se mueve en respuesta al golpeteo. Si el gusano no responde al golpeteo de la placa, acerque la imagen a la región de la cabeza y toque suavemente la cabeza del gusano con una aguja de platino para transferencia.Califique al gusano como muerto. Si no responde moviendo su cabeza, retire al gusano muerto de la placa. Después de revisar todos los gusanos, registre la fecha y el número de gusanos que están vivos y muertos.Los gusanos mantenidos en medio sólido escaparán ocasionalmente de la superficie de la placa al excavar o arrastrarse por la pared. Los gusanos que huyen se omiten por completo del estudio. Una vez finalizado, devuelva las placas al incubador a 20 grados Celsius.Espere otros dos o tres días y luego revise nuevamente las placas. Continúe con este régimen hasta que todos los gusanos hayan muerto. El número de gusanos que mueren cada día se invierte típicamente para calcular la proporción de gusanos vivos en cada día; estos datos se representan gráficamente como una curva de supervivencia con respecto al día de la puesta de huevos programada.Día cero. La vida media típica para N. two. La cepa silvestre Sea elgan mantenida en bacterias inactivadas por UV a 20 grados Celsius es aproximadamente de 25 días, medida a partir del huevo.Acabamos de mostrarle cómo medir la longevidad y observar la elegancia. Puede modificar este procedimiento básico para probar una variedad de condiciones ambientales, incluyendo la restricción dietética y la interferencia por ARN, que se discuten en el texto complementario. Eso es todo.Gracias por ver el video y buena suerte con su experimento.

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