Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

Para medir la esperanza de vida en C. Elgan, se genera una población sincronizada con la edad utilizando un huevo con tiempo reproductivo. Los gusanos hermafroditas adultos activos se transfieren a placas de medio de crecimiento nematodode sembradas con E. coli muerto por UV, dejado poner huevos durante seis a ocho horas y luego retirado durante los dos días siguientes; los gusanos eclosionan de estos huevos y crecen hasta la etapa larval L 4. Los gusanos L cuatro se transfieren a nuevas placas NGM que contienen ampicilina para prevenir la contaminación bacteriana viva y FUDR para evitar la reproducción y se permite desarrollarse en adultos.

A partir de ese momento, los gusanos adultos se observan cada dos o tres días hasta que todos los gusanos han muerto. En cada momento se retiran gusanos muertos de la placa y se registra el número de gusanos vivos y muertos. Soy George Seton, del laboratorio de Matt Capline en el Departamento de Patología de la Universidad de Washington.

Hoy vamos a mostrarte cómo medir la esperanza de vida y ver nuestra elegancia ante la hepatitis hepatitis. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la genética del envejecimiento. Así que empecemos.

Un experimento básico de vida útil requiere dos tipos de placas: las placas NGM estándar, que no contienen aditivos, y las placas AMP FUDR, que contienen tanto ampicilina como fluorodesoxiuridina añadidas a la NGM. Ambos tipos de placas están colocadas con bacterias E. coli OP 50, que posteriormente mueren por exposición a la radiación UV. Comienza preparando 10 mililitros de solución NGM.

Cada placa de Petri de 60 milímetros derrite completamente el NGM sólido al microondas en alta intensidad en pulsos 32. Haz girar medios entre pulsos para evitar que se acumulen burbujas de gas presurizado, coloca el NGM líquido en un baño maria a 55 grados Celsius o en la mesa para permitir que el medio se enfríe. Una vez que el medio se ha enfriado a 55 grados Celsius, momento en el que deberías poder sujetar cómodamente el recipiente de cristal con las manos desnudas, estará listo para añadirse medicamentos.

Y para verter las placas de los platos con medicamentos, añade 33 microlitros de 150 milimolares FUDR y 100 microlitros de 100 miligramos por mililitro. La ampicilina por 100 mililitros NGM y el remolino para mezclar la ampicilina se utilizan para prevenir la contaminación bacteriana extraña y la FUDR para evitar la eclosión. Por lo tanto, no es necesario transferir los gusanos cada pocos días para separarlos de las larvas en crecimiento.

Ahora vierte el medio y deja que las placas se sequen en la mesa durante dos días el día anterior al día anterior a que las placas terminen de secar el cultivo líquido de semillas LB con una sola colonia de una nueva capa de E. coli. OP 50 bacterias en el sinfín LB. Prepara al menos un cultivo de 0,5 mililitros por placa de 60 milímetros.

Coloca el cultivo OP 50 en un shaker a 37 grados Celsius y deja que las bacterias crezcan durante la noche. Al día siguiente, pelleta la bacteria OP 50 con 3.500 g de fuerza centrífuga durante 10 minutos. Decanta suficiente del sobrenadante para resuspender la bacteria a una concentración de 10 veces.

Ahora inocúla cada placa con 100 microlitros del cultivo concentrado. Evita tocar la punta de la pipeta con la superficie del NGM, ya que los defectos en la superficie del medio permitirán que los gusanos excaven las placas en espiral hasta que las bacterias cubran la zona central del NGM sin acercarse a las paredes de las placas y dejan las placas secar en el banco durante 24 horas. Una vez secos, expone la superficie de las placas a una dosis UV lo suficientemente fuerte como para detener el crecimiento bacteriano; usamos un gen de estratos, UV straddle linker 2.400.

Empieza cargando las placas en el enlazador de caballeros sin tapas puestas. Ahora pulsa energía. Introduce 9 9 9 9 en el teclado y pulsa start.

Las placas estarán expuestas a la luz UV durante aproximadamente cinco minutos. Las placas con bacterias eliminadas por los rayos UV pueden almacenarse boca abajo a cuatro grados Celsius durante hasta un mes. Esta sección describe cómo generar una población de gusanos con una fecha de eclosión común.

Comienza transfiriendo aproximadamente 20 gusanos adultos jóvenes a una placa NGM fresca sin medicamentos. Deja el plato a 25 grados Celsius durante aproximadamente una semana para permitir que los gusanos se propaguen y consuman todo el alimento bacteriano en una semana. Los gusanos recién eclosionados en la fase de dote detenida por crecimiento deben aparecer, transferidos de 20 a 30 larvas de dote a una placa NGM fresca sin fármacos e incubarlas a 25 grados Celsius en presencia de alimento.

Las larvas de la dote se convertirán en adultos reproductivos activos en dos días y permanecerán activos durante algunos días después. Ahora transfiere entre 10 y 15 adultos reproductivos a una placa NGM fresca sin medicamentos. Esta placa se denomina placa de puesta cronometrada o placa TEL.

Deja la placa TEL a 25 grados Celsius para que las lombrices puedan poner huevos. Los animales que nacen de estos huevos serán los animales experimentales y se les puntuará su esperanza de vida tras seis horas. Inspecciona la placa TEL en busca de huevos.

Si aún no hay suficientes huevos, deja la placa TEL a 25 grados Celsius durante un total de 24 horas. Revisando periódicamente si hay huevos. Cuando se haya puesto un número suficiente de huevos, retira los adultos de la placa TEL.

Un experimento típico de esperanza de vida requerirá entre 30 y 90 huevos por grupo experimental, pero se pueden generar varios cientos de huevos en una sola placa TEL. Aproximadamente 150 huevos serán puestos por 10 a 15 adultos reproductivos en seis a ocho horas. Al comparar grupos experimentales, se puede lograr significación estadística para grandes diferencias de esperanza de vida con tan solo 30 animales.

Se deberían usar más animales para distinguir diferencias más modestas. Ahora coloca la placa TEL sin adultos a 20 grados Celsius hasta que los huevos eclosionen y los gusanos hayan evolucionado hasta la fase larval L 4. Esto suele tardar dos días para obtener elegancia tipo C salvaje, pero puede tardar más en cepas con fenotipos de desarrollo lento.

Esta sección describe cómo seguir la vida de una población sincronizada con edades. Primero, transfiere la larva L 4 de la placa TEL a placas AMP FUDR asentadas. Para cada cepa o condición que se somete a pruebas, es habitual montar dos o tres placas con 25 a 30 lombrices por placa.

Incuba las placas AMP FUDR a 20 grados Celsius durante 24 horas. Y luego evaluar visualmente los gusanos, el medio y las bacterias transfieren gusanos a placas frescas de AMP FUDR. Si los gusanos han comido la mayor parte del alimento bacteriano, esto suele ocurrir una o dos veces por semana.

Al principio del experimento, si hay un número significativo de larvas presentes, esto suele indicar que los gusanos fueron transferidos a las placas AMP FUDR como adultos jóvenes en lugar de como L cuatro. Los adultos jóvenes pueden poner huevos antes de que el FUDR haga efecto, y ocasionalmente las larvas escapan de los efectos del FUDR y crecen hasta convertirse en adultos. Estas larvas complicarán el experimento en esta situación, trasladarán los gusanos adultos a placas frescas y descartarán las placas viejas que contienen las larvas.

Los gusanos también deben transferirse a placas frescas si se observan bacterias vivas en crecimiento. Generalmente, la combinación de AMP y UV elimina el experimento garantiza que ninguna bacteria viva contamine el experimento, pero ocasionalmente ocurre. Además, transfiere los gusanos.

Si se observa crecimiento fúngico en el medio. Si se detecta lo suficientemente pronto, el hongo puede eliminarse con la punta de una pipeta o una espátula. Una vez que crece y supera unos pocos milímetros de diámetro, suele ser más fácil transferir los gusanos a una nueva placa.

Puntua todos los gusanos según su vida útil cada dos o tres días. Usando un endoscopio de disección. Determina si cada gusano está vivo o muerto.

Golpea suavemente el plato. El gusano está vivo si se mueve en respuesta al golpeteo. Si el gusano no responde al golpear la placa, haz zoom en la zona de la cabeza y golpea suavemente la cabeza del gusano con una púa de transferencia platino.

Marca al gusano como muerto. Si no responde moviendo la cabeza, retira el gusano muerto de la placa. Después de revisar todos los gusanos, anota la fecha y el número de gusanos vivos y muertos.

Los gusanos mantenidos en medios sólidos escapan ocasionalmente de la superficie de la placa excavando o trepando por la pared. Los gusanos que huyen se omiten completamente del estudio. Cuando termine, devuelve las placas a la incubadora a 20 grados Celsius.

Espera otros dos o tres días y luego revisa las matrículas de nuevo. Continúa con este régimen hasta que todos los gusanos hayan muerto. El número de gusanos que mueren cada día suele invertirse para calcular la proporción de gusanos vivos en cada día; estos datos se representan gráficamente como una curva de supervivencia considerando el día de la puesta cronometrada.

Día cero. La esperanza de vida media típica para N dos. La cepa silvestre de elgan marino mantenida con bacterias UV kill a 20 grados Celsius dura aproximadamente 25 días según medidas desde el huevo.

Acabamos de mostrarte cómo medir la esperanza de vida y ver la elegancia. Puedes modificar este procedimiento básico para probar una variedad de condiciones ambientales, incluyendo la restricción dietética y la interferencia del ARN, que se explica en el texto de apoyo. Así que eso es todo.

Gracias por vernos y mucha suerte con tu experimento.