Name: División ingeniería-TET2 enzima ADN químico-inducible Hydroxymethylation y remodelación epigenéticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprende a utilizar la enzima CiDER para controlar temporalmente la hidroximetilación del ADN y el remodelado epigenético en células mamíferas mediante inductores químicos. Este método permite estudiar la regulación epigenética con precisión experimental.

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Agradecemos a la concesión de ayudas de los institutos nacionales de salud (R01GM112003 a YZ), la Fundación de Welch (BE-1913 a YZ), la sociedad americana del cáncer (RSG-16-215-01 TBE a YZ), la prevención del cáncer y Research Institute of Texas (RR140053 al albergue, RP170660 a YZ), la Asociación Americana del corazón (16IRG27250155 al albergue) y el programa de premios de investigación Fundación de John S. Dunn.

1. cultivo, transfección de plásmidos e inducción química de la célula
<ol>
	<li>Cultura una línea de células adherentes (por ejemplo, el humano embrionario riñón células HEK293T) en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementada con 10% suero bovino fetal inactivado con calor, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina en 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Transfectar las células con el plásmido de sidra.
	<ol>
		<li>Al menos 18 horas antes de la transfección, semilla 0.3 x 106 células en 2,5 mL de DMEM apropiado por bien en una placa de 6 pozos e incuban las células a 37 ° C durante la noche para llegar a 60-80% de confluencia.</li>
		<li>Precalentar el reactivo de transfección a temperatura ambiente antes de usar.</li>
		<li>Lugar 250 μl de medio sin suero en un tubo estéril. Nota: Esta cantidad se adapta para una placa de 6 pozos con 80% de confluencia. Si es necesario, ajustar proporcionalmente los importes medio según los tamaños de placas o número de células.</li>
		<li>Añadir 2,5 μg de plásmido codificación de sidra18 o el dominio catalítico de TET2 (TET2CD como control positivo)12,13 en el medio libre de suero y suavemente mezclar mediante pipeteo.</li>
		<li>Añadir 7,5 μl de reactivo de transfección para la mezcla diluida de ADN y suavemente mezclar mediante pipeteo.</li>
		<li>Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20-30 min.</li>
		<li>Cambiar medio precalentado y añadir la mezcla mediante goteo a los pozos y agitar suavemente la placa de cultivo celular para distribuir uniformemente la mezcla de ADN y reactivo de transfección.</li>
		<li>Incube las células y la mezcla durante la noche y vuelva a colocar el reactivo de transfección con medios con 2ml de DMEM completo fresco.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inducción química
	<ol>
		<li>Diluir 2 mM de acción de la rapamicina (disuelto en DMSO) a una concentración de 20 μm en medio mas apropiado.</li>
		<li>Añadir 20 μl de la rapamicina diluida a células transfected mantenidas en medio de 2 mL a una concentración final de 200 nM. Nota: Después de la incubación durante 48 h, las células están listas para la cuantificación de la generación de 5hmC o cualquier otras aplicaciones posteriores. Si es necesario, la eficacia de la inducción puede ser por sacar células cada 3 h para la cuantificación de otros 5hmC como se describe a continuación y se muestra en la figura 1.</li>
		<li>Para la mejor cuantificación de la eficacia de la inducción de 5hmC, semilla separada pozos para supervisar células cada 3 horas.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. cuantificación de la producción de 5hmC inducida por la rapamicina por inmunotinción
<ol>
	<li>5hmC tinción de inmunofluorescencia Nota: Agregue una cantidad suficiente de la solución de fijación, compuesto de paraformaldehído al 4%, 0.2% de surfactante (como Tritón X-100) en PBS con HCl N 3, para cubrir todas las celdas de la placa. Por ejemplo, 500 μl de solución sería suficiente para un pozo en una placa de 6 pozos. Realizar todos los pasos a temperatura ambiente.<ol>
		<li>Para fijar las células, agregar paraformaldehído al 4% en PBS a las células tratados con rapamicina durante 15 min a temperatura ambiente. Para el grupo de control, utilice las células expresaban mCherry sidra sin tratamiento de rapamicina. No agitar. PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxico. Usar protección adecuada.</li>
		<li>Deseche la solución fijadora. Incube las células fijas con surfactante de 0.2% en PBS por 30 min a permeabilizar la membrana celular.</li>
		<li>Deseche la solución de permeabilización. Añadir HCl N 3 a las células permeabilized e incubar durante 15 min desnaturalizar el ADN.</li>
		<li>Desechar el tampón de HCl. agregar 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) a las células durante 10 min para la neutralización del pH.</li>
		<li>Deseche toda la solución. Lavar las células con PBS para 3 - 5 veces. Remover minuciosamente el PBS. Nota: Agregue una cantidad suficiente de PBS para cada paso de lavado. Por ejemplo, 1 mL de PBS es suficiente para una placa de 6 pozos.</li>
		<li>Bloquear las células mediante la adición de la solución amortiguadora de bloqueo formado por 1% de BSA y 0.05% de surfactante (como Tween 20) en PBS durante 1 h con agitación suave.</li>
		<li>Deseche la solución de bloqueo. Añadir el anticuerpo 5hmC diluido (1: 200) a las células e incubar 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.</li>
		<li>Lavar las células con PBS 3 veces durante 15 minutos.</li>
		<li>Añadir un fluoróforo diluido (FITC)-conjugado de anticuerpo secundario (1: 200) a las células e incubar durante 1 h.</li>
		<li>Lavar las células con PBS tres veces ampliamente para eliminar anticuerpos residuales.</li>
		<li>Añadir 250 ng/mL de 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para teñir el núcleo 5 minutos retirar la solución de tinción.</li>
		<li>Montaje de la diapositiva o el fondo de cristal placa de cultivo con células immunostained para la proyección de imagen confocal. Un resultado representativo fue mostrado en la figura 1B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Citometría de flujo Nota: Use una placa 96 pocillos redondos inferior para el siguiente procedimiento de tinción. Generalmente, 150 μL de los reactivos es suficiente para cada pozo.<ol>
		<li>Resuspender las células transfected y rapamicina-inducida en tampón FACS (PBS con 1% BSA, 2 mM EDTA). Para el grupo de control, utilice sidra-expresar las células sin tratamiento de rapamicina.</li>
		<li>Fijar y permeabilizar las células como se describe en el paso 2.1.</li>
		<li>Añadir ácido clorhídrico N 2 a las células para desnaturalizar el ADN durante 10 minutos.</li>
		<li>Deseche el HCl. neutralizar y bloquear las células como se describe en el paso 2.1.</li>
		<li>Añadir un anticuerpo anti-5hmC diluido (1: 200) a las células e incubar 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.</li>
		<li>Lavar las células con tampón FACS tres veces. Extraiga el tampón FACS cuidadosamente.</li>
		<li>Añadir un fluoróforo diluido (FITC)-conjugado de anticuerpo secundario (1: 400) para celular activado por fluorescencia clasificación análisis (FACS) e incubar 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar las células con tampón FACS tres veces.</li>
		<li>La muestras están listas para el análisis FACS. Un resultado representativo se muestra en la figura 1-D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. dot-blot ensayo para cuantificar 5hmC y la 5-METILCITOSINA (5mC) asciende
<ol>
	<li>Aislar el ADN genómico de células transfected y rapamicina-inducida utilizando un kit comercial de extracción de ADN. Para el grupo de control, utilice sidra-transfected las células sin tratamiento de rapamicina.</li>
	<li>Calor de la estufa de vacío a una membrana de nitrocelulosa 80 ° C y remojo previo en agua destilada doble H2O y luego 6 x buffer citrato salino-sódico (SSC) durante 10 minutos.</li>
	<li>Carga 60 μL de cantidades iguales de DNA (total 2 μg en tampón TE) a una placa de PCR de 96 pocillos. Añadir 30 μl de tampón TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) a los pozos del resto.</li>
	<li>Hacer diluciones dobles en serie vertical en la placa de 96 pocillos transfiriendo 30 μl de la solución en fila 1 en la misma posición de columna en la fila 2. Mezclar otra vez y 30 μl de solución de transferencia a los pocillos de la fila posterior hasta alcanzar el límite.</li></ol>Quite la última 30 μl.
	<li>Añadir 20 μl de 1 M NaOH y 10 mM EDTA a cada pocillo, sellar la placa y calentar la mezcla durante 10 minutos a 95 ° C para desnaturalizar completamente el duplex de la DNA.</li>
	<li>Inmediatamente enfriar las muestras en hielo y añadir 50 μl de acetato de amonio de 2 M helada (pH 7.0) e incubar en hielo durante 10 minutos. Nota: Medidas 3.7-3.10 implica el uso de vacío.</li>
	<li>Montar el aparato de dot blot con membrana previamente remojada y quitar búfer residual mediante vacío completo.</li>
	<li>Lavar la membrana mediante la adición de 200 μL de buffer TE a cada pocillo del aparato dot blot. Gire en vacío para quitar el tampón TE.</li>
	<li>El ADN desnaturalizado (preparado en pasos anteriores 3.1-3.6) a cada pocillo del aparato de la mancha blanca /negra del punto de carga. Gire en vacío para eliminar la solución.</li>
	<li>Lavar la membrana mediante la adición de 200 μL de 2 x SSC y quitar residual soluciones completamente vacío.</li>
	<li>Desarme el aparato de dot blot, saca la membrana y enjuague la membrana entera con 20 mL de 2 x SSC.</li>
	<li>Secar la membrana por 20 min.</li>
	<li>Cueza al horno la membrana a 80 ° C bajo vacío por 2 h.</li>
	<li>Añadir la solución de bloqueo (5% descremada leche en TBST) a la membrana e incubar 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche la solución de bloqueo. Añadir un 5hmC diluido (1:5, 000) o 5mC (1:1, 000) anticuerpos a la membrana e incubar durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar la membrana con TBST tres veces durante 10 min para eliminar anticuerpos residuales. Quitar fondo TBST.</li>
	<li>Añadir un anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:10, 000 de anti-conejo HRP(5hmC) o 1:3,000 de anti-ratón HRP(5mC)) a la membrana e incubar 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar la membrana con TBST tres veces durante 10 minutos.</li>
	<li>Añadir western blotting sustrato a la membrana para la visualización de las señales de 5hmC utilizando un detector de quimioluminiscencia de ECL. Un resultado representativo se muestra en la Figura 1E.</li>

<ol><li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectv+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+readers+for+5-%28hydroxy%29methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li>
<li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290(2016).</li>
<li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li>
<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li>
<li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET+family+proteins%3A+oxidation+activity%2C+interacting+molecules%2C+and+functions+in+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex%3A+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15796538">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li>
<li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li>
</ol>

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Aquí hemos ilustrado el uso de una enzima de split-TET2 ingeniería para lograr un control temporal de hydroxymethylation de ADN. Tras el descubrimiento de la familia de TET de 5 methycytosine dioxigenasa, se han realizado muchos estudios para descifrar las funciones biológicas de las proteínas de TET y sus principales productos catalíticos 5hmC1,2,3, 4,5...

La metilación del ADN, en su mayoría se refiere a la adición de un grupo metilo a la posición del carbono 5 del citosina para formar 5-METILCITOSINA (5mC), es catalizada por la DNA metil-transferasa (DNMTs). 5mC actúa como una marca epigenética más importante en el genoma mamífero que a menudo las señales de represión transcripcional, la inactivación del X-cromosoma y transposon silenciamiento1. La inversión de la metilación del ADN está mediada por la familia de proteínas diez elfos desplazamiento (TET). Enzimas de TET pertenecen al hierro (II) y 2-oxoglutarato dioxygenases dependiente que catalizan la oxidación sucesiva de 5mC 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (fC 5) y 5-carboxycytosine (5caC). Oxidación mediada por TET 5mC impone una capa adicional de control epigenético del genoma mamífero. El descubrimiento de TET ha despertado gran interés en el campo de la epigenético para desvelar las funciones biológicas de las proteínas del TET y sus 5hmC principales productos catalíticos. 5hmC no es sólo un intermedio durante el TET-mediada activa ADN desmetilación2,3,4, pero también actúa como un establo epigenético marca5,6,7,8 . Aunque hydroxymethylation de ADN es altamente correlacionado con la expresión génica y aberrante cambios en ADN hydroxymethylation se asocian con algunos trastornos humanos9,10,11, las relaciones causales entre las modificaciones epigenéticas en el ADN y los fenotipos permanecen a menudo difíciles de establecer, que se puede atribuir parcialmente a la falta de una herramienta confiable con precisión agregar o quitar modificaciones de ADN en el genoma en definida temporal y espacial resolución.
Aquí divulgamos el uso de un epigenoma químicas inducibles remodelación herramienta (sidra) para superar el obstáculo que enfrentan los estudios de las relaciones causales entre ADN hydroxymethylation y gene la transcripción. El diseño se basa en el supuesto de que el dominio catalítico de TET2 (TET2CD) puede dividirse en dos fragmentos inactivos cuando se expresa en células de mamíferos y su función enzimática puede ser restaurado por un enfoque de dimerización químicamente inducible ( Figura 1A). Para establecer un sistema split-TET2CD, se seleccionaron seis sitios en TET2CD, compuesto de una región rica en Cys y un pliegue doble hebra β-helix (DSBH), sobre la base de una estructura cristalina divulgado del complejo TET2-ADN que carece de una complejidad baja región12. Un gen sintético que codifica proteína inducible por la rapamicina dimerización módulo FK506 12 (FKBP12) y dominio de unión a rapamicina FKBP (FRB) del blanco mamífero de rapamicina14,15, junto con un péptido auto Hendedoras T2A polipéptido secuencia16,17, individualmente fue insertado en los sitios de fractura seleccionados en TET2CD. La selección de TET2 como nuestro destino de ingeniería se basa en las siguientes consideraciones. En primer lugar, somáticas mutaciones en TET2 con reducción concomitante de ADN hydroxymethylation se observan con frecuencia en desordenes humanos incluyendo desordenes mieloides y cáncer10, que proporciona información útil en sitios sensibles a evitarse para inserción. En segundo lugar, una gran parte del dominio catalítico TET2, particularmente la región de baja complejidad, es prescindible para la función enzimática12, lo que nos permite diseñar un split-TET2 minimizado por modificaciones epigenéticas inducibles. Después de evaluar más de 15 construcciones, una construcción que exhiben restauración rapamicina-inducible más alto de su actividad enzimática en el sistema mamífero fue elegida y designada como sidra18. En este documento se describe el uso de sidra etiquetada mCherry inducible ADN hydroxymethylation y remodelación epigenéticos con rapamicina y presentan tres métodos para la validación de 5hmC mediada por la sidra de producción en un sistema celular modelo HEK293T.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamina 2000 Reactivo de transfección</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37094</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído, solución al 16%</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Amresco</td><td>0369-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina, Bovino</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>5-Hidroximetilcitosina (5-hmC) anticuerpo (pAb)</td><td>Motivo activo</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG (H+L) Anticuerpo secundario adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenilindolde (DAPI)</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td></td></tr><tr><td>SVAC1E SHEL LAB Horno de vacío económico, 0.6 pies cúbicos (17 L)</td><td>SHEL LAB</td><td>SVAC1E</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SSC, 20X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15557036</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparatus</td><td>BIO-RAD</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-5-metilcitosina (5mC), clon 33D3</td><td>Millipore</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón IgG anticuerpo ligado a HRP</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-conejo IgG, Tecnología de señalización de células de anticuerpos ligada a HRP</td><td></td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>West-Q Pico Dura ECL Solution</td><td>Gendepot</td><td>W3653-100</td><td></td></tr></tbody></table>

división ingeniería-tet2 enzima adn químico-inducible hydroxymethylation y remodelación epigenéticos

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

Metilación del ADN es una modificación epigenética estable y heredable en el genoma mamífero y participa en la regulación de expresión génica para controlar las funciones celulares. La inversión de la metilación del ADN o la desmetilación del ADN, está mediada por la familia de proteínas de translocación (TET) de diez-once de dioxygenases. Aunque se ha reportado ampliamente que aberrante metilación del ADN y desmetilación se asocian a defectos del desarrollo y cáncer, cómo estos cambios epigenéticos contribuyen directamente a la posterior alteración en la progresión de enfermedad o expresión de gen sigue siendo confuso, en gran parte debido a la falta de herramientas fiables para exactamente agregar o quitar modificaciones de ADN en el genoma en resolución temporal y espacial definido. Para superar este obstáculo, se diseñó una enzima TET2 split para permitir el control temporal de la 5-METILCITOSINA (5mC) oxidación y posterior remodelación de Estados epigenéticos en células de mamífero simplemente añadiendo productos químicos. Aquí, describimos los métodos para la introducción de una herramienta remodelación del epigenoma química-inducible (sidra), basado en una enzima ingeniería split-TET2, en células de mamífero y cuantificar la producción inducible química de la 5-hidroximetilcitosina (5hmC) con immunostaining, citometría de flujo o un análisis de dot-blot. Esta herramienta remodelación del epigenoma inducible por la química encuentra amplio uso interrogando a sistemas celulares sin alterar el código genético, así como en las relaciones epigenotype−phenotype de sondeo en diversos sistemas biológicos.

Conversión química de 5mC para 5hmC inducible puede validarse por inmunotinción a nivel unicelular, análisis de citometría de flujo en poblaciones de la célula (positivo de mCherry) transfected o un análisis más cuantitativo de dot-blot como se ilustra en la figura 1. El dominio catalítico de TET2 o TET2CD, fueron utilizados a lo largo del estudio como control positivo. Ver referencias 18-20 para más detalles sobre el mapeo del genoma de los cambios inducidos...

Protocolos detallados para la introducción de una enzima de la división ingeniería-TET2 (sidra) en células de mamífero para químicas inducible hydroxymethylation de ADN y remodelación epigenéticos se presentan.

División ingeniería-TET2 enzima ADN químico-inducible Hydroxymethylation y remodelación epigenéticos

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

El objetivo general de esta serie de experimentos es introducir una enzima TET2 dividida diseñada llamada CiDER en células de mamíferos para la modificación inducible del ADN, como la hidroximetilación, así como la remodelación epigenética. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética, tales como: La principal ventaja de esta técnica es que la enzima TET2 dividida diseñada permite el control temporal de la oxidación de la 5-metilcitosina y la posterior remodelación de los estados epigenéticos en células de mamíferos con aditivos químicos. Para comenzar este procedimiento, cultive una línea celular adherente en DMEM suplementada con FBS inactivado por calor al 10%, así como 100 unidades por mililitro de penicilina y estreptomicina.Incubar las células a 37 grados centígrados con 5% de CO2. Transfectar las células con el plásmido CiDER como se describe en el protocolo de texto. Luego incube las células durante la noche a 37 grados centígrados.Al día siguiente, sustituya el medio que contiene el reactivo de transfección por un DMEM completo y nuevo. Para inducir químicamente las células, agregue 20 microlitros de Rapamicina diluida a las células transfectadas mantenidas en dos mililitros de medio para alcanzar una concentración final de 200 nanomolares. Para realizar la citometría de flujo, vuelva a suspender las células transfectadas e inducidas por rapamicina en el tampón FACS.Para el grupo de control, utilice células que expresan CiDER sin tratamiento con rapamicina. Fije y permeabilice las células como se describe en el protocolo de texto. Luego agregue dos ácidos clorhídricos normales a las células para desnaturalizar el ADN durante 10 minutos.Después de neutralizar y bloquear las células como se describe en el protocolo de texto, agregue el anticuerpo anti-5hmC diluido a las células. Incubar las células durante una hora a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, lavar las células con tampón FACS tres veces.Retire el búfer FACS por completo. Agregue un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo diluido para el análisis de FACS e incube durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, lave las células con tampón FACS tres veces.Después del lavado, las muestras están listas para el análisis FACS. Aísle el ADN genómico de células transfectadas e inducidas por rapamicina utilizando un kit comercial de extracción de ADN. Para el grupo de control, utilice células transfectadas con CiDER sin tratamiento con rapamicina.Calienta el horno al vacío a 80 grados centígrados. Remoje previamente la membrana de nitrocelulosa en agua bidestilada y luego en tampón 6X SSC durante 10 minutos. A continuación, cargue 60 microlitros de cantidades iguales de ADN en una placa de PCR de 96 pocillos.Agregue 30 microlitros de tampón TE al resto de los pocillos. Realice diluciones en serie dobles verticalmente en la placa de 96 pocillos transfiriendo 30 microlitros de solución en la fila uno a la misma posición de columna en la fila dos. Mezcle nuevamente y transfiera 30 microlitros de solución a los pocillos en la fila siguiente hasta alcanzar el límite.A continuación, retire los últimos 30 microlitros del pozo. A continuación, agregue 20 microlitros de hidróxido de sodio molar y 10 milimolares de EDTA a cada pocillo. Selle la placa y caliente la mezcla durante 10 minutos a 95 grados centígrados para desnaturalizar completamente el dúplex de ADN.Enfríe inmediatamente las muestras en hielo. Agregue 50 microlitros de acetato de amonio frío dos molares a cada pocillo e incube en hielo durante 10 minutos. Mientras tanto, ensamble el aparato de mancha de puntos con la membrana previamente empapada.Retire el tampón residual con una aspiradora completa. Lave la membrana añadiendo 200 microlitros de tampón TE a cada pocillo del aparato de dot-blot. Encienda la aspiradora para eliminar el tampón TE.A continuación, cargue el ADN desnaturalizado en cada pocillo del aparato de manchas de puntos. Encienda la aspiradora para eliminar la solución. Lave la membrana agregando 200 microlitros de SSC 2X y elimine las soluciones residuales por completo con una aspiradora.Desmonte el aparato de manchas de puntos. A continuación, saque la membrana y enjuague toda la membrana con 20 mililitros de 2X SSC. Seque la membrana al aire durante 20 minutos.Para secar aún más la membrana, hornéela a 80 grados al vacío durante dos horas. Agregue la solución de bloqueo a la membrana e incube durante una hora a temperatura ambiente. Después de desechar la solución de bloqueo, agregue los anticuerpos diluidos de 5-hmC o 5-mC a la membrana e incube durante la noche a cuatro grados centígrados.Lave la membrana con TBST tres veces durante 10 minutos para eliminar los anticuerpos residuales. Después de retirar completamente el TBST, agregue un anticuerpo secundario conjugado HRP a la membrana. Incubar la membrana durante una hora a temperatura ambiente.Lave la membrana con TBST tres veces durante 10 minutos. Por último, añada a la membrana un sustrato de Western blot ECL para la visualización de señales de 5-hmC mediante un detector de quimioluminiscencia. Aquí se muestra un resultado representativo de la cuantificación de la producción de 5-hmC mediada por CiDER mediante citometría de flujo.Solo las células que expresan CiDER en condiciones tratadas con rapamicina muestran un aumento significativo de los niveles de 5-hmC. Aquí se muestra un resultado representativo del cambio global del nivel de 5-hmC en toda la población celular mediante el ensayo dot-blot. El control de carga se visualiza mediante la tinción con azul de etileno de las cantidades totales de ADN de entrada.Los resultados demuestran que el tratamiento con rapamicina induce una producción robusta de 5-hmC en células HEK293T que expresan CiDER con una actividad de fondo insignificante. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una semana si se realiza correctamente. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética exploraran la función celular sin alterar el código genético y para investigar las relaciones entre el epigenotipo y el fenotipo en varios sistemas biológicos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

El EpiMark 5 HMC y 5-MC Kit de análisis se puede utilizar para analizar y cuantificar la 5-metilcitosina y 5 hidroximetilcitosina dentro de un lugar específico de la SPE. El kit distingue 5-MC de 5 HMC por la adición de glucosa al grupo hidroxilo de la 5-HMC a través de una reacción enzimática utilizando β-glucosiltransferasa (T4-BGT). Cuando el 5-HMC se produce en el contexto de las CCGG, esta modificación convierte un sitio escindible MspI a un sitio no escindibles.

Alta sensibilidad de detección de 5 hidroximetilcitosina en el tejido cerebral Balb / C

ADN y las proteínas se marcan secuencia específicamente con afinidad o grupos indicadores fluorescentes usando ADN o de proteínas metiltransferasas y análogos sintéticos de cofactor. Dependiendo de la especificidad de cofactor de las enzimas, aziridina o dobles análogos de cofactores activados se emplean para el etiquetado de uno o dos pasos.

Etiquetado específico de secuencia de ácidos nucleicos y proteínas con metiltransferasas y el cofactor Análogos

Aquí, presentamos un protocolo para una purificación eficiente solo paso del humano sin etiquetar activo desplazamiento de diez-once-2 (TET2) 5-METILCITOSINA dioxygenase utilizando cromatografía de intercambio iónico y su ensayo con una masa líquida de la cromatografía-tandem Espectrometría (LC-MS/MS)-enfoque basado en.

Eficiente purificación y desarrollo análisis LC-MS/MS-based para diez-once 2 desplazamiento 5-METILCITOSINA dioxigenasa

Reglamento de medio ambiente de la cromatina es un proceso esencial para expresión génica adecuada. Aquí, describimos un método para controlar la expresión génica a través de la contratación de modificadores de la cromatina maquinaria de manera gene-específica y reversible.

Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas

A ADN epigenoma edición representa un potente enfoque terapéutico. Este protocolo describe la producción, purificación y concentración de vectores lentivirales all-in-one que el transgén CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicaciones de edición de epigenoma en células pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)-derivado de las neuronas.

Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de las herramientas de edición de epigenoma en humanos inducida por modelos de enfermedad derivados de células madre pluripotentes

Las endonucleasas de restricción con nueva especificidad de secuencia se pueden desarrollar a partir de enzimas que reconocen una secuencia parcialmente degenerada. Aquí proporcionamos un protocolo detallado que utilizamos con éxito para alterar la especificidad de la secuencia de la enzima NlaIV. Los ingredientes clave del protocolo son la compartimentación in vitro de la reacción de transcripción/traducción y la selección de variantes con nuevas especificidades de secuencia.

In Vitro dirigió la evolución de una endonucleasa de restricción con una especificidad más estricta

Aquí presentamos un método que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección para generar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sin necesidad de transfección génica o vectores retrovirales. Esta estrategia es, por lo tanto, prometedora para la medicina traslacional y representa un avance notable en la tecnología de organoides de células madre.

Una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos

Las metiltransferasas de ADN son posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Aquí, se presenta un protocolo para evaluar moléculas pequeñas para la inhibición de la metiltransferasa de ADN. Este ensayo utiliza una endonucleasa para acoplar la metilación del ADN a la generación de fluorescencia y permite monitorear la actividad enzimática en tiempo real.

Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

Aquí, presentamos un protocolo para la selección in vitro de represores transcripcionales (ETR) diseñados con una alta eficiencia de silenciamiento estable, estable y a largo plazo y una baja actividad fuera del objetivo en todo el genoma. Este flujo de trabajo permite reducir un repertorio inicial y complejo de ETR candidatos a una lista corta, adecuada para una evaluación posterior en entornos terapéuticamente relevantes.

In vitro Selección de represores transcripcionales diseñados para el silenciamiento epigenético dirigido

Aquí, presentamos un protocolo para reducir las modificaciones del ADN en bacteriófagos utilizando la enzima NgTET, lo que permite una mutagénesis CRISPR-Cas eficiente y sin cicatrices. Este método facilita la ingeniería genética de fagos para aplicaciones en biotecnología y terapia con fagos.

Mutagénesis precisa de fagos con sistemas CRISPR-Cas asistidos por NgTET

Este protocolo describe un sistema episomal no integrador basado en CRISPR/dCas9 para la edición epigenética dirigida en células K562, combinando efectores dCas9-DNMT3A y dCas9-HDAC1 con sgRNAs específicos para inducir la metilación del ADN específica del locus con precisión y efectos fuera del objetivo reducidos.

Ingeniería epigenética de células K562: estrategia episomal de doble vector para la metilación estable del ADN dirigida utilizando proteínas de fusión dCas9-DNMT3A y -HDAC1

Aprende a utilizar la enzima CiDER para controlar temporalmente la hidroximetilación del ADN y el remodelado epigenético en células mamíferas mediante inductores químicos. Este método permite estudiar la regulación epigenética con precisión experimental.

División ingeniería-TET2 enzima ADN químico-inducible Hydroxymethylation y remodelación epigenéticos

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