Name: Aplicación de la estimulación crónica para estudiar adaptaciones fenotípicas de músculo esquelético de rata inducida por actividad contráctil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprende a aplicar el modelo de actividad contráctil crónica para estudiar adaptaciones fenotípicas del músculo esquelético en ratas. Este método permite observar cambios mitocondriales y autofágicos en solo siete días.

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Agradecemos a Liam Tyron su experta lectura del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por fondos de las ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC) a D. A. campana. D. A. Hood también es titular de una Cátedra de investigación de Canadá en fisiología celular.

Todos los procedimientos relacionados con el animal fueron revisados y aprobados por el Comité de cuidado de Animal de Universidad de York. A su llegada en las instalaciones de animales en la Universidad de York, todas las ratas se les dio un mínimo de cinco días para aclimatarse a su entorno antes del procedimiento quirúrgico, con alimentos proporcionados ad libitum. Aunque este protocolo se ha aplicado previamente a otras especies de17,15,22, el documento actual se basa en el trabajo pionero de Pette y colegas23 y se centra en el modelo de la rata, específicamente.
1. preparación de la unidad de actividad contráctil crónica
<ol><li>Con un voltímetro, compruebe el potencial de las pilas de litio de la moneda. Nota: El potencial de cada batería debe ser de 3.0 ± 0.10 V.</li>
	<li>Pilas dos o tres en la ranura de la unidad para que el potencial total es 6-9 V. Nota: Depende de la discreción de los investigadores a considerar cuánto potencial (6 o 9 V) para mantener durante el procedimiento todo experimental. Dependiendo del diseño del estudio y la intensidad deseada del estímulo, pueden utilizar 2 ó 3 baterías.</li>
	<li>Verificar que la unidad funciona correctamente mediante el indicador del pulso, al exponer la unidad a 1 pulso emitido por una luz del estroboscópico infrarrojo portátil.</li>
</ol>2. intervención de la actividad contráctil crónica
Nota: Esterilizar todas las herramientas quirúrgicas antes del procedimiento quirúrgico. Tanto durante como inmediatamente después de la cirugía, se mantiene la temperatura corporal de las ratas por una almohadilla de calefacción. Es conveniente realizar el procedimiento quirúrgico en un paño quirúrgico. El cirujano debe usar guantes quirúrgicos estériles, así como una bata limpia. Si es necesario, se recomienda usar una mascarilla de respiración desechable.
<ol><li>Anestesiar ratas debajo 1-3% inhalación isoflurano con oxígeno, que es operado por un sistema vaporizador de gas. Confirmar el animal está totalmente sedado marcando sujetador de miembro posterior del dedo del pie y observando la frecuencia y profundidad respiratoria. Aplique lubricante ocular en los ojos para evitar la sequedad. Aplicar una inyección subcutánea de Meloxicam (0.5 mg/mL) a 2 mg/kg. Nota: Se recomienda también tener una aplicación multimodal de la analgesia (p. ej., Meloxicam más lidocaína) para reducir al mínimo cualquier dolor durante y después de la cirugía.</li>
	<li>Suavemente afeitado la trasera izquierda, así como una tira alrededor del torso de la parte posterior del cuello, unos detrás de los miembros anteriores y en el tórax anterior. Suavemente Limpie áreas afeitadas con yodo y alcohol etílico para desinfectar.</li>
	<li>Con el animal en su estómago, hacer una pequeña incisión (~0.5 cm) en la parte posterior del cuello en el centro de la región afeitado (la zona palpable entre los omóplatos) con bisturí (hoja no. 10).</li>
	<li>Localizar el nervio peroneo común.<ol>
<li>Rollo de animal sobre su lado derecho y hacer un ~ 2-3 cm-largo corte en la piel de la trasera izquierda. El área de incisión alrededor de los grupos de músculos de la parte superior del muslo que es landmarked entre la concavidad de la articulación de la rodilla y la parte posterior cerca del origen de la cola de destino. Nota: Tenga cuidado de no contaminar la primera zona de la incisión al cambiar la posición del cuerpo.</li>
		<li>Utilizando punta curvada tijeras quirúrgicas, disecar ampliamente la zona subcutánea ~3.5 - 4 cm, separando la piel del músculo subyacente para hacer un bolsillo entre la piel abierta y el músculo subyacente. Abrir la piel del tejido subyacente en toda la circunferencia de la incisión (~1.5 cm2).</li>
		<li>Hacer una pequeña incisión (menos de 0,5 cm) en el músculo bíceps femoral con tijeras quirúrgicas, asegurándose que las puntas de las tijeras se corta directamente a través del músculo.</li>
		<li>Abra suavemente el área del corte hasta que los grupos musculares interno y nervio peroneo común son accesibles (la profundidad de los tejidos musculares externos (es decir, bíceps femoris) es alrededor de ~0.5 cm). Con unas pinzas, suavemente touch/pellizcar el nervio visible y observar las respuestas de los grupos musculares (por ejemplo, TA músculo) y los dedos del pie (dorsiflexión visible) para confirmar que el nervio peroneo común es aislado. Nota: Este paso debe hacerse con extremo cuidado para evitar cortar o dañar el nervio.</li>
		<li>Fijar la ventana tirando con retractores de metal tal que el tamaño de la ventana es de ~1.5 cm2 con el nervio peroneo en el centro de la ventana. Utilizar pequeños ganchos de metal Unidos a las correas o bandas de goma que se fijan la superficie de la mesa (o junta de cirugía) (figura 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Conecte el cable a ambos lados del nervio.<ol>
<li>Preparar ~ 50-60 cm de politetrafluoroetileno (PTFE)-revestido alambre de acero fino y doblar por la mitad. Nota: Puede ser útil exponer PTFA-revestido del alambre bajo la luz UV antes de la cirugía.</li>
		<li>Gancho de la parte doblada del alambre en la ranura de una barra de acero inoxidable 30 cm de largo. Pasar la varilla, junto con el cable, por vía subcutánea desde el bolsillo abierto del miembro posterior hacia la zona de incisión en la parte posterior del cuello, en un patrón en forma de L hasta la pierna y a lo largo del centro de la espalda.</li>
		<li>Encontrar los dos extremos del cable en la trasera. Tira de los cables ya que todos los cables con aislamiento de PTFE. Con un bisturí, tira cuidadosamente los extremos del alambre por ~1.5 cm. Si los cables se convierten en deshilachado, recorto y tira de nuevo. Enrollar los extremos pelados del cable alrededor de una aguja de 21 G romas (5 veces), hacer una bobina. Una vez que las bobinas están hechas correctamente, suelte la aguja de ellos.</li>
		<li>Usando un tamaño de 6-0 seda quirúrgica, asegurar cada una de las bobinas a cada lado del nervio peroneo común (figura 2A).<ol>
<li>Hacer un nudo al final de la bobina y sutura en el lado izquierdo del nervio. Asegúrese de que la bobina está en 1,5-2,5 mm del nervio.</li>
			<li>Para asegurar la bobina, se aplican dos o tres suturas adicionales a lo largo de la bobina.</li>
			<li>Repita estos pasos en el lado derecho del nervio.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aplique 2-3 gotas de solución de antibiótico (ampicilina en solución salina; 132 mg/mL) y luego la sutura cuidadosamente la ventana (es decir, tejido del músculo bíceps femoral) con seda de 5-0 de tamaño.</li>
	</ol></li>
	<li>Libremente del viento la holgura restante del alambre (sobre el diámetro del dedo índice) y empuje en el bolsillo subcutáneo por encima de la incisión suturada del músculo bíceps femoral (aproximadamente por encima de la cadera).</li>
	<li>Aplicar 2-3 gotas de solución de antibiótico otra vez (ampicilina en solución salina; 132 mg/mL). Cerca de la piel abierta por sujetar con grapa.</li>
	<li>Conecte los cables (saliendo de la zona de la incisión del cuello) para el estimulador CCA.<ol>
<li>Conectar pin enchufes con los cables.<ol>
<li>Corte el bucle del cable que sale de la incisión en la parte superior del cuello para crear 2 extremos del cable (estos conduzca a las bobinas de sutura a cada lado del nervio peroneo).</li>
			<li>Con un bisturí, tira de los extremos de los cables de ~0.5 cm. corte de los cables pelados, si cualquier.</li>
			<li>Lentamente empuje las piezas peladas de los cables en el orificio de los conectores de pin y usando un cautín, suelda los cables en los enchufes del perno.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Opcionalmente, revise la conexión de los cables.<ol>
<li>Conecte las clavijas a una unidad de sobremesa gran estimulador mediante pinzas de cocodrilo.</li>
			<li>Entregar un solo pulso de 9 V (0,1 ms, 10 Hz) para confirmar que TA músculo contratos y la izquierda del pie dorsiflexionan.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pasar los extremos de los cables conectados pin a través de la almohadilla de gasa estéril que es ~ 4 cm x 4 cm.</li>
		<li>Conectar las patillas a la unidad de estimulador CCA.<ol>
<li>Pase el alambre por el orificio en la base de la caja del estimulador. Nota: Este cuadro es una cámara casera para la unidad de estimulador CCA y 3,5 cm × 3,5 cm x 2,5 cm13.</li>
			<li>Inserte las clavijas de las tomas de conexión de la unidad de la CCA. Ponga suavemente la unidad de la CCA en la cámara. Usar una tachuela pegajosa para asegurar la unidad CCA en la parte inferior de la cámara.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Usando una cinta athletic o el esparadrapo poroso, fije la cámara con cinta alrededor del torso depilado. Cierre la tapa del compartimiento con tres capas de cinta adhesiva y terminar envolviendo una cinta alrededor de los lados de la caja de estimulador para asegurar la caja (figura 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>Controlar si la CCA trabaja al exponer la unidad a un solo pulso de luz infrarroja (espectro de longitud de onda > 770 nm) que emite una luz del estroboscópico infrarrojo portátil. Nota: Si la CCA está funcionando correctamente, los investigadores serán capaces de ver que en respuesta a la luz infrarroja se están contrayendo los músculos del miembro posterior (es decir, TA).</li>
	<li>Observar la rata y vigilar su temperatura hasta que completamente ha recuperado la conciencia. Casa en una jaula solo ocupante para evitar cualquier daño de otros animales y no dejar objetos de plástico ni túneles en la jaula para el resto del estudio para mitigar el riesgo de daños a la unidad de estimulador o lesiones al animal. De la fuente con una botella de agua incluyen amoxicilina (0.5 mg/mL).</li>
	<li>Aplicar dosis de 1 mg/kg de Meloxicam por vía subcutánea cada 24 h después de la cirugía, que continúa al menos durante 72 h.</li>
</ol>3. crónica actividad contráctil
<ol><li>Después de la cirugía, permiten al menos 5-7 días para una recuperación completa de incisión y sutura en/alrededor de los músculos esqueléticos. Nota: Durante y después del procedimiento CCA, atentamente para comprobar la condición de cada animal mediante la observación de sus comportamientos (p. ej., comer, beber o moverse). Además, determinar cualquier estrés severo o efectos adversos marcando un cambio de peso corporal antes y después del procedimiento CCA.</li>
	<li>En el día de la estimulación de la CCA, encienda el CCA si expone el equipo estimulador para un único pulso de luz infrarroja (longitud de onda > 770 nm) por una luz del estroboscópico infrarrojo portátil.</li>
	<li>Aplique 3 o 6 h de estimulación de 10 Hz CCA. Nota: El plazo para la estimulación es hasta el investigador. La frecuencia de la estimulación no ha sido alterada en estos experimentos y se han observado solamente muy modestas mejoras en la adaptación mitocondrial mediante la extensión de la estimulación de 3 a 6 h/día, en nuestra experiencia. Si es posible, compruebe el estímulo y el animal cada 30-60 minutos.</li>
	<li>Tras el período deseado del CCA, apague la unidad CCA por exposición a la luz infrarroja (mismo procedimiento que el encender la unidad).</li>
	<li>Si varios días, repita el paso 3.2. a 3.4.</li>
	<li>Determinar el tiempo de colección de tejido. Por ejemplo, recoger los tejidos 24 h después del inicio de la pelea final de CCA (es decir, 18 h después de la última estimulación de CCA de 6 h), que se realiza bajo la anestesia como hecho durante el procedimiento quirúrgico de CCA. Inmediatamente después de recoger todos los tejidos, eutanasia animales suprimiendo el corazón mientras el animal está todavía bajo anestesia.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El modelo de actividad contráctil crónica (CCA) de ejercicio muscular de baja frecuencia estimulación en vivo, es un excelente modelo para el estudio de adaptaciones fenotípicas del músculo para el ejercicio de13,24,25 , 26. como se indica en anteriores estudios20,27, CCA es una herramienta eficaz por el cual los investigadores...

Músculo esquelético puede adaptarse para el ejercicio de formación a través de cambios en su bioenergética y estructura física1. Una de las principales alteraciones por entrenamiento de resistencia es la Biogénesis mitocondrial, que se puede evaluar por un aumento en la expresión de los componentes mitocondriales (p. ej., subunidades de c oxidasa [COX] citocromo), así como la expresión de el coactivator transcripcional, PGC-1α2. Un creciente número de estudios ha indicado que numerosos otros factores, como volumen mitocondrial y mitofagia, también son importantes para las adaptaciones musculares. Sin embargo, los mecanismos por los cual ejercicio agudo o crónico regulan estos procesos en músculo esquelético aún no están claros.
Para delinear los caminos que se regulan las adaptaciones del músculo inducida por el ejercicio, varios modelos de ejercicio se han utilizado comúnmente en estudios de roedores, incluyendo rueda de ardilla, corriente de la rueda y ejercicio de natación. Sin embargo, estos protocolos tienen algunas limitaciones en eso ~ 4-12 semanas se necesitan para observar estos cambios fenotípicos3,4,5. Como un método experimental alternativo, baja frecuencia inducida por estimulación crónica actividad contráctil (CCA) se ha utilizado eficazmente, como puede llevar a adaptaciones musculares en un período mucho más corto (es decir, hasta 7 días) y sus efectos ser comparables, o incluso superior a otros protocolos de ejercicio. Además, la presencia de hormonal6, temperatura7y efectos neurológicos8 puede hacer difícil entender las respuestas del músculo-específica al ejercicio crónico. Por ejemplo, la hormona de tiroides9,10 y factor de crecimiento insulínico (IGF) -1 se han identificado11 para mediar adaptaciones inducidas por el entrenamiento muscular, que pueden regular también otras vías de señalización en esqueleto muscular. En particular, los efectos inducidos por la CCA mínimamente son regulados por factores sistémicos, lo que permite centrarse en la respuesta directa del músculo esquelético a la actividad contráctil.
La unidad externa para el CCA fue introducida por Tyler y Wright12y ha sido desarrollada con modificaciones12. En Resumen, la unidad se compone de tres partes principales: un detector de infrarrojos que puede activar y desactivar por exposición a luz infrarroja, un generador de pulsos y un indicador del pulso (figura 1). El diseño detallado del circuito de la unidad de estimulador ha sido descrito previamente13. Las características detalladas y específicas de CCA se pueden encontrar en mayor profundidad en un número de revisión artículos14,15,16,17. En Resumen, el protocolo de estimulación está diseñado para activar el nervio peroneo común a baja frecuencia (es decir, 10 Hz), y los músculos inervados (tibialis anterior [TA] y Músculo extensor digitorum largo [EDL]) se ven obligados a contratar un longitud predeterminada de tiempo (por ejemplo, 3-6 h). Con el tiempo, esto cambia los músculos antes mencionados a un fenotipo más aeróbico, demostrado por un aumento en la densidad capilar18 y contenido mitocondrial19,20,21. Así, este método es un modelo probado para imitar algunas de las adaptaciones de entrenamiento de resistencia importante en músculo esquelético de ratas.
Este trabajo presenta un procedimiento detallado de la cirugía de implante de electrodo para inducir CCA para que los investigadores pueden aplicar este modelo en sus estudios de ejercicio. CCA es un excelente modelo para estudiar el curso del tiempo de las adaptaciones del músculo, proporcionando así una herramienta eficaz para la investigación de varios eventos moleculares y de señalización en ambos puntos del tiempo temprano y más tarde tras el inicio del entrenamiento.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley Rat</td><td>Charles</td><td>River Strain 400</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de actividad contráctil crónica</td><td>Hecho en casa</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Unidad CCA caja protectora (3.5 x 3.5 x 2.5 cm)</td><td>Hecho en casa</td><td>n/a</td><td>La caja debe estar hecha de material opaco o cubierta con una cinta adhesiva Opague</td></tr><tr><td>Pilas de iones de litio Coin (3V)</td><td>Panasonic</td><td>CR2016</td><td></td></tr><tr><td>Medwire</td><td>Leico Industries</td><td>316SS7/44T</td><td></td></tr><tr><td>Pin de soldadura (zócalo)</td><td>Digi-Key</td><td>ED6218-ND</td><td></td></tr><tr><td>Zonas cinta porosa</td><td>Johnson & Johnson</td><td>5104</td><td></td></tr><tr><td>Seda de sutura (Talla 5)</td><td>Ethicon</td><td>640G</td><td></td></tr><tr><td>Seda de sutura (Talla 6)</td><td>Ethicon</td><td>706G</td><td></td></tr><tr><td>Tijera roma curva (11,5 cm de longitud)</td><td>F.S.T.</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>Tijera curva roma (15 cm de longitud)</td><td>F.S.T.</td><td>14111-15</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas hemostáticas delicadas (16 cm de longitud)</td><td>Lawton</td><td>06-0230</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>Feather</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas curvas</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Varilla de acero inoxidable (30 cm; 7 mm de diámetro)</td><td>Hecho en casa</td><td>n/a</td> La <td>varilla debe tener una ranura de 5 mm en un extremo para sujetar el alambre para hacer un túnel debajo de la piel</td></tr><tr><td>Pinzas de aplicación de clip</td><td>KLS Martin</td><td>20-916-12</td><td></td></tr><tr><td>Grapas (clips)</td><td>Bbraun</td><td>BN507R</td><td></td></tr><tr><td>Ganchos metálicos/retractores</td><td>Casero</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Povidona yodada (500 mL)</td><td>Rougier</td><td>#NPN00172944</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina sódica</td><td>Novopharm</td><td>#DIN00872644</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Boehringer</td><td>#DIN02240463</td><td></td></tr><tr><td>Multímetro digital (voltímetro)</td><td>Soar Corporation</td><td>ME-501</td><td></td></tr><tr><td>LED estroboscopio digital</td><td>Lutron Electronic Enterprise</td><td>DT-2269</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicación de la estimulación crónica para estudiar adaptaciones fenotípicas de músculo esquelético de rata inducida por actividad contráctil

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Músculo esquelético es un tejido altamente adaptable, como sus propiedades bioquímicas y fisiológicas se alteran considerablemente en respuesta al ejercicio crónico. Para investigar los mecanismos subyacentes que producen diversas adaptaciones del músculo, un número de protocolos de ejercicio como la caminadora, rueda funcionamiento y ejercicio de natación se han utilizado en los estudios con animales. Sin embargo, estos ejercen modelos requieren un largo período de tiempo para lograr adaptaciones musculares, que pueden ser también reguladas por factores humorales o neurológicos, lo que limita sus aplicaciones en el estudio de las adaptaciones inducidas por la contracción músculo-específica. Estimulación indirecta baja frecuencia (10 Hz) para inducir la actividad contráctil crónica (CCA) se ha utilizado como un modelo alternativo de entrenamiento, con éxito puede llevar a adaptaciones mitocondriales musculares dentro de 7 días, independientes de factores sistémicos. Este documento detalla las técnicas quirúrgicas necesarias para aplicar el tratamiento de CCA en el músculo esquelético de ratas, para estudios de aplicación generalizada en el futuro.

Hemos demostrado que la actividad contráctil crónica (CCA) es una herramienta eficaz para inducir adaptaciones favorables mitocondriales en músculo esquelético. Ratas sometidas a 7 días de la CCA (6 h al día) pantalla mejorada la Biogénesis mitocondrial en el músculo estimulado en comparación con el miembro posterior contralateral sin estimular (control). Este aumento de la Biogénesis mitocondrial se indica por la expresión creciente de la proteína de PGC-1α (Figura 3...

Este protocolo describe el uso del modelo de actividad contráctil crónica de ejercicio observar adaptaciones del músculo esquelético inducida por el estímulo en la trasera de la rata.

Aplicación de la estimulación crónica para estudiar adaptaciones fenotípicas de músculo esquelético de rata inducida por actividad contráctil

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

El modelo de actividad contráctil crónica del ejercicio es útil para estudiar in vivo las adaptaciones del músculo esquelético a los estímulos del entrenamiento del ejercicio. En particular, este modelo provoca las adaptaciones fenotípicas de un protocolo de entrenamiento de seis semanas en siete días. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología muscular, como la biogénesis mitocondrial, la autofagia y muchas otras adaptaciones celulares asociadas al ejercicio.La principal ventaja de esta técnica es que permite observar las adaptaciones específicas de los músculos en un corto período de tiempo de siete días en comparación con otros protocolos de entrenamiento con ejercicios que requieren varios meses. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la atrofia muscular porque se ha demostrado que la estimulación muscular crónica tiene un efecto en la mejora de la debilidad muscular relacionada con el envejecimiento. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la dificultad para marcar el nervio peroneo común y colocar bobinas eléctricas en ambos extremos, ya que requieren práctica y precisión.Comience por anestesiar a la rata bajo una inhalación de 1 a 3% de isoflurano con oxígeno y confirme la sedación completa verificando la respuesta a un pellizco de la extremidad trasera y observando la profundidad y la frecuencia respiratoria. Aplique lubricante ocular en los ojos para evitar la sequedad y coloque a la rata en una almohadilla térmica a una temperatura baja a media. Afeita suavemente la extremidad trasera izquierda, así como una tira alrededor del torso desde la parte posterior del cuello, alrededor de detrás de las extremidades anteriores y a través del tórax anterior.Limpie suavemente las áreas afeitadas con yodo y alcohol etílico para desinfectar. Con el animal acostado boca abajo, use un bisturí estéril con una hoja número 10 para hacer una pequeña incisión de alrededor de 0,5 centímetros en la parte posterior del cuello en el centro de la región afeitada. Luego enrolle el animal sobre su lado derecho y haga un corte de dos a tres centímetros en la piel de la extremidad trasera izquierda entre el hoyuelo de la articulación de la rodilla y cerca del origen de la cola.Con unas tijeras quirúrgicas curvas de punta roma, diseccione el área subcutánea hasta unos 3,5 a cuatro centímetros, separando la piel del músculo subyacente para hacer un bolsillo entre la piel abierta y el músculo subyacente. A continuación, utilice unas tijeras quirúrgicas para hacer una pequeña incisión de menos de 0,5 centímetros en el músculo bíceps femoral, asegurándose de que las puntas de las tijeras corten directamente a través del músculo. A continuación, abra suavemente la zona de corte hasta que los grupos musculares internos y el nervio peroneo común sean visibles.Tenga mucho cuidado para evitar cortar o dañar el nervio. A continuación, prepare de 50 a 60 centímetros de alambre fino de acero inoxidable recubierto de PTFE y dóblelo por la mitad. Enganche la parte doblada del cable en la ranura de una varilla de acero inoxidable de 30 centímetros.Use la varilla para pasar el alambre a través del bolsillo abierto de la extremidad trasera, subiendo por la pierna y a lo largo del centro de la espalda en un patrón en forma de L para llegar a la pequeña área de incisión en la parte posterior del cuello. Arregle la ventana tirando de ella para abrirla con retractores de metal hasta que el tamaño de la ventana sea de aproximadamente 1,5 centímetros cuadrados con el nervio peroneo en el centro de la ventana. Con un bisturí, pele con cuidado los extremos del alambre 1,5 centímetros.Envuelve los extremos del alambre pelado alrededor de una aguja desafilada de calibre 21 cinco veces para hacer una bobina. Una vez que las bobinas estén hechas correctamente, suelte la aguja de ellas. Haga un nudo en el extremo de la bobina y suérela en el lado izquierdo del nervio, asegurándose de que la bobina esté a 1,5 a 2,5 milímetros del nervio.Para asegurar la bobina, aplique dos o tres suturas adicionales a lo largo de la bobina. Este paso requiere mucha práctica y paciencia para evitar dañar el nervio y el músculo subyacente y lograr todas las condiciones de estimulación consistentes en todos los animales. Lo mejor es contar con un investigador capacitado para completar todos los procedimientos quirúrgicos durante un estudio.Aplique dos o tres gotas de solución antibiótica y luego suture cuidadosamente la ventana con seda tamaño 5-0. Enrolle sin apretar la cuerda floja restante del alambre y empújela en el bolsillo subcutáneo por encima de la incisión suturada del músculo bíceps femoral por encima de la cadera. Aplique dos o tres gotas de solución antibiótica y cierre la piel abierta con grapas.A continuación, mueva al animal a la posición esternal y corte el lazo de alambre que sale de la incisión en la parte superior del cuello para crear dos extremos de alambre. Con un bisturí, pela los extremos de los alambres 0,5 centímetros. Corta los cables deshilachados.Empuje lentamente las partes peladas de los cables en el orificio de los zócalos de las clavijas y, con un soldador, suelde los cables en los zócalos de las clavijas. Pase los extremos del cable conectado con clavijas a través de una gasa estéril de 4,4 centímetros. Luego pase los cables a través del orificio en la base de la caja del estimulador.Inserte las clavijas en los zócalos de conexión de la unidad CCA. Coloque suavemente la unidad CCA en la cámara con una tachuela adhesiva para asegurar la unidad CCA en la parte inferior de la cámara. Use cinta adhesiva o cinta quirúrgica porosa para fijar la cámara alrededor del torso afeitado.Cierre la parte superior de la cámara con tres capas de cinta adhesiva. Y termine envolviendo con cinta adhesiva los lados de la caja del estimulador para asegurar la caja. Compruebe si el CCA está funcionando exponiendo la unidad a un solo pulso de luz infrarroja emitida por una luz estroboscópica infrarroja portátil.Si el CCA funciona correctamente, los músculos de las extremidades traseras se contraerán en respuesta a la luz infrarroja. Pese a los animales poco antes de comenzar el procedimiento de CCA para registrar una medición de referencia que ayude a identificar cualquier estrés severo o efectos adversos por el cambio de peso corporal después del procedimiento de CCA. El día de la estimulación CCA, encienda el CCA exponiendo la unidad estimuladora a un solo pulso de luz infrarroja mediante una luz estroboscópica infrarroja portátil y aplique tres o seis horas de estimulación CCA de 10 hercios.Revise la estimulación y el animal cada 30 a 60 minutos. Después del período CCA deseado, apague la unidad CCA mediante la exposición a la luz infrarroja. Las ratas sometidas a siete días de CCA durante seis horas al día muestran una biogénesis mitocondrial mejorada en el músculo estimulado en comparación con la extremidad posterior contralateral no estimulada.Este aumento en la biogénesis mitocondrial está indicado por el aumento de la expresión proteica de PGC-1 alfa. El examen de las fibras musculares permeabilizadas para medir la capacidad respiratoria mitocondrial revela que la ACC resultó en un aumento en la capacidad respiratoria máxima del músculo en relación con el músculo control. Tanto las poblaciones mitocondriales subsarcolemales como las intermiofibrilares aumentaron después de siete días de CCA en comparación con el músculo control no estimulado.Las adaptaciones a los sistemas de autofagia y lisosomal también pueden ser provocadas por la CCA. Se observa un aumento en la abundancia de proteínas del factor de transcripción EB, el principal regulador de la biogénesis lisosomal, después de la CCA en todos los puntos temporales. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como inyecciones subcutáneas o intraperitoneales generales, para responder a preguntas adicionales, como la estimación del flujo de autofagia con el tratamiento con colchicina.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar el modelo actual de actividad contráctil crónica para examinar los cambios fenotípicos musculares después del entrenamiento de resistencia.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Un In vivo Modelo de roedores de la contracción inducida por la lesión y la monitorización no invasiva de la recuperación

Este video demuestra los procedimientos quirúrgicos y preparaciones necesarios para estudiar las respuestas contráctiles del músculo gastrocnemio medial de rata in situ. Esta preparación permite la medición de las propiedades contráctiles del músculo esquelético bajo condiciones fisiológicas. El animal se anestesia y el músculo se separa del tejido circundante en su extremo distal. El tendón de Aquiles se conecta a un transductor de fuerza, lo que permite medir la respuesta contráctil del...

Procedimientos para la Rata In situ Propiedades contráctiles del músculo esquelético

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Evaluación ex vivo de la contractilidad, fatigabilidad y alternancia en aislados músculos esqueléticos

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Ingeniería y caracterización de un modelo optogenético de la unión neuromuscular humana

Se presenta un conjunto de protocolos que describen la medición de la función contráctil a través de la detección de la longitud del sarcómero junto con la medición transitoria de calcio (Ca2+) en miocitos aislados de rata. También se incluye la aplicación de este enfoque para estudios en modelos animales de insuficiencia cardíaca.

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La claridad óptica es una gran ventaja para el trabajo biológico y fisiológico celular en el pez cebra. Se describen métodos robustos para medir el crecimiento celular en animales individuales que permiten nuevos conocimientos sobre cómo el crecimiento del músculo esquelético y los tejidos vecinos se integran con el crecimiento de todo el cuerpo.

Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada

Aquí, presentamos un protocolo novedoso para medir de forma no invasiva la relación torque-velocidad angular-potencia in vivo en flexores plantares de rata mediante estimulación muscular transcutánea. Esta configuración permite una prueba simple de las contracciones musculares isotónicas en un sistema de controlador de longitud / transductor de fuerza para representar mejor la naturaleza de carga constante de los movimientos cotidianos.

Construcción de perfiles de par-velocidad-potencia de carga constante (isotónicos) y de velocidad constante (isocinéticos) in vivo para los flexores plantares de rata

Aprende a aplicar el modelo de actividad contráctil crónica para estudiar adaptaciones fenotípicas del músculo esquelético en ratas. Este método permite observar cambios mitocondriales y autofágicos en solo siete días.

Aplicación de la estimulación crónica para estudiar adaptaciones fenotípicas de músculo esquelético de rata inducida por actividad contráctil (Video) | JoVE Journal

Aplicación de la estimulación crónica para estudiar adaptaciones fenotípicas de músculo esquelético de rata inducida por actividad contráctil

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