Selección de aptámeros ADN enlace de éster ácido ftálico, caracterización y aplicación a un Aptasensor electroquímico

El objetivo general de este procedimiento es seleccionar aptámeros de ADN específicos de un grupo para moléculas pequeñas altamente hidrofóbicas y utilizar el aptámero seleccionado para desarrollar un biosensor electroquímico sensible. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la selección de aptámeros, sobre cómo seleccionar y caracterizar aptámeros específicos de grupo cuando los objetivos son moléculas altamente hidrofóbicas. Mientras que la parte más útil de este método es el desarrollo de biosensores electroquímicos, para la detección de títulos.

Estos biosensores también deberían funcionar para nuestras mediciones de afinidad de aptámeros. Para comenzar la reacción, agregue 100 microlitros de agua libre de ARNasa al producto PCR de aptámero purificado. Agite la mezcla hasta que el precipitado se haya disuelto.

La reacción de la exonucleasa lambda es sensible a la concentración de sal y es un producto que debe proliferar por precipitación de etanol pero otro isopropanol. Coloque en cada uno de los cinco tubos de microcentrífuga, cinco microlitros de la solución de aptámero, 11 microlitros de agua libre de Rnasa y dos microlitros de tampón de reacción 10x. Agregue dos microlitros de agua libre de Rnasa y soluciones de dos, cinco, ocho y 10 unidades de exonucleasa lambda en agua libre de Rnasa a un tubo cada una.

Mezclar bien con un pipeteo suave. Incubar los tubos a 37 grados centígrados durante 35 minutos y a 80 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, sostenga los tubos a cuatro grados centígrados y prepare un gel de página nativo al 12%.

Añadir a cada tubo un microlitro de colorante de carga y cuatro microlitros de agua libre de Rnasa. Ejecute las mezclas en el gel de página nativo a 150 voltios durante 45 minutos. Identifique la cantidad más baja de exonucleasa lambda necesaria para generar completamente ADN monocatenario.

Realice una reacción a gran escala para generar ADN monocatenario. Para cada objetivo de unión que se va a probar, incubar 10 microlitros de perlas magnéticas codificadas con DBP funcionalizado medio con 500 microlitros de una solución micromolar de DBP-1 durante una hora a temperatura ambiente mientras gira. A continuación, deseche el sobrenadante.

Lave las perlas cuatro veces con porciones de 200 microlitros de tampón aglutinante de PAE y vuelva a suspender las perlas en 10 microlitros de tampón aglutinante PAE. Obtenga 10 dispersiones de prueba de diana de unión micromolar en tampón de unión a PAE. Es excelente para la dispersión de los objetivos hidrofóbicos en el tampón de unión PAE.

Para garantizar que, hay enriquecimiento de la biblioteca, se seleccionaron bajo pruebas de afinidad. Agregue 10 microlitros de perlas codificadas DBP-1 a 110 microlitros de cada solución de prueba objetivo. Incubar las mezclas durante una hora y recoger los sobrenadantes por separación magnética.

Diluir los sobrenadantes 100 veces y utilizar tres microlitros para cada PCR cuantitativa. Calcule las afinidades relativas dividiendo el número de DBP-1 liberados en presencia de la muestra de prueba por el número de DBP-1 liberados solo en el tampón de unión PAE. Antes de realizar las mediciones, sintetice y purifique la sonda de secuencia de núcleo tiolado basada en DBP-1 y la sonda de señalización.

Reconstituya la sonda tiolada y la sonda de señalización y como soluciones de 100 micromolares en agua libre de nucleasas. A continuación, pula un electrodo de oro de dos milímetros de diámetro hasta convertirlo en una superficie similar a un espejo con polvo de alúmina de 0,3 y 0,5 micras y un paño de microfibra durante cinco minutos cada uno. Sonicar el electrodo en agua ultrapura durante cinco minutos después de cada pulido.

Sumerja el electrodo pulido en una solución 0,5 molar de ácido sulfúrico. Limpie el electrodo con 35 voltamperometrías cíclicas sucesivas de menos 0,4 a 1,2 voltios positivos en comparación con el calomel de mercurio a 100 milivoltios por segundo. A continuación, prepare en un tubo centrífugo de pared delgada una mezcla de sonda tiolada DBP-1 de 0,5 micromolares.

Y 0,5 micromolares FC modificado DBP-1 en 100 microlitros de PBS. Calienta la mezcla en un baño de agua a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Luego deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente en el baño de agua.

Agregue un microlitro de una solución madre de TCEP de 10 milimolares a la mezcla enfriada y manténgala a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, sumerja el electrodo de oro limpio en la mezcla durante 12 horas a temperatura ambiente. Enjuague el electrodo con PBS y luego sumerja el electrodo en una solución de un milimolar de PEG tiolado en PBS durante una hora.

Enjuague bien el electrodo con tampón de unión de PAE libre de objetivos y sumerja el electrodo en el tampón. A continuación, sonique celdas electrolíticas de contraelectrodo de platino y un electrodo de referencia de calomel saturado durante dos minutos cada una en agua ultrapura y tampón de unión a PAE en secuencia. Abra el software del instrumento de onda cuadrada de voltamperometría e ingrese los parámetros del experimento.

Llene una celda electrolítica limpia con tampón de unión de PAE libre de objetivos. Conecte los tres electrodos limpios a un potenciostato y sumerja los electrodos en el tampón. Adquirir un escaneo SWV en segundo plano.

A continuación, sumerja el electrodo de trabajo de oro en una solución de DEHP de 10 picamolar en tampón de unión de PAE durante 30 minutos a temperatura ambiente. Enjuague bien el electrodo con tampón de unión PAE. Sumerja los tres electrodos en un tampón de unión de PAE nuevo y recoja otra curva SWV utilizando los mismos parámetros que antes.

Repita este proceso con concentraciones crecientes de DEHP para obtener una curva de valoración. Se encontró que la cantidad mínima de exonucleasa lambda necesaria para obtener solo ADN de cadena única era de dos unidades basadas en reacciones a pequeña escala. El candidato a aptámero DBP-1 fue identificado por SELEX seguido de una secuenciación de alto rendimiento.

DBP-1 mostró una buena especificidad de grupo para los congéneres de PAE. Un aptasensor electroquímico que utiliza DBP-1 respondió selectivamente al DEHP sobre otros contaminantes ambientales comunes. El aptasensor fue altamente sensible al DEHP con la respuesta a concentraciones tan bajas como 10 picamolar.

Láser de partículas donde selección y caracterización de aptámeros para pequeñas moléculas hidrofóbicas peligrosas. La caracterización y volatilización de aptámeros de moléculas pequeñas hidrofóbicas como el PAE es generalmente bastante desafiante, debido a la solubilidad en agua extremadamente limitada y al bajo peso molecular de los PAE. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo hacer un aptasensores electroquímicos y cómo usarlo para detectar los títulos.