Name: Consideraciones prácticas en el estudio de colonización pulmonar metastásico en Osteosarcoma usando el ensayo de metástasis pulmonar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprende el ensayo de metástasis pulmonar para estudiar la colonización de células de osteosarcoma en tejido pulmonar viable. Este método permite visualizar directamente el crecimiento metastásico en un microambiente tridimensional relevante.

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Nos gustaría dar las gracias a Dr. Arnulfo Mendoza quien proporcionó capacitación en la técnica de PuMA. Además, nos gustaría reconocer los Drs. Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) y Sam Aparicio (BC Cancer Agency) para proporcionar el uso de los microscopios en el transcurso de este estudio. Esta investigación fue apoyada (en parte) por el programa de investigación intramuros de los institutos nacionales de salud, centro de investigación del cáncer, rama de oncología pediátrica. M.M.L. fue apoyado por el programa nacional de institutos de salud intramuros visitando compañeros (Premio 15335) y actualmente es apoyado por una beca de Parker de Joan en la investigación de metástasis. P.H.S. es apoyado por la Fundación del cáncer de Columbia Británica.

Todos los protocolos de animal de que se obtuvieron datos de proyección de imagen fueron realizados con la aprobación del cuidado Animal y uso Comité de Instituto Nacional del cáncer, institutos nacionales de salud. Todos los protocolos animales discuten y retratado en el artículo video han sido aprobados por el Comité de cuidado Animal de Universidad de British Columbia.
1. preparación de las células tumorales para la inyección y materiales para el modelo de PuMA
Nota: La cantidad de soluciones y células será suficiente para 1 ratón. Ampliar según sea necesario si más ratones se utilizan en el estudio. Recetas de medios de comunicación, consulte la tabla 1 y tabla 2.
<ol><li>Precalentar 5 mL de un-Media en un tubo cónico de 15 mL en un baño de agua de 37 oC.</li>
	<li>Derretir la solución 1.2% baja fusión agarosa (en agua estéril) usando el microondas de laboratorio.</li>
	<li>Transferir 5 mL de agarosa fundido en un tubo cónico de 15 mL y calentarse en baño María a 37 oC. Asegúrese de que la agarosa fundida está a 37 oC y líquido antes del paso de insuflación pulmonar.</li>
	<li>Pre-enfriar 30 mL de grado cultivo celular PBS suplementado con 1 X pluma/estreptococos en un cubo de hielo.</li>
	<li>En un pocillo de una placa de 6 pozos, pre-empape una esponja de gelatina en 1,5 mL de B-medios de comunicación. La esponja será el ancla de apoyo para las lonchas de pulmón.</li>
	<li>Las células OS sean unos 70-90% confluente en el día del procedimiento. No utilice las células confluentes excesivamente o si los medios de comunicación son de color naranja a amarillo ya que las células generalmente se estresan y han disminuido la viabilidad en este punto. Para las líneas celulares de osteosarcoma, MNNG y HOS, 5 x 105 en un volumen de 100 μL se utilizará para inyectar en la vena de la cola del 1 ratón. De lujo por consiguiente si más ratones se utilizan para el estudio.</li>
	<li>Las células del tumor usando 0.25% tripsina-EDTA (3 mL para un frasco de T75 o 2 mL en una placa de cultivo de 10 cm) de la cosecha. Cuando las células están comenzando a levantar la placa, neutralizar el tripsina-EDTA con los medios de comunicación completa. Desactivación de las células y enjuague una vez con grado cultivo celular PBS. Resuspender el precipitado en 5 mL de PBS.</li>
	<li>Realizar un recuento de células por métodos estándar. Es mejor hacer la suspensión más de lo que realmente se necesita desde pérdida de suspensión de células a menudo se produce durante la confección de la aguja e inyección intentos fallidos.</li>
	<li>Realizar un análisis de exclusión azul de tripano en una muestra de la suspensión de células para evaluar la viabilidad de las células. Proceda sólo si la celda Mostrar viabilidad 90% o superior.</li>
	<li>Inyectar 5 x 105 células en un volumen de 100 μL. Para preparar un exceso de 2 X de esta cantidad, 1 x 106 células deben girar hacia abajo y resuspendió en 0,2 mL de HBSS.</li>
	<li>Colocar suspensión celular en un cubo de hielo mientras se preparan los ratones para la inyección.</li>
</ol>2. inyección en la vena y la insuflación pulmonar la cola
Nota: La cantidad de soluciones y células en esta sección será suficiente para 1 ratón. Ampliar según sea necesario si más ratones se utilizan en el estudio. Para una lista de los equipos, materiales y los instrumentos quirúrgicos utilizados en los pasos siguientes, consulte la tabla 3 y tabla 4.
<ol><li>Caliente un ratón hembra (edad 6-8 semanas) bajo una lámpara de calentamiento durante 5 minutos para hacer la cola de la vena más visible aparente. Para las células murinas de K7M2 o K12, usar ratones Balb/c; para MG63.3 humano, células MG63, MNNG y HOS, usar ratones de inmunodeficiencia combinada severa.</li>
	<li>Asegúrese de que la suspensión de células es uniforme agitando suavemente el tubo. Elaborar cuidadosamente la suspensión de células en la jeringa de 1 mL sin la aguja. Aguja g tapa la jeringa con un 27. Asegúrese de que el bisel de la aguja está en el mismo lado que las marcas de volumen de la aguja.</li>
	<li>Coloque el ratón en el limitador y limpiar la cola con un paño con alcohol.</li>
	<li>Proceder a realizar una inyección de la vena de la cola e inyectar 100 μL de la suspensión de células. 5 minutos después de la inyección, coloque el ratón en una cámara de2 CO y comenzar el procedimiento de funcionamiento estándar de eutanasia (como esquema por su Comité institucional de cuidado animal). Dislocación cervical no debería utilizarse como una forma de eutanasia ya que lo daña la tráquea.</li>
	<li>Una vez que el ratón es eutanasia, comienzan la preparación de la campana de flujo laminar para la insuflación del pulmón del ratón con la solución de agarosa/un-media. Dentro de la campana de flujo laminar, establecer un área de trabajo con su pad estéril. En esta almohadilla colocará sus instrumentos esterilizados, catéter IV, IV extensión fijada y aparato de perfusión de gravedad (véase figura 1 complementaria).</li>
	<li>Coloque el ratón en recumbancy dorsal. Con pequeñas tijeras estériles, diseccionar cuidadosamente hacia fuera el esternón para exponer la cavidad torácica. Tenga cuidado de no perforar el pulmón ya que se utilizará una solución de agarosa/un-media para insuflar el pulmón.</li>
	<li>Cuando la disección por el esternón, disecar más allá de la entrada torácica a ambos lados la tráquea. Exponer la tráquea por disección a los tejidos blandos circundantes.</li>
	<li>Canule la tráquea con un catéter IV de 20 calibre. Sin apretar un nudo quirúrgico mediante sutura catgut estéril alrededor de la tráquea canulada.</li>
	<li>Instale una extensión de IV de la tráquea cateterizada en la jeringa de 10 mL de los aparatos de perfusión de gravedad.</li>
	<li>Combinar la agarosa al precalentado 37 oC (5 mL) y un-media (5 mL) en una mezcla 1:1. Verter la solución de agarosa/un-media líquida en la jeringa de 10 mL del dispositivo de perfusión de gravedad. Antes de la insuflación de los pulmones con la solución de agarosa/un-media, asegúrese de que toda la longitud de la extensión fijada ha sido preparada con agarosa/un-media, negando tal modo insuflación accidental de muestras de pulmón con el aire.</li>
	<li>Llenar los pulmones de la solución de agarosa/un-media hasta que los pulmones se insuflan completamente.</li>
	<li>Una vez que los pulmones se insuflan completamente, retire la cánula y atar firmemente el nudo quirúrgico para evitar la fuga de la solución de agarase/un-media a través de la tráquea.</li>
	<li>Proceda a disecar hacia fuera el pluck (tráquea, corazón y pulmón) de la cavidad torácica. Tenga cuidado de no perfore o dañar la superficie del pulmón.</li>
	<li>Lugar el pluck (en ninguna orientación particular) en el pre enfriado 30 mL de PBS suplementado con 1 X pluma/strep y permiten el agarosa, un-media solidificar por 20 min.</li>
	<li>Usando tijeras finas y pinzas, cortadas pequeños trozos de pulmón (3 x 1,5 mm) como se muestra en la figura 1A. Pequeñas lonchas de pulmón pueden ser reflejadas fácilmente usando un objetivo de X 2.5. Varias rebanadas pueden cortarse por condición experimental, por lo general 4-10 rebanadas por grupo. Nota: Para cada grupo experimental, colocar las lonchas de pulmón en un pozo independiente (placa de 6 pozos) que contiene una esponja de gelatina de 2 x 2 cm previamente empapada en B-medios de comunicación. La cantidad de medios de comunicación por el bien debe ser 1,5 mL. Cambiar el medio cada 2-3 días. Para estudios de medicamentos, la frecuencia de cambio de las medios de comunicación y las drogas es usuario determinado.</li>
</ol>3. imágenes de fluorescencia Widefield de lonchas de pulmón y el análisis
Nota: Para fluorescencia de campo amplio imágenes, pequeñas rebanadas se cortan (3 x 1,5 x 1 mm) para ajustar la sección del pulmón en 1 imagen con un objetivo X 2.5.
Adquisición de imágenes en un microscopio de fluorescencia de campo amplio:
<ol><li>Lonchas de pulmón son típicamente reflejadas en 0, 3, 7 y después de la inyección 14 días. En el ambiente estéril del gabinete biológico, transferir cuidadosamente los trozos de pulmón de la gelatina de esponjas para un fondo de cristal de 35 mm estéril ronda plato. Tenga cuidado de dab fuera el exceso de líquido de la rebanada del pulmón como el exceso de líquido actuará como un espejo y reflejar la luz fluorescente proveniente de las células del tumor.</li>
	<li>Arreglar los trozos de pulmón de manera similar, representada en la figura 1A. Cada columna representa una diversa condición experimental. Tenga cuidado de no Cruz-contaminar los pulmones con las pinzas. Enjuagar con etanol al 70% y seca antes de manipular segmentos de pulmón de otro grupo experimental.</li>
	<li>Optimizar los parámetros de proyección de imagen (es decir. ganancia, offset, exposición tiempo, binning) que ofrece el mejor contraste entre las células del tumor fluorescente y tejido pulmonar de fondo del control (vehículo sin tratamiento) grupo. Utilice los mismos parámetros del grupo de control para los grupos experimentales de la imagen. Guardar como formato de imagen tiff.</li>
	<li>Para una referencia de escala, tomar una foto digital de un micrómetro en el mismo objetivo.</li>
	<li>Desde pulmón auto-fluorescencia cambia con el tiempo, los parámetros de proyección de imagen se deben ajustar a los pulmones control cada sesión de imagen. Los parámetros de proyección de imagen para una sesión podrán no necesariamente ser óptimos para posteriores sesiones de proyección de imagen.</li>
</ol>Análisis de la imagen: Nota: Los siguientes pasos del proceso de imagen se realizan con ImageJ 1,51 h software paquete 17.
<ol><li>Abrir un archivo de imagen en ImageJ (Figura 3A).</li>
	<li>Quitar fondo: proceso > restar fondo > radio bola de balanceo (inicio con 50 píxeles), desmarque "Luz de fondo" (figura 3B).</li>
	<li>Convertir imagen a formato de 8 bits: imagen > tipo > 8 bits (figura 3).</li>
	<li>Establece las unidades en píxeles: imagen > Enter "Píxeles" en la unidad de longitud, escriba 1 en "Píxeles altura de la anchura","Pixel", "Profundidad de Voxel". La casilla "Global" para aplicar a las imágenes posteriores.</li>
	<li>Con la herramienta de selección de polígono, delinear la forma de la rebanada del pulmón entero y determinar el área (pixel2) de la división pulmonar total. Este valor se utilizará para calcular la carga por ciento tumor del pulmón.</li>
	<li>Imagen de umbral: imagen > ajustar > umbral > destacar "Por defecto" y "B & W" > Utilice el control deslizante al umbral de la imagen que la mayoría de las células del tumor se destaca con precisión. Pulsar "Aplicar" se traducirá en una imagen en blanco y negro donde el pulmón es todo negro, y las lesiones fluorescentes son de color blancas (figura 3D). Al presionar "Aplicar" una segunda vez se invierta la imagen donde todas las estructuras fluorescentes ahora son formas negras (figura 3E).</li>
	<li>Cuantificación del número y forma de las lesiones: Analizar > establecer medidas > Compruebe "Área". Desactive todas las casillas. Analizar partículas de > tamaño (pixel2): 0-infinito representa la gama de formas que enumerar ImageJ. Determinar empíricamente la lesión más pequeña que se considera que una célula solo tumor en imágenes del vehículo de día 0. Utilizar el área de esta célula de tumor único como el límite inferior para las restantes imágenes del conjunto de datos. El trabajo presentado en este documento, se establece como el límite inferior 11 pixel2 . El trabajo presentado en el video ejemplo, 24 pixel2 se establece como el límite inferior. Va gama de "Circularidad" como 0-1. "Show" puede establecerse en "Nada". Por otra parte, si se selecciona "Show" y "Contornos", se genera un dibujo de todas las formas de contorno. Comprobar "Mostrar resultados" para una ventana independiente de mediciones a pop-up. Opcionalmente, tener marcada la casilla "Add to manager" guardará todas las formas cuantificadas a un encargado del retorno de la inversión, que puede guardarse para referencia futura. Después de pulsar OK, aparecerá una ventana de "Resultados" hasta que contenga todas las formas enumeradas y medidas de área (figura 3F).</li>
	<li>Copiar y pegar los datos desde la ventana de "Resultados" en una hoja de cálculo. Utilice la función matemática de suma en Excel para sumar todas las áreas de las lesiones metastáticas por ese trozo de pulmón particular. Para evaluar la carga de tumor pulmonar por ciento del segmento de pulmón, dividir la suma de las áreas de lesiones metastásicas por el área total del trozo de pulmón. Este parámetro es también conocido como fracción del área (unA) que se describe más lejos por Underwood 18. Carga del tumor de pulmón = suma del área de áreas/total de lesión metastática de rebanada de pulmón</li>
	<li>Calcular la carga de tumor de pulmón para el resto de las secciones del pulmón en el grupo control y los restantes grupos. Parcela la carga del tumor pulmonar promedio por grupo sobre 0, 3, 7 y 14 días. Imágenes fluorescentes representante widefield de alta y baja metastásicas células humanas de OS en el modelo de PuMA en tiempo progresivo se muestran (Figura 4A). Un gráfico de línea que muestra el cambio de doblez (normalizado a día 0) en carga del tumor metastásico por ciento con el tiempo se muestra (Figura 4B).</li>
</ol>4. proyección de imagen de confocal de la fluorescencia del modelo PuMA
Nota: Para la proyección de imagen confocal, las procesamiento de tejido es similar a la de la sección anterior excepto que lonchas de pulmón más grandes se cortan (secciones transversales completas, 1-2 mm de espesor) para permitir más ROIs a ser reflejada.
Etiquetado de parénquima pulmonar con DAR4M:
<ol><li>Sumerja las rebanadas del pulmón en 10 μμM de DAR4M (en HBSS) por 45 min a 37 ° C. DAR4M etiquetas de especies de nitrógeno reactivo dentro de las células del pulmón.</li>
	<li>Después de 45 minutos de incubación, lavar los trozos de pulmón con HBSS fresco.</li>
	<li>Coloque el trozo de pulmón en un fondo de cristal de 35 mm redonda de plato y la imagen en el microscopio confocal.</li>
	<li>Los parámetros de proyección de imagen para las imágenes de ejemplo que se muestra en la figura 5 se enumeran en la tabla 5.</li>
	<li>Adquirir una pila de Z para una región de interés. Use el espesor de corte sugerido de Z para el muestreo de Nyquist. Una película representativa de una pila de 3D mostrando células de OS fluorescentes verdes en el tejido pulmonar marcada con DAR4M se suministra en 1 película y 1 película suplementario.</li>
</ol>Para las imágenes confocales de ejemplo que se muestra en la figura 5, la sesión de imágenes era terminal. Si la proyección de imagen longitudinal se requiere, se recomienda el uso de un 2-fotón o varios fotones confocal LSM microscopio equipado para la proyección de imagen ya que hay menos fotodaño a la vida de los tejidos19,20. Proyección de imagen de mito-RFP expresando MG63 las células en el modelo de PuMA:
<ol><li>Realizar el protocolo de PuMA como contorno en paso 1 y 2 con el uso de células MG63 expresando la construcción del mito-RFP.</li>
	<li>Coloque el trozo de pulmón en un fondo de cristal de 35 mm redonda de plato y la imagen en el microscopio confocal.</li>
	<li>Los parámetros de proyección de imagen para las imágenes de ejemplo que se muestra en la figura 6 se muestran en la tabla 6. Una película representativa de una pila de 3D mostrando verde fluorescente OS las células con mitocondrias fluorescentes es siempre de rojo en la película 2 y adicional 2 de la película.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El siguiente artículo técnico describe algunos aspectos prácticos del modelo PuMA en el estudio de colonización pulmonar en OS. Algunos pasos críticos en el protocolo donde los investigadores deben tomar cuidado adicional son los siguientes:
a) canulación de la tráquea. La tráquea puede ser dañada fácilmente mientras que disecar el músculo circundante y el tejido conectivo. Además, la aguja del catéter puede introducirse fácilmente a través de la tráquea. Preste atención a cómo el bisel de la ...

Mejores resultados para los pacientes pediátricos con osteosarcoma metastático (OS) sigue siendo una crítica necesidad clínica 1. Esto subraya la importancia de desarrollar nuevas terapias dirigidas molecularmente. Quimioterápicos convencionales que la proliferación de células de tumor de destino no han demostrado para ser eficaces en el tratamiento de enfermedad metastásica y, por tanto, estrategias novedosas deben apuntar el proceso metastático sí mismo 2. El actual artículo discute los aspectos prácticos de un tipo relativamente nuevo de ex vivo el modelo metástasis de pulmón, el ensayo de metástasis pulmonar (PuMA) desarrollado por Mendoza y colaboradores3, que proporciona una herramienta útil para descubrir nuevas Controladores moleculares en la progresión de la metástasis de pulmón en OS 4,5. Antes, sin embargo, sería prudente mencionar brevemente varios modelos actuales de la metástasis y cómo el modelo PuMA ofrece varias ventajas sobre los convencionales en vitro ensayos.
Modelos más experimentales utilizados para estudiar la metástasis forman parte de sistemas in vitro e in vivo que recapitulan un determinado paso o varios pasos de la cascada metastásica. Estos pasos incluyen: células de tumor 1) migrar lejos el tumor primario, 2) intravasación en vasos cercanos (arterial o linfática) y tránsito dentro de la circulación, 3) detener en el sitio secundario, 4) la extravasación y la supervivencia en el sitio secundario, 5) formación de micrometástasis y 6) crecimiento en metástasis vascularizadas (figura 1). Modelos in vitro de la metástasis pueden incluir migración (2D) 2 dimensiones y 3 dimensiones (3D) ensayos de invasión de Matrigel cuales son revisados en detallan en otra parte 6. Para los modelos en vivo , los dos sistemas modelo utilizados incluyen: 1) el modelo de metástasis espontáneas es donde las células de un tumor son orthotopically inyectado en un tipo de tejido específico para formar un tumor local que espontáneamente arroja las células metastásicas a sitios distantes; 2) el modelo experimental de metástasis es donde las células del tumor se inyectan en los vasos sanguíneos contra la corriente del órgano blanco. Por ejemplo, una cola vena inyección de células de tumor en el pulmón de desarrollo metástasis5,7,8. Otros modelos de metástasis experimentales incluyen la inyección de las células del tumor en el bazo o en la vena mesentérica que se traduce en el desarrollo de las metástasis del hígado9,10. Consideraciones prácticas de estos modelos en vivo se discuten en detalle por Welch 11. Otro en vivo modelo usado para estudiar la metástasis en sarcomas pediátricos es el modelo de implantación del tumor subcapsular renal riñones que resulta en la formación local del tumor y la metástasis espontánea a los pulmones 12,13. Una técnica más técnicamente exigente como videomicroscopía intravital puede visualizar directamente, en tiempo real, interacciones entre las células de cáncer metastásico y la microvascularización de un sitio metastásico (es decir. pulmón o hígado) descrito por MacDonald14 y Entenberg15o extravasación de células de cáncer en la membranas corioalantoideas como descrito por Kim 16.
El modelo de PuMA es una ex vivo, explantes de tejido pulmonar, el sistema de cultivo cerrado donde el crecimiento de las células del tumor fluorescente puede longitudinalmente observar mediante microscopía de fluorescencia durante un período de un mes (ver figura 2A). Este modelo recoge las etapas iniciales de la colonización del pulmón (pasos 3 a 5) en la cascada metastásica. Algunas ventajas importantes del modelo PuMA sobre modelos convencionales en vitro son: 1) ofrece una oportunidad para medir el crecimiento de la célula de cáncer metastásico en un microambiente 3D que conserva muchas características del microambiente pulmón longitudinalmente en vivo 3; 2) puMA permite al investigador evaluar si la caída de un candidato gene o droga tiene actividad anti-metastásico en el contexto de un microambiente de pulmón 3D; 3) el modelo de PuMA es flexible con muchos tipos de plataformas de la microscopia de la fluorescencia (figura 2B) como microscopía de fluorescencia de campo amplio o microscopia confocal de láser, ejemplos de cada uno se muestran en la figura 2 y D, respectivamente. Este artículo discutirá cómo utilizar el modelo de PuMA para obtener datos de imágenes longitudinales sobre el crecimiento metastásico de mayor proteína verde fluorescente (eGFP)-expresar, las células de osteosarcoma metastásico altas y bajas humanas (MNNG y HOS células, respectivamente) mediante fluorescencia de campo amplio de baja magnificación. También se discuten ejemplos de la imagen un tinte fluorescente que las etiquetas de la parenquimia de pulmón y una proteína fluorescente roja reportero genética que etiquetas mitocondrias en OS de células en el modelo de PuMA con microscopía de escaneo láser confocal.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Tabla 2</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte Reactivos >de cultivo celular para medios A, medios B y medios completos</medios></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fuertesMNNG-HOS</td><td>LÍNEA</td><td>CELULAR DE SO altamente metastásico</td>HOS ATCC <td>CRL-1543</td></tr> línea <tr><td></td><td></td><td></td><td>celular de SG poco metastásico</td></tr><tr><td>MG63.3</td><td>Laboratorio Amy LeBlanc (NCI)</td><td>N/A línea</td><td>celular de SG altamente metastásica</td></tr><tr><td>MG63</td><td>ATCC</td><td>CRL-1427</td> línea <td>celular de OS poco metastásico</td></tr><tr><td>10X M199 medios</td><td>Thermofisher</td><td>11825015</td><td>Medios base para medios A y medios B</td></tr><tr><td>Agua destilada (esterilizada)</td><td>Thermofisher</td><td>15230-147</td><td>Componente de medios A & B-media</td></tr><tr><td>7.5% solución de bicarbonato de sodio</td><td>Thermofisher</td><td>25080094</td><td>componente de A-media & B-media</td></tr><tr><td>Hidrocortizone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>H6909</td><td>Componente de A-media & B-media</td></tr><tr><td>Acetato de retinol-soluble en agua</td><td>Sigma-Alrich</td><td>R0635-5MG</td><td>Componente de A-media & B-media</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina 10X solución concentrada (10000 U/ml)</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>15140122 Componente de A-media & B-media, medios completos.</td></tr><tr><td>Solución de insulina bovina (10 mg / ml)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>I0516-5ML</td><td>Componente de A-media & B-media</td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa</td><td>Thermofisher</td><td>11965092</td><td>medio base de Complete</td></tr><tr><td>Media L-glutamina (200 mM)</td><td>Thermofisher</td><td>25030081</td><td>componente de Complete Media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine</td><td>Serum Thermofisher</td><td>16000044</td><td>componente de Complete Media</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Thermofisher 14190144 solución salina tamponada con fosfato</td><td></td><td></td><td>se utiliza en el cultivo celular.</td></tr><tr><td>Hank' s Solución de sales tamponadas, sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol</td><td>Thermofisher</td><td>14175095</td><td>Se utiliza para resuspender el pellet celular antes de la inyección</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rojo</td><td>fenol Thermofisher</td><td>25200114</td><td>Se utiliza en cultivo celular.</td></tr><tr><td>DAR4M</td><td>Enzo</td><td>ALX-620-069-M001</td><td>Se utiliza para marcar el parénquima pulmonar.</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Table 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiales para PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal LSM</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Confocal LSM vertical microscopio</td></tr><tr><td>Zeiss 780 Confocal LSM</td><td>Zeiss N</td><td>/A</td><td>Microscopio confocal LSM invertido</td></tr><tr><td>ratones SCID</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, mujer, 6-8 semanas</td></tr><tr><td>de edad GelFoam</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-9863</td><td>Se utiliza como soporte para secciones de tejido pulmonar.</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarose</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>Se utiliza durante la insuflación del pulmón.</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml con aguja de calibre 27</td><td>Fisherscientific</td><td>14-826-87</td><td>Se utiliza para la inyección en la vena de cola.</td></tr><tr><td>Jeringa de 10 ml</td><td>BD 309604</td><td></td><td>Se utiliza para la insuflación pulmonar.</td></tr><tr><td>Catéter de calibre 20</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2032CA</td><td>Se utiliza durante la insuflación del pulmón.</td></tr><tr><td>Juego de extensión Abbott IV (30", Estéril)</td><td>Medisca</td><td>8342</td><td>Se utiliza durante la insuflación del pulmón.</td></tr><tr><td>Hisopos con alcohol</td><td>BD 326895</td><td></td><td>Para limpiar la vena de la cola antes</td></tr> de la inyección <tr><td>Guantes quirúrgicos estériles</td><td>Fisherscientific</td><td>Varía según el tamaño</td><td>Manejo escéptico de los pulmones de ratón Regla de</td></tr><tr><td>30 cm</td><td>Grapas</td><td></td><td>Se utilizan para la insuflación del pulmón.</td></tr><tr><td>Soporte de soporte para regla</td><td>Pipette.com</td><td>HS29022A</td><td>Se utiliza para la insuflación del pulmón.</td></tr><tr><td>Placa de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>Se utiliza para la obtención de imágenes de cortes de pulmón</td></tr><tr><td>Almohadillas absorbentes con barrera contra la humedad impermeable</td><td>VWR</td><td>56617-014</td><td>Se utiliza para revestir el área de trabajo estéril en la campana biológica.</td></tr><tr><td>Catgut Sutura Lisa Absorbible</td><td>Braun</td><td>N/A</td><td>Se utiliza para atar la tráquea canulada.</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Table 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos quirúrgicos para PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Tijeras de disección 3.5" rectas afiladas/afiladas</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>Para cortar secciones de pulmón</td></tr><tr><td>de 4" (10 cm) Punta Larga Dentada Recta Extra Delicada de 0,5 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td>Para manipular/sujetar secciones pulmonares.</td></tr><tr><td>4" (10 cm) Punta larga dentada de curva ligera de 0,8 mm</td><td>Roboz</td><td>RS5135</td><td>Para manipular/sujetar secciones pulmonares.</td></tr><tr><td>pinzas de vendaje para el pulgar; Dentado; Delicado; 4.5" de longitud; 1,3 mm Ancho de punta</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td>Para disección general.</td></tr><tr><td>Pinzas de vendaje para el pulgar de 4,5" dentadas de 2,2 mm Ancho de punta</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>Para disección general.</td></tr><tr><td>Tijeras de disección micro extrafinas de 3,5" rectas afiladas/afiladas, hoja de 20 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td>para disección general.</td></tr><tr><td>Tijeras Knapp; Recto; Punzante-contundente; Longitud de la hoja de 27 mm; Longitud total de 4"</td><td>Roboz</td><td>RS-5960</td><td>Para disección general.</td></tr></tbody></table>

consideraciones prácticas en el estudio de colonización pulmonar metastásico en osteosarcoma usando el ensayo de metástasis pulmonar

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

El ensayo de metástasis pulmonar (PuMA) es un ex vivo el explante de pulmón y el sistema de cultivo de célula cerrada que permite a los investigadores a estudiar la biología de la colonización del pulmón en osteosarcoma (OS) por microscopía de fluorescencia. Este artículo proporciona una descripción detallada del protocolo y discute ejemplos de obtención de datos de imagen en crecimiento metastático con campo amplio o plataformas de microscopia confocal de la fluorescencia. La flexibilidad del modelo PuMA permite a los investigadores a estudiar no sólo el crecimiento de las células de la OS en el microambiente del pulmón, sino también evaluar los efectos de la terapéutica anti-metastásico con el tiempo. La microscopia confocal permite la proyección de imagen de alta resolución, sin precedentes de las interacciones de la célula de OS con la parenquimia de pulmón. Por otra parte, cuando se combina el modelo de PuMA con colorantes fluorescentes o reporteros genético proteína fluorescente, los investigadores pueden estudiar el microambiente del pulmón, las estructuras celulares y subcelulares, funciones de los genes y actividad del promotor en células metastásicas de OS. El modelo PuMA proporciona una nueva herramienta para los investigadores de osteosarcoma a descubrir la nueva biología de la metástasis y evaluar la actividad de nuevas terapias anti-metastásicas, dirigidas.

Microscopía de fluorescencia de campo amplio de baja magnificación
Para microscopía de fluorescencia de campo amplio de lonchas de pulmón PuMA, imágenes representativas y cuantificación de datos se muestra en la figura 2y Figura 4A y B. Las propensiones metastásicas para líneas de alta y baja metastático de la célula son visual...

El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción detallada del protocolo para el ensayo de metástasis pulmonar (PuMA). Este modelo permite a los investigadores a estudiar el crecimiento de células de osteosarcoma metastásico (OS) en el tejido del pulmón usando un widefield fluorescencia o un microscopio de escaneo láser confocal.

Consideraciones prácticas en el estudio de colonización pulmonar metastásico en Osteosarcoma usando el ensayo de metástasis pulmonar

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

El objetivo general de este ensayo de metástasis pulmonar es visualizar y estudiar directamente el crecimiento de las células de osteosarcoma metastásico en el tejido pulmonar viable. Este método puede ayudar a responder preguntas realmente clave en el campo de la metástasis del osteosarcoma. Por ejemplo, cómo las células del osteosarcoma metastásico se adaptan, sobreviven y proliferan en el microambiente pulmonar.La principal ventaja de esta técnica es que permite una visualización directa del crecimiento celular del osteosarcoma metastásico en un microambiente tridimensional relevante. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, debido a los pasos técnicamente desafiantes de canular la tráquea e insuflar el pulmón. La inyección de células tumorales en la vena de cola y la eutanasia en ratones se realizan de acuerdo con las directrices institucionales estándar.Después de cinco minutos, coloque el ratón sacrificado en decúbito dorsal sobre una almohadilla estéril en una capucha de flujo laminar, y use tijeras pequeñas y estériles para diseccionar cuidadosamente el esternón, más allá de la entrada torácica a ambos lados de la tráquea, sin perforar los pulmones. La disección de todo el músculo y el tejido conectivo que rodea la tráquea es esencial para una canulación exitosa. A continuación, use un catéter intravenoso de calibre 20 para canular cuidadosamente la tráquea y use una sutura de tripa de gato estéril para asegurar sin apretar el catéter y la tráquea.Conecte un juego de extensión intravenosa desde el catéter a la jeringa de 10 mililitros de un aparato de profusión por gravedad y vierta agarosa líquida a 37 grados centígrados mezclada con una solución media A en la jeringa. Llene los pulmones con la solución de agarosa hasta que estén completamente insuflados. A continuación, retire la cánula y ate firmemente la sutura para evitar fugas de la solución de agarosa.Es importante mantener el pulmón intacto durante la insuflación. Una adecuada insuflación con agarosa y el posterior enfriamiento del desplume, mantendrán el pulmón en un estado expandido. Extraiga el desplume, la tráquea, el corazón y el pulmón, teniendo cuidado de no perforar ni dañar la superficie del pulmón.Coloque los pañuelos en 30 mililitros de PBS preenfriado suplementado con antibióticos y deje que la agarosa se solidifique. Coloque la pluma en hielo durante 20 minutos. Después de 20 minutos, use tijeras finas y pinzas para cortar el pulmón en trozos de 3 x 1,5 milímetros, y coloque las rodajas en pocillos individuales de una placa de 6 pocillos que contenga 2 esponjas de gelatina de 2 x 2 centímetros previamente empapadas en medio B.El día de la toma de imágenes, transfiera cuidadosamente las rodajas de pulmón de la placa de 6 pocillos a un plato redondo estéril con fondo de vidrio de 35 milímetros en columnas de acuerdo con su grupo experimental. A continuación, en un microscopio de fluorescencia de campo amplio, seleccione el objetivo de 2,5x y ajuste los parámetros de imagen para proporcionar el mejor contraste entre las células tumorales fluorescentes y el tejido de fondo no fluorescente en el grupo de muestra de tejido de control. Obtener imágenes de todas las muestras utilizando los mismos parámetros que para los tejidos de control.Si el software no está calibrado a escala, obtenga imágenes de un micrómetro utilizando el mismo objetivo que el tejido pulmonar para obtener una referencia de escala y guarde todas las imágenes como archivos tif. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, para analizar las imágenes en ImageJ, abra el primer archivo. Utilice la herramienta de selección de polígonos para delinear todo el corte de pulmón y determinar el área del corte de pulmón total.Seleccione el proceso y reste el fondo. Establezca el radio de la bola rodante en un valor inicial de 50 píxeles. Este valor dependerá del grado de fluorescencia de fondo y debe optimizarse para cada conjunto de datos.Asegúrate de desmarcar el fondo claro. Seleccione imagen y escriba, 8 bits, luego imagen y propiedades, ingrese píxeles. En Unidad de longitud, escriba 1 para el ancho de píxel, la altura de píxel y la profundidad del vóxel.A continuación, marque global para aplicar estos parámetros a todas las imágenes posteriores. A continuación, seleccione la imagen, luego ajustar y luego el umbral. Resalte el valor predeterminado y el blanco y negro, y utilice el control deslizante para umbralizar la imagen de modo que la mayoría de las células tumorales se resalten con precisión.Haga clic en aplicar una vez para que el pulmón se vuelva negro y las lesiones fluorescentes blancas. A continuación, haga clic en aplicar por segunda vez para invertir la imagen de modo que todas las estructuras fluorescentes se vuelvan negras. Para cuantificar el número y la forma de las lesiones, seleccione analizar y establecer mediciones, y verifique el área.Desmarque todas las demás casillas. A continuación, seleccione analizar partículas y, en el campo de tamaño, utilice el área de la lesión más pequeña determinada como una sola célula por ImageJ, para establecer el rango de formas que enumerará el programa. Utilice una imagen del grupo de vehículos del día cero para elegir el área más pequeña que se considera una sola célula tumoral.Cuando se haya establecido el límite inferior, haga clic en Aceptar. Aparecerá una ventana de resultados que contiene todas las formas enumeradas y las medidas de área. Luego, copie y pegue los datos de la ventana de resultados en una hoja de cálculo y use la función matemática de suma para sumar todas las áreas de las lesiones metastásicas para ese corte de pulmón en particular.Las propensiones metastásicas para líneas celulares de alta y baja metástasis son visualmente evidentes en puntos de tiempo progresivos. Más específicamente, estas imágenes de microscopía muestran cómo las células altamente metastásicas son capaces de colonizar el pulmón de manera más eficiente que las líneas celulares de baja metástasis. El análisis de imágenes, la cuantificación y el análisis estadístico de los datos de imágenes confirman que las células tumorales altamente metastásicas pueden colonizar eficazmente el tejido pulmonar.Mientras que las células con baja metástasis no pueden crecer en absoluto. La microscopía de fluorescencia confocal de gran aumento permite la visualización de las células del parénquima pulmonar con gran detalle espacial en comparación con las células tumorales que expresan EGFP. Así como facilita el análisis de estructuras subcelulares, como estas mitocondrias.Dependiendo del número de ratones utilizados, esta técnica puede completarse en cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar con equipos quirúrgicos limpios y estériles. Después de su desarrollo, la técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del cáncer exploraran la progresión de la metástasis en los pulmones de ratones.Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de cultivo celular in vitro y la transferencia occidental, para responder preguntas adicionales sobre los efectos de la eliminación de genes o el tratamiento con medicamentos en las células cancerosas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una prueba de metástasis pulmonar. No olvide que trabajar con células cancerosas humanas puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en un laboratorio de seguridad de dos niveles biológicos, al realizar este procedimiento.

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Consideraciones prácticas en el estudio de colonización pulmonar metastásico en Osteosarcoma usando el ensayo de metástasis pulmonar

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