El método de conjunto de réplica: Un enfoque de alto rendimiento para cuantitativamente medida Caenorhabditis elegans vida útil

Se han identificado cientos de genes cuya función afecta a la forma en que un organismo envejece. Pero muchas de sus relaciones son poco conocidas. Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo del envejecimiento.

Es decir, ¿cuáles son las interrelaciones genéticas entre los genes gerA? La principal ventaja de esta técnica es un aumento en el rendimiento, el número de predebaciones genéticas que se pueden medir cuantitativamente simultáneamente se incrementa en al menos un orden de magnitud. Los datos de vida útil, recopilados con este procedimiento, se pueden trazar y analizar utilizando el software que proporcionamos con esta publicación.

Además de proporcionar información sobre la esperanza de vida, este método también se puede aplicar a otros fenotipos relacionados con la edad, como la resistencia al estrés y los cambios en el plan de salud. Para este procedimiento, cree un sello nuevo de la subbiblioteca de ARNi. Primero, alícuota cada pocillo de una placa de 96 pocillos, con 200 microlitros de LB con ampicilina, usando una pipeta de 12 canales.

Esterilice un replicador de placas de 96 pines sumergiendo secuencialmente los pines en lejía al 50 % seguida de agua ultrapura. Luego sumerja las puntas en etanol y flamee cuidadosamente las puntas. A continuación, retire con cuidado la cubierta de papel de aluminio adhesivo de una placa de biblioteca de caldo de glicerol congelada de 96 pocillos y muela suave pero firmemente las puntas del replicador de placa esterilizada en los pocillos de las caldos de glicerol aún congelados.

A continuación, inocular los cultivos y sellar la placa inoculada con la membrana permeable. Permita que los cultivos crezcan durante la noche en la mesa de trabajo. Al día siguiente, esterilice el replicador de placas, retire con cuidado el sello del cultivo nocturno y sumerja las puntas de los pines del replicador.

A continuación, inocule una placa rectangular de agar LB de ampicilina y tetraciclina con los alfileres. Aplique una presión uniforme y use un movimiento circular pequeño para transferir las bacterias sin dejar que las manchas se llenen demasiado. Luego, incube las placas durante la noche a 37 grados centígrados.

Al día siguiente, por cada 10 placas de réplica necesarias, cargue cada pocillo de una placa de 96 pocillos con 1,5 mililitros de LB con ampicilina. A continuación, inocular los pocillos con las bacterias cultivadas. Luego, selle la placa con una membrana transpirable, cultive durante 20 horas agitando.

Los pozos de control deben estar dispersos a lo largo de los 96 pozos, de modo que cuando la placa de la subbiblioteca de 96 pocillos se divida en grupos de 24, cada división de 24 pozos tenga uno de cada uno de los controles. Al día siguiente, cargue 120 alícuotas de microlitros del cultivo, en las placas de 24 pocillos, utilizando una pipeta multicanal de seis pocillos, con espaciado de punta ajustable. Luego, seque las placas descubiertas en una campana de flujo laminar hasta que se haya absorbido todo el líquido.

No dejes que se sequen demasiado. Asegúrese de mantener la concentración al alicuota de cultivos líquidos, para asegurarse de que el cultivo bacteriano adecuado se coloque en el pocillo adecuado en la placa de 24 pocillos. Los experimentos de conjuntos de réplicas comienzan con el conjunto de placas independientes replicadas de 24 pocillos, cada una sembrada con los mismos clones de ARNi de bacterias.

Para los experimentos de esperanza de vida, se agregan de 15 a 20 animales L1 a cada pocillo de la placa y se les permite crecer hasta la etapa L4. En L4, FUdR se agrega a todos los pozos en las réplicas. Más tarde en el mismo día, se puede tomar un plato replicado del conjunto y anotar como el primer punto de tiempo.

Para aumentar la vida útil, se agrega líquido a los pozos de la placa para inducir el movimiento de los animales. Los animales que no comienzan a moverse son pinchados suavemente con un palillo de gusano. A continuación, se registra el número total de animales y el número de animales muertos.

A continuación, se descarta la placa de la primera observación. En el siguiente punto de tiempo de observación, se toma otra placa replicada del conjunto y se puntúa de manera similar. Esto se repite en el intervalo de puntuación determinado.

Cada vez con un nuevo plato del conjunto replicado. Continúe anotando un juego de platos hasta que no quede ningún animal con vida. En primer lugar, sincronice una población de animales con el mismo método de preparación a base de lejía que se utiliza para el ensayo tradicional de esperanza de vida.

Luego, usando una pipeta de espaciado ajustable de seis pocillos y un depósito de reactivo, siembre de 15 a 20 animales L1 en cada pocillo de las placas de 24 pocillos preparadas. Mientras siembra las placas, mezcle periódicamente los animales L1 en solución para mantener una distribución uniforme. Ahora, deja que los animales se desarrollen hasta L4. Se debe conocer el momento del desarrollo de L4 para este protocolo.

Monitorear periódicamente el desarrollo de los gusanos. Cuando los animales alcancen L4, agregue 24 microlitros de 50x FUdR a cada pocillo y devuelva las placas a la incubadora. El uso de animales L4 es fundamental.

Si los hermafroditas alcanzan la madurez reproductiva antes de agregar FUdR, su progenie sobrevivirá y comerá el alimento. Por el contrario, la adición de FUdR demasiado pronto conduce a la ruptura de los animales. En los puntos de tiempo deseados, use una placa replicada para marcar la viabilidad.

Para ello, inunda el pozo con solución M9. Antes de evaluar la viabilidad cada día, detecte cualquier pozo que no tenga alimento, que parezca contaminado o que tenga animales con defectos morfológicos o de desarrollo. Para cada pocillo, registre el total de animales por pocillo y verifique el estado de los gusanos inmóviles, tocando suavemente cada uno en la cabeza con un palillo de gusano.

Después de contar todos los muertos inmóviles en un plato, deseche el plato. Para este procedimiento, crezca transformado e. Coli durante la noche en LB con ampicilina.

Al día siguiente, concentre las bacterias por centrifugación a 3.000 g durante 15 a 20 minutos. Vuelva a suspender las bacterias en 1/10 del volumen inicial. A continuación, alícuota 200 microlitros de las bacterias 10x en placas de seis centímetros.

Prepare tres o cuatro placas por condición de prueba e incluya dos placas adicionales en caso de contaminación. Seque las placas en un lote de flujo laminar, hasta que todo el líquido se haya absorbido o evaporado. Una vez secas, guarde las placas en una caja de plástico durante la noche a temperatura ambiente para inducir la producción de ARN bicatenario.

Luego, almacene las placas hasta por dos semanas a cuatro grados centígrados. Para los animales, recoja animales grávidos y adultos en M9. Lávalos dos veces con M9. Repitiendo el giro en la aspiración. Luego, vuelva a suspender C. elegans en cuatro mililitros de M9 y agregue dos mililitros de solución de hipoclorito.

Ahora, vórtice inmediatamente los gusanos durante tres minutos, con sacudidas periódicas y vigorosas. Luego, bajo un microscopio de disección, busca una nube de huevos. Si no se ve la nube, vórtice los gusanos durante 10 a 20 segundos adicionales.

A continuación, lave rápidamente los huevos con M9, dos veces, como antes. Y volver a suspender los huevos lavados en tres mililitros M9. Luego, transfiera los huevos a un nuevo tubo de 15 mililitros e incube el tubo a 20 grados centígrados con una rotación suave, y permita que los embriones eclosionen durante la noche. Al día siguiente, determine la densidad de la solución L1 preparada calculando el número promedio de L1 por microlitro en tres gotas de 10 microlitros.

Cargue las placas sembradas de bacterias preparadas con 50 animales L1, cada una. Coloque las placas en una incubadora Celsuis a 20 grados, hasta que los embriones se desarrollen hasta la etapa L4. El desarrollo normal de L1 a L4 tarda unas 40 horas.

Luego, para evitar la producción de progenie, agregue 160 microlitros de 50x FUdR a cada placa. A continuación, retira a los machos, ya que la esperanza de vida suele medirse sólo con hermafroditas. Una vez completado, vuelva a empaquetar las placas en la incubadora Celsuis a 20 grados.

Hasta que todos los gusanos estén muertos, verifique su viabilidad a diario. Para hacerlo, toque suavemente cada nematodo inmóvil en la cabeza con un alambre de platino o una pestaña. Los animales no reactivos están muertos y deben ser retirados del plato.

Toma nota de cualquier anomalía durante esta rutina. El conjunto de réplicas y los métodos tradicionales para analizar la esperanza de vida de C. elegans producen resultados similares con animales N2 de tipo salvaje. Por ejemplo, la eliminación de ARNi basada en la alimentación de mml-1 o mxl-2 disminuyó significativamente la esperanza de vida normal.

Esto se midió mediante un ensayo de vida útil tradicional y mediante el ensayo de conjunto de réplicas. También se puede detectar una longevidad prolongada. Visto aquí, el ARNi para mdl-1 o mxl-1 aumentó significativamente la esperanza de vida de C. Elegans cuando se midió por cualquiera de las metodologías.

Utilizando el método del conjunto de réplicas, es posible cuantificar simultáneamente los cambios en la esperanza de vida en más de 100 condiciones, lo que no sería razonable con un enfoque más tradicional. Por ejemplo, un cribado de ARNi basado en la alimentación de todo el genoma identificó 159 genes necesarios para el aumento de la vida útil conferido por la disminución de la señalización similar a la insulina daf-2. La relación entre la señalización similar a la insulina y estos genes se describió con más detalle midiendo la duración de la salud de los animales.

La salud fue indicada por el golpeteo de C. Elegans cuando se suspendió en solución. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el ARNi basado en la alimentación para medir la vida útil de C. Elegans.

Pero el ARNi es versátil y se puede aplicar para muchos fenotipos diferentes. Una vez dominado, el método del conjunto de réplicas permite evaluar la vida útil de más de 100 clones de ARNi cada día, si se realiza correctamente. Los puntos de tiempo temprano y tardío se pueden anotar rápidamente.

Todos los animales en un pozo estarán vivos y en movimiento, o muertos. La puntuación es más larga cuando los animales están empezando a morir. Escalonar la organización de ensayos independientes con esto en mente.