Consideraciones prácticas en el estudio de colonización pulmonar metastásico en Osteosarcoma usando el ensayo de metástasis pulmonar

El objetivo general de este ensayo de metástasis pulmonar es visualizar y estudiar directamente el crecimiento de las células de osteosarcoma metastásico en el tejido pulmonar viable. Este método puede ayudar a responder preguntas realmente clave en el campo de la metástasis del osteosarcoma. Por ejemplo, cómo las células del osteosarcoma metastásico se adaptan, sobreviven y proliferan en el microambiente pulmonar.

La principal ventaja de esta técnica es que permite una visualización directa del crecimiento celular del osteosarcoma metastásico en un microambiente tridimensional relevante. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, debido a los pasos técnicamente desafiantes de canular la tráquea e insuflar el pulmón. La inyección de células tumorales en la vena de cola y la eutanasia en ratones se realizan de acuerdo con las directrices institucionales estándar.

Después de cinco minutos, coloque el ratón sacrificado en decúbito dorsal sobre una almohadilla estéril en una capucha de flujo laminar, y use tijeras pequeñas y estériles para diseccionar cuidadosamente el esternón, más allá de la entrada torácica a ambos lados de la tráquea, sin perforar los pulmones. La disección de todo el músculo y el tejido conectivo que rodea la tráquea es esencial para una canulación exitosa. A continuación, use un catéter intravenoso de calibre 20 para canular cuidadosamente la tráquea y use una sutura de tripa de gato estéril para asegurar sin apretar el catéter y la tráquea.

Conecte un juego de extensión intravenosa desde el catéter a la jeringa de 10 mililitros de un aparato de profusión por gravedad y vierta agarosa líquida a 37 grados centígrados mezclada con una solución media A en la jeringa. Llene los pulmones con la solución de agarosa hasta que estén completamente insuflados. A continuación, retire la cánula y ate firmemente la sutura para evitar fugas de la solución de agarosa.

Es importante mantener el pulmón intacto durante la insuflación. Una adecuada insuflación con agarosa y el posterior enfriamiento del desplume, mantendrán el pulmón en un estado expandido. Extraiga el desplume, la tráquea, el corazón y el pulmón, teniendo cuidado de no perforar ni dañar la superficie del pulmón.

Coloque los pañuelos en 30 mililitros de PBS preenfriado suplementado con antibióticos y deje que la agarosa se solidifique. Coloque la pluma en hielo durante 20 minutos. Después de 20 minutos, use tijeras finas y pinzas para cortar el pulmón en trozos de 3 x 1,5 milímetros, y coloque las rodajas en pocillos individuales de una placa de 6 pocillos que contenga 2 esponjas de gelatina de 2 x 2 centímetros previamente empapadas en medio B.

El día de la toma de imágenes, transfiera cuidadosamente las rodajas de pulmón de la placa de 6 pocillos a un plato redondo estéril con fondo de vidrio de 35 milímetros en columnas de acuerdo con su grupo experimental. A continuación, en un microscopio de fluorescencia de campo amplio, seleccione el objetivo de 2,5x y ajuste los parámetros de imagen para proporcionar el mejor contraste entre las células tumorales fluorescentes y el tejido de fondo no fluorescente en el grupo de muestra de tejido de control. Obtener imágenes de todas las muestras utilizando los mismos parámetros que para los tejidos de control.

Si el software no está calibrado a escala, obtenga imágenes de un micrómetro utilizando el mismo objetivo que el tejido pulmonar para obtener una referencia de escala y guarde todas las imágenes como archivos tif. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, para analizar las imágenes en ImageJ, abra el primer archivo. Utilice la herramienta de selección de polígonos para delinear todo el corte de pulmón y determinar el área del corte de pulmón total.

Seleccione el proceso y reste el fondo. Establezca el radio de la bola rodante en un valor inicial de 50 píxeles. Este valor dependerá del grado de fluorescencia de fondo y debe optimizarse para cada conjunto de datos.

Asegúrate de desmarcar el fondo claro. Seleccione imagen y escriba, 8 bits, luego imagen y propiedades, ingrese píxeles. En Unidad de longitud, escriba 1 para el ancho de píxel, la altura de píxel y la profundidad del vóxel.

A continuación, marque global para aplicar estos parámetros a todas las imágenes posteriores. A continuación, seleccione la imagen, luego ajustar y luego el umbral. Resalte el valor predeterminado y el blanco y negro, y utilice el control deslizante para umbralizar la imagen de modo que la mayoría de las células tumorales se resalten con precisión.

Haga clic en aplicar una vez para que el pulmón se vuelva negro y las lesiones fluorescentes blancas. A continuación, haga clic en aplicar por segunda vez para invertir la imagen de modo que todas las estructuras fluorescentes se vuelvan negras. Para cuantificar el número y la forma de las lesiones, seleccione analizar y establecer mediciones, y verifique el área.

Desmarque todas las demás casillas. A continuación, seleccione analizar partículas y, en el campo de tamaño, utilice el área de la lesión más pequeña determinada como una sola célula por ImageJ, para establecer el rango de formas que enumerará el programa. Utilice una imagen del grupo de vehículos del día cero para elegir el área más pequeña que se considera una sola célula tumoral.

Cuando se haya establecido el límite inferior, haga clic en Aceptar. Aparecerá una ventana de resultados que contiene todas las formas enumeradas y las medidas de área. Luego, copie y pegue los datos de la ventana de resultados en una hoja de cálculo y use la función matemática de suma para sumar todas las áreas de las lesiones metastásicas para ese corte de pulmón en particular.

Las propensiones metastásicas para líneas celulares de alta y baja metástasis son visualmente evidentes en puntos de tiempo progresivos. Más específicamente, estas imágenes de microscopía muestran cómo las células altamente metastásicas son capaces de colonizar el pulmón de manera más eficiente que las líneas celulares de baja metástasis. El análisis de imágenes, la cuantificación y el análisis estadístico de los datos de imágenes confirman que las células tumorales altamente metastásicas pueden colonizar eficazmente el tejido pulmonar.

Mientras que las células con baja metástasis no pueden crecer en absoluto. La microscopía de fluorescencia confocal de gran aumento permite la visualización de las células del parénquima pulmonar con gran detalle espacial en comparación con las células tumorales que expresan EGFP. Así como facilita el análisis de estructuras subcelulares, como estas mitocondrias.

Dependiendo del número de ratones utilizados, esta técnica puede completarse en cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar con equipos quirúrgicos limpios y estériles. Después de su desarrollo, la técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del cáncer exploraran la progresión de la metástasis en los pulmones de ratones.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de cultivo celular in vitro y la transferencia occidental, para responder preguntas adicionales sobre los efectos de la eliminación de genes o el tratamiento con medicamentos en las células cancerosas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una prueba de metástasis pulmonar. No olvide que trabajar con células cancerosas humanas puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en un laboratorio de seguridad de dos niveles biológicos, al realizar este procedimiento.