Name: Un protocolo de laboratorio vivienda de turquesa killis (Nothobranchius furzeri) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprende a criar killifish turquesa en el laboratorio para estudiar envejecimiento y enfermedades relacionadas con Nothobranchius furzeri. Este protocolo estandarizado permite investigaciones de alto rendimiento sobre genética y ambiente.

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Agradecemos Alessandro Cellerino, Tyrone Genade, Anne Brunet, Sabrina Sharp, Mickie Powell, Simone Keil, Yumi Kim, Patrick Smith, Kai Mathar y todos los miembros del laboratorio de Valenzano en el Instituto Max Planck para la biología del envejecimiento que contribuyen a diferentes aspectos del actual protocolo de cría de killis en los años.

<ol><li>Valenzano, D. R., Aboobaker, A., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+aging+model+systems+and+why+we+need+them%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Non-canonical aging model systems and why we need them.</a> EMBO J. 36 (8), 959-963 (2017).</li>
<li>Harel, I., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish%3A+A+Model+for+Exploring+Vertebrate+Aging+and+Diseases+in+the+Fast+Lane%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish: A Model for Exploring Vertebrate Aging and Diseases in the Fast Lane.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 80, 275-279 (2015).</li>
<li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+life+span+by+the+gut+microbiota+in+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of life span by the gut microbiota in the short-lived African turquoise killifish.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+bush+to+the+bench%3A+the+annual+Nothobranchius+fishes+as+a+new+model+system+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 91 (2), 511-533 (2016).</li>
<li>Kim, Y., Nam, H. G., Valenzano, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short-lived+African+turquoise+killifish%3A+an+emerging+experimental+model+for+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The short-lived African turquoise killifish: an emerging experimental model for ageing.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 115-129 (2016).</li>
<li>Blazek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+intraspecific+divergence+in+life+span+and+aging+of+African+annual+fishes+along+an+aridity+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Repeated intraspecific divergence in life span and aging of African annual fishes along an aridity gradient.</a> Evolution. 71 (2), 386-402 (2017).</li>
<li>Terzibasi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+differences+in+aging+phenotype+between+strains+of+the+short-lived+annual+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large differences in aging phenotype between strains of the short-lived annual fish Nothobranchius furzeri.</a> PLoS One. 3 (12), e3866(2008).</li>
<li>Kirschner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+quantitative+trait+loci+controlling+lifespan+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri--a+new+vertebrate+model+for+age+research%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of quantitative trait loci controlling lifespan in the short-lived fish Nothobranchius furzeri--a new vertebrate model for age research.</a> Aging Cell. 11 (2), 252-261 (2012).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+loci+associated+with+tail+color+and+sex+determination+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping loci associated with tail color and sex determination in the short-lived fish Nothobranchius furzeri.</a> Genetics. 183 (4), 1385-1395 (2009).</li>
<li>Reichwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Sex+Chromosome+Evolution+and+Aging+from+the+Genome+of+a+Short-Lived+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish.</a> Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish+Genome+Provides+Insights+into+Evolution+and+Genetic+Architecture+of+Lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan.</a> Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).</li>
<li>Harel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+rapid+exploration+of+aging+and+diseases+in+a+naturally+short-lived+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for rapid exploration of aging and diseases in a naturally short-lived vertebrate.</a> Cell. 160 (5), 1013-1026 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., Sharp, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-Mediated+Transgenesis+in+the+Short-Lived+African+Killifish+Nothobranchius+furzeri%2C+a+Vertebrate+Model+for+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Transposon-Mediated Transgenesis in the Short-Lived African Killifish Nothobranchius furzeri, a Vertebrate Model for Aging.</a> G3. 1 (7), Bethesda. 531-538 (2011).</li>
<li>Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+approaches+for+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish.</a> Nat Protoc. 11 (10), 2010-2028 (2016).</li>
<li>Polacik, M., Blazek, R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+breeding+of+the+short-lived+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Nat Protoc. 11 (8), 1396-1413 (2016).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
</ol>

Los autores no declaran a no financieros y los intereses en competencia.

Se describe un protocolo para el cultivo de laboratorio de killis turquesa, colección embrionaria, incubación, así como vivienda de peces adultos, de cría y alimentación. Nuestro protocolo está dirigido específicamente a los laboratorios que realizan investigación en peces adultos, en particular para estudios experimentales sobre el envejecimiento y la vida. Killis turquesa pueden ser levantado en una instalación de peces cebra estándar; sin embargo, aspectos importantes de la cría de killis difieren de pez cebra estándar atención16. Estos ajustes incluyen la primera transición de una dieta única de camarón de salmuera a una dieta suplementada con gusano de sangre rica en proteínas, así como medidas específicas de incubación del embrión, que consiste en una etapa de incubación líquidos y secos.
Pasos críticos en el protocolo incluyen envío embriones dentro de 8-30 ° C de temperatura. En caso de reproducción, fecundidad depende de alimentación frecuencia y calidad de los alimentos; por lo tanto, se recomiendan por lo menos dos alimentaciones al día por cría tanque para elevar la producción de embriones (ver apartado 5.6.). Durante el blanqueamiento del embrión, no se extienden incubación del embrión en la solución de blanqueaba. Esto puede causar daño en el corion del huevo y mortalidad embrionaria creciente. Cuando incubar embriones con azul de metileno, no prolongar la incubación de embriones de la listo-a-hatch por más de 2 semanas como se reducirá dramáticamente su viabilidad. Para tramar killis turquesa, baja temperatura de la solución de ácido húmico mejora eclosión y una inmersión completa de los embriones en la solución permite la eclosión sincronizada. No suficiente aireación durante los resultados de incubación en las altas tasas de alevines no ha podido llenar la vejiga natatoria (fenotipo "vientre-slider", ver notas en la sección 5.1).
Limitación del protocolo para la cría incluye el uso del sustrato arena que plantea desafíos a centralizan sistemas de filtración y deben sustituirse por métodos alternativos en el futuro. Alternativas posibles podrían ser el uso del pez cebra tanques de cría. Embrión de blanqueo podría causar cambios físico-químicos en el corion del huevo que puede resultar en la fisiología alterada del corion y éxito de eclosión. Constante exposición de embriones a azul de metileno puede inducir cambios a largo plazo en fisiología de peces adultos. Criar peces adultos en tanques individuales para estudios de cohortes de supervivencia puede afectar negativamente salud y comportamiento de peces. Sin embargo, el alojamiento en grupo para los estudios de cohorte de supervivencia agrega importantes factores de confusión debido al establecimiento de la dominación social y territorios masculinos, llevando a la estricta jerarquía social. Por lo tanto, juzgamos que el aislamiento de peces machos para estudios de supervivencia es un compromiso razonable. Colonias de killis laboratorio alimentación con alimento vivo de fuentes no controladas añadir un riesgo de contaminación externa de los parásitos y comunidades microbianas potencialmente patógenas. En el futuro, se debe desarrollar una alimentación especial peces estériles.
Futuras mejoras en el presente Protocolo se centrarán en una dieta controlada, no vivo, que aún lidera a la finalización de la maduración sexual en 3-4 semanas. En Resumen, nuestro protocolo ofrece accesibilidad a killis turquesa laboratorio cultivo a una comunidad científica amplia.

Dada su vida corta y rápido ciclo de vida, killis turquesa están creciendo rápidamente como un prometedor nuevo organismo modelo en biología1,2,3. Esta especie se caracteriza por un único ciclo de vida para un teleósteos, consistiendo en diapausa embrionaria, rápida maduración sexual y una extendida vida post-reproductivos etapa4,5. Trabajo reciente ha contribuido a dilucidar la biología de esta especie en cautiverio y en el salvaje6,7. Killis turquesa viven en cuerpos de agua dulce estacionales que se forman durante la temporada de lluvias en la sabana africana en Zimbabwe y Mozambique. Durante la estación seca, los embriones sobreviven en el barro seco en la ausencia de agua en virtud de una etapa de vida resistente al estrés llamada diapausa.
Mapas genéticos de esta especie han generado8,9, y recientemente su genoma ha sido secuenciado y ensamblado10,11. Se han desarrollado varias variedades de peces de laboratorio endogámicas y transgénesis y edición vía CRISPR/Cas9 genómica se han convertido en disponibles en esta especie, de hecho promover killis turquesa como organismo modelo vertebrados laboratorio competitivo 1213,de,14.
Aunque ya ha sido publicado un protocolo de laboratorio para esta especie15, en el presente Protocolo desarrollamos una amplia lista de guías de laboratorio experimental que específicamente están dirigidas a estudios de investigación de envejecimiento y la supervivencia. El presente Protocolo permite a los investigadores ya están familiarizados con la cría de pez cebra y medaka ser versado en la cría de killis turquesa adoptando un mínimo de ajustes claves. Al mismo tiempo, este protocolo ofrece a los investigadores sin experiencia en la cría de peces con las herramientas esenciales para crear una floreciente Colonia de killis turquesa.

<table><tbody><tr><td>Solución tampón de calibración de la sonda pH = 7.0</td><td>Roth</td><td>A518.1</td><td>Solución tampón de 1 L pH = 7.0 para calibrar el electrodo de pH del sistema de agua</td></tr><tr><td>Solución tampón de calibración de sonda pH = 4.0</td><td>Roth</td><td>P712.1</td><td>Solución tampón de 1 L pH = 4.0 para calibrar el electrodo de pH del sistema de agua</td></tr><tr><td>Estándar de conductividad</td><td>VWR</td><td>83607.260</td><td>500 mL Estándar de conductividad 1.413 uS/cm para calibrar el sistema de agua electrodo de conductividad</td></tr><tr><td>Easy Strips Test 6in1</td><td>JBL</td><td>2533900</td><td>Tiras reactivas para la determinación de los valores de cloro del agua del sistema</td></tr><tr><td>Prueba de amoníaco</td><td>JBL</td><td>2536500</td><td>Prueba para determinar el contenido de amoníaco del agua del sistema</td></tr><tr><td>Sal del Mar</td><td></td><td></td> Rojo <td>Cubo de 22 kg</td></tr><tr><td>Carbonato de hidrógeno de sodio</td><td>VWR</td><td>27780.360</td><td></td></tr><tr><td>Ácido húmico</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>53680-50G</td><td></td></tr><tr><td>Nuevo enriquecimiento HUFA Artemia</td><td>Botella de 75 g</td>de <td>ZM Systems UK</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Roth</td><td>AE64.1</td><td></td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>31642-1L</td><td>30% (p/p)</td></tr><tr><td>Fibra de coco</td><td>Dragon</td><td>ZCS010</td><td></td></tr><tr><td>Papel Whatman</td><td>GE healthcare</td><td>3030-690</td><td></td></tr><tr><td>Etanol puro</td><td>VWR</td><td>20821.467</td><td>100%</td></tr><tr><td>Arena de sílice</td><td>tienda de mascotas</td><td></td><td></td>local</tr><tr><td>Artemia Huevos Lisadoras de primera calidad</td><td>Gusano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de sangre</td><td>distribuidor</td><td></td> local <td>Poseidon Aquakultur Alemania</td></tr><tr><td>Mezcla de soluciones dNTPs</td><td>Biolabs</td><td>N04472</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Taq ADN polimerasa</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>5U/uL</td></tr><tr><td>PCR 10x Tampón</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>50mM</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S8045-500g</td><td>50mM</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH=8.0 solución</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T2694-1L</td><td>1M</td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Peceras</td><td>Volumen de acuacultura</td><td></td><td>: 0,8 L, 2,8 L, 9,5 L; equipado con deflectores, malla para freír y tapas</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>VWR</td><td>89032-100</td><td>modelo 5000</td></tr><tr><td>incubadora microbiológica</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>50125882</td><td>modelo IMC18; para el almacenamiento de embriones en fase líquida, ajustado a t=27-28&deg; C</td></tr><tr><td>Incubadora de enfriamiento</td><td>Binder</td><td>9020-0209</td><td>modelo KT115; para el almacenamiento de embriones en fase sólida, ajustado a t=27-28&deg; C</td></tr><tr><td>Incubadora de incubación</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>51028114</td><td>modelo OGS180; para la eclosión de embriones, ajustada a t=27-28&deg; C</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td></td><td>modelo M80</td></tr><tr><td>Arena de cría/cajas de incubación</td><td>Roth</td><td>1598.1</td><td>1000mL</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473</td><td>92x16mm</td></tr><tr><td>50 mL Tubo cónico</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo cónico</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de plástico desechable</td><td>Roth</td><td>EA71.1</td><td>2 ml; Para la alimentación de peces con gusanos de sangre o selección de embriones, corte la punta para abrir 3-4 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Pipeta serológica</td><td>Sarstedt</td><td>86.1689.001</td><td>50mL</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4100-000V0</td><td>10mL</td></tr><tr><td>Colador</td><td></td><td></td> metálico <td>finura < 1 mm; para la recogida de embriones</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Dumont</td><td>0508-5/45-PO</td><td>tipo5/45; para la transferencia de embriones</td></tr><tr><td>25 L Incubadora de camarones en salmuera</td><td>Aquaneering</td><td>ZHBS25</td><td>nacedora principal</td></tr><tr><td>500 mL Incubadora de camarones en salmuera</td><td>JBL</td><td>6106100</td><td>modelo Artemio 1; incubadora</td></tr><tr><td>de respaldo Redes de pesca de malla estrecha</td><td>JBL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de arena</td><td>VWR</td><td>BURK7102-5000</td><td>5000mL</td></tr><tr><td>Vaso de separación de camarones en salmuera</td><td>VWR</td><td>BURK7102-2000</td><td>2000mL</td></tr><tr><td>Bolsa de plástico con cremallera</td><td>Roth</td><td>P279.2</td><td>para el almacenamiento de peces muertos</td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra</td><td>155000</td><td>modelo Pipetboy acu2</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>P-Lab</td><td>P701605</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de aire</td><td>www.zajac.de</td><td>AQ380</td><td>4-6 mm diámetro</td></tr><tr><td>1 L Botella de vidrio</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>2 L Botella de vidrio</td><td>VWR</td><td>215-1596</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Botella exprimible</td><td>Roth</td><td>K665.1</td><td>para la alimentación de peces con camarones en salmuera</td></tr><tr><td>120-&#956; m colador de camarones en salmuera</td><td>Florida Aqua Farms</td><td>BB-PC2</td><td>para la recolección de camarones en salmuera/gusanos de sangre</td></tr><tr><td>Finish filter socks Aquaneering</td><td>MFVB025C</td><td></td><td>25-&#956; m</td></tr><tr>Sistema <td></td><td></td><td>de alojamiento de peces de filtración central</td><td>Aquaneering, Techniplast, Aquatic Habitats, Aqua Schwarz</td></tr></tbody></table>

un protocolo de laboratorio vivienda de turquesa killis (nothobranchius furzeri)

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

El desarrollo de las prácticas de cría en laboratorio no modelo pescado utilizado para los propósitos experimentales ha beneficiado en gran medida de la creación de peces de la referencia sistemas modelo, como el pez cebra y medaka. En los últimos años, un pez emergente – los killis turquesa (Nothobranchius furzeri) – ha sido adoptado por un número creciente de grupos de investigación en los campos de la biología del envejecimiento y la ecología. Con un palmo de vida cautivado de 4 a 8 meses, esta especie es el vertebrado shortest-lived criado en cautiverio y permite a la comunidad científica a prueba – en poco tiempo, las intervenciones experimentales que puede llevar a alteraciones de la tasa de envejecimiento y esperanza de vida. Dada la singular biología de esta especie, caracterizada por la diapausa embrionaria, maduración sexual explosivo, marcado dimorfismo sexual morfológica y de comportamiento - y su relativamente corta vida adulta - especial cría de prácticas están en urgente demanda. Este protocolo informa un conjunto de medidas clave de cría que permitan killis turquesa óptima atención del laboratorio, permitiendo a la comunidad científica adopte esta especie como un modelo animal de laboratorio de gran alcance.

Adecuada cría de killis turquesa resultados en supervivencia media que oscila entre 12-18 semanas en la cepa GRZ (e.g. Figura 4A). Variaciones de la mediana de la supervivencia dependen de la dieta, frecuencia de alimentación y las condiciones de temperatura de la vivienda. Resultados de cría pobre en las curvas de supervivencia que presenta aumentaron de la mortalidad temprana y gotas repentinas, repetitivas de supervivencia a través del tiempo, caracterizado por varios puntos de inflexión (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig1.jpg"> Figura 1: representante de etapas de desarrollo embrionarias con sustrato de incubación correspondiente. (A) recién recogida de embriones, incubados en solución de azul de metileno en la incubadora a 28 ° C. (B) embriones listos para ser transferido a un medio sólido, ya sea filtro de fibra de papel o de coco. (C) embriones listos para ser tramado, mostrando típico iris oro. La barra de escala es igual a 1 mm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig2.jpg"> Figura 2: etapas de killis turquesa post eclosión desarrollo. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig3.jpg"> Figura 3: etiqueta de ID de pescado representativo de pescados de la etapa 3. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig4.jpg"> Figura 4: curva de supervivencia representativas para killis turquesa macho 70. (A) curva de supervivencia típico para killis turquesa criados en laboratorio. (B) comparación de las curvas de supervivencia obtenidas de pescado criado en condiciones óptimas de cría (negro) y la pobre cría (rojo y azul). La línea horizontal roja discontinua indica el 50% de supervivencia, curva de supervivencia que se cruzan a media vida (indicado en el eje x). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">Primer avance</td>
			<td colspan="2">Primer revés</td>
			<td>Gama del tamaño (bp)</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuSU0007</td>
			<td colspan="2">GGCTAAGCCTTGCTGACAGA</td>
			<td colspan="2">CAGGGAGCTGAAAACCTCAG</td>
			<td>166 - 214</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuSU0010</td>
			<td colspan="2">CGCAGTCTGATCAAATCGTGT</td>
			<td colspan="2">TGTTTGAAGGTTCACATTCATTATC</td>
			<td>220 - 272</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0016</td>
			<td colspan="2">CATGGCTAAACCGTGATGAA</td>
			<td colspan="2">GAAGGACGCCAGCTATGAAG</td>
			<td>209 - 240</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0022</td>
			<td colspan="2">AACACAGCTCTCGTAAGGAGGTA</td>
			<td colspan="2">TTCAGACTTGTCTTACTACCATGTTT</td>
			<td>198 - 238</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0027</td>
			<td colspan="2">TCCAGCTGAATCGGTAATGA</td>
			<td colspan="2">AAACTCGAGGGTGCAATCTG</td>
			<td>164 - 226</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0049</td>
			<td colspan="2">CTGGACAAAGTGCCAATCAC</td>
			<td colspan="2">CTCCCACAGTCCCAAAACAT</td>
			<td>196 - 197</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0050</td>
			<td colspan="2">CCAGAATGAACAATACTCAGATCAA</td>
			<td colspan="2">GCAGCTTAGTTTAATGATATCACAATG</td>
			<td>252 - 295</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0060</td>
			<td colspan="2">CTAGCCACTCCCCTGGTTTA</td>
			<td colspan="2">CCGTCACGATGTGCTGATAC</td>
			<td>216 - 248</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuFLI0030</td>
			<td colspan="2">CAGAAGCTAAAGGCCAGACG</td>
			<td colspan="2">GGGAAACAATAGGGAACCAC</td>
			<td>174 - 205</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuFLI0091</td>
			<td colspan="2">ACGCTGACTCTACCCAGTC</td>
			<td colspan="2">CTGCCTGCTACTGACAATG</td>
			<td>355 - 373</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">* - marcadores de determinación del sexo</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Cartillas de genotipado para identificación de la cepa.

Vivienda de laboratorio de turquesa killis pueden ampliarse a la casa y eficientemente recaudar miles de peces individuales en un sistema de filtración de agua centralizado, utilizando la misma infraestructura que se utiliza para las instalaciones estándar de pez cebra. Aquí detallamos una lista de procedimientos estandarizados que permiten killis eficiente mantenimiento.

Un protocolo de laboratorio vivienda de turquesa killis (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

El objetivo general de este protocolo es criar con éxito una colonia de laboratorio de killis turquesa para estudiar el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad de una manera rápida y de alto rendimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del envejecimiento, como si las mutaciones de un solo gen o las intervenciones ambientales pueden modular el proceso de envejecimiento en las especies de vertebrados. La principal ventaja de esta técnica es que, siguiendo nuestros protocolos básicos, ahora varios laboratorios pueden realizar experimentos con killis turquesa.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que la cría de killis tiene algunas características únicas. Por ejemplo, los embriones se crían en un sustrato seco antes de la eclosión, que es muy diferente de los modelos de peces canónicos como el pez cebra. Para empezar, instale tanques de cría de 9,5 litros cada uno con un macho de cinco semanas y dos hembras de seis a siete semanas de edad.Luego llene un recipiente de plástico con arena esterilizada en autoclave de aproximadamente dos a tres centímetros de profundidad y coloque la caja de arena en el centro del tanque de cría. Permita que el killi turquesa se reproduzca continuamente y coseche embriones una vez a la semana para la incubación de embriones. Para recolectar embriones en etapa de célula para su uso en inyección y generación de líneas transgénicas, se instaló un tanque de cría con un pez macho y dos hembras, como se acaba de demostrar.Dos días antes de la recolección de embriones, transfiera el macho a un tanque individual y manténgalo en contacto visual con las hembras adultas. El día de la recolección, agregue el macho y una caja de arena al tanque de cría y deje que los peces desoven durante dos horas. Después de desovar y quitar la caja de arena del tanque, vacíe la caja de arena en un colador y use agua del sistema para enjuagarla.A continuación, sumerge parcialmente el colador en el agua del sistema y gíralo suavemente para que los embriones se agrupen en el centro. Con una pipeta Pasteur de dos mililitros, recoja los embriones y transfiéralos a una placa de Petri de 90 milímetros con aproximadamente 40 mililitros de agua del sistema. Bajo un microscopio óptico, inspeccione los embriones en la placa de Petri y extraiga aquellos que presenten un corion roto y signos de daño.Después de blanquear los embriones de acuerdo con el protocolo de texto, inspeccione y retire los embriones muertos que se tiñan de azul. Una vez que se haya permitido que los embriones incuben en una solución fresca de azul de metileno, verifique que los embriones desarrollados tengan ojos negros visibles. A continuación, con una pipeta Pasteur desechable o unas pinzas curvas finas, transfiera los embriones a una placa de papel de filtro.Conserve los embriones no desarrollados en azul de metileno y contrólelos a diario. Una vez que se hayan desarrollado los ojos negros, transfiéralos a un sustrato sólido. Con pinzas, separe los embriones aproximadamente cinco milímetros hasta 100 embriones por placa de 90 milímetros.Luego use parafina para sellar el plato e incubar los embriones a 28 grados centígrados durante dos o tres semanas hasta que hayan desarrollado completamente los iris dorados y estén listos para eclosionar. Para el almacenamiento a largo plazo de hasta un año, después de la incubación en una solución de azul de metileno durante tres días, transfiera los embriones a placas de sustrato sólido como se acaba de demostrar e incube a 17 grados centígrados. Para incubar los peces, use pinzas curvas finas para transferir cuidadosamente de 50 a 100 embriones desarrollados a la caja de incubación y sumérjalos completamente en una solución de ácido húmico a no más de dos centímetros de profundidad a cuatro grados centígrados.Un paso crítico en este protocolo es la eclosión de embriones de killis, que se logra transfiriendo embriones incubados en un sustrato seco a una solución de incubación que contiene ácido húmico provisto de suficiente aireación. Cubra la caja de incubación con una tapa e incube a 28 grados centígrados en una incubadora de incubación. Para suministrar suficiente aireación, conecte la caja a un suministro de aire con tubería.Para mantener una calidad de agua adecuada en la caja de incubación, una vez al día desde el día después de la eclosión, reponga la caja con una proporción de uno a uno de agua del sistema esterilizada en autoclave manteniendo una profundidad final de dos centímetros. Transfiera los embriones no eclosionados al sustrato sólido e intente eclosionar una semana después. Para criar peces juveniles y adultos a los cinco días después de la eclosión, traslade los juveniles al sistema de recirculación de agua mediante el uso de pipetas de plástico desechables o una cuchara de plástico para transferir cuidadosamente cinco juveniles por tanque de 0,8 litros equipado con una criba de alevines de 400 micrómetros.A los 14 días de edad, transfiera los peces juveniles a un tanque de 2,8 litros equipado con una criba de alevines de 850 micrómetros. A partir de este punto, etiquete cada tanque con una identificación de pez. Para los ensayos de supervivencia, aloje individualmente a cada pez en un solo tanque. Los peces criados para ensayos de supervivencia también se alojan individualmente en un tanque de 2,8 litros.Durante los siguientes siete días, alimente a los juveniles dos veces al día con cinco mililitros de camarones en salmuera suplementados con uno a tres gusanos de sangre vivos. A las cuatro semanas de edad, alimente a cada pez dos veces al día con camarones en salmuera y un mililitro de gusanos de sangre. En esta etapa, asegúrese de que el pez alcance la maduración sexual completa verificando la presencia de grandes aletas dorsal, anal y caudal con signos de coloración en los machos y abdómenes redondos llenos de huevos en las hembras.Aquí se muestra una curva de supervivencia representativa de 70 killis turquesa machos. La cría adecuada da como resultado una supervivencia media que oscila entre 12 y 28 semanas en la cepa GRZ. Las variaciones en la mediana de supervivencia dependen de la dieta, la frecuencia de alimentación y las condiciones de temperatura de la vivienda.La curva de supervivencia de los peces criados en condiciones de cría deficientes revela un aumento de la mortalidad temprana y caídas repentinas repetitivas de la supervivencia a lo largo del tiempo en comparación con los peces criados en condiciones óptimas de cría. Al seguir este protocolo, es importante controlar de cerca el estado del agua y el exceso de comida de los alevines recién eclosionados, ya que es esencial que se mantengan en un ambiente limpio. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran manipulaciones experimentales en killis turquesa, incluida la transgénesis, la edición del genoma y las manipulaciones dietéticas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo criar con éxito killis turquesa en el laboratorio y usar este modelo para explorar la biología del envejecimiento en el vertebrado de vida más corta que se puede criar en cautiverio.

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Investigación

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