Un protocolo de laboratorio vivienda de turquesa killis (Nothobranchius furzeri)

El objetivo general de este protocolo es criar con éxito una colonia de laboratorio de killis turquesa para estudiar el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad de una manera rápida y de alto rendimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del envejecimiento, como si las mutaciones de un solo gen o las intervenciones ambientales pueden modular el proceso de envejecimiento en las especies de vertebrados. La principal ventaja de esta técnica es que, siguiendo nuestros protocolos básicos, ahora varios laboratorios pueden realizar experimentos con killis turquesa.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que la cría de killis tiene algunas características únicas. Por ejemplo, los embriones se crían en un sustrato seco antes de la eclosión, que es muy diferente de los modelos de peces canónicos como el pez cebra. Para empezar, instale tanques de cría de 9,5 litros cada uno con un macho de cinco semanas y dos hembras de seis a siete semanas de edad.

Luego llene un recipiente de plástico con arena esterilizada en autoclave de aproximadamente dos a tres centímetros de profundidad y coloque la caja de arena en el centro del tanque de cría. Permita que el killi turquesa se reproduzca continuamente y coseche embriones una vez a la semana para la incubación de embriones. Para recolectar embriones en etapa de célula para su uso en inyección y generación de líneas transgénicas, se instaló un tanque de cría con un pez macho y dos hembras, como se acaba de demostrar.

Dos días antes de la recolección de embriones, transfiera el macho a un tanque individual y manténgalo en contacto visual con las hembras adultas. El día de la recolección, agregue el macho y una caja de arena al tanque de cría y deje que los peces desoven durante dos horas. Después de desovar y quitar la caja de arena del tanque, vacíe la caja de arena en un colador y use agua del sistema para enjuagarla.

A continuación, sumerge parcialmente el colador en el agua del sistema y gíralo suavemente para que los embriones se agrupen en el centro. Con una pipeta Pasteur de dos mililitros, recoja los embriones y transfiéralos a una placa de Petri de 90 milímetros con aproximadamente 40 mililitros de agua del sistema. Bajo un microscopio óptico, inspeccione los embriones en la placa de Petri y extraiga aquellos que presenten un corion roto y signos de daño.

Después de blanquear los embriones de acuerdo con el protocolo de texto, inspeccione y retire los embriones muertos que se tiñan de azul. Una vez que se haya permitido que los embriones incuben en una solución fresca de azul de metileno, verifique que los embriones desarrollados tengan ojos negros visibles. A continuación, con una pipeta Pasteur desechable o unas pinzas curvas finas, transfiera los embriones a una placa de papel de filtro.

Conserve los embriones no desarrollados en azul de metileno y contrólelos a diario. Una vez que se hayan desarrollado los ojos negros, transfiéralos a un sustrato sólido. Con pinzas, separe los embriones aproximadamente cinco milímetros hasta 100 embriones por placa de 90 milímetros.

Luego use parafina para sellar el plato e incubar los embriones a 28 grados centígrados durante dos o tres semanas hasta que hayan desarrollado completamente los iris dorados y estén listos para eclosionar. Para el almacenamiento a largo plazo de hasta un año, después de la incubación en una solución de azul de metileno durante tres días, transfiera los embriones a placas de sustrato sólido como se acaba de demostrar e incube a 17 grados centígrados. Para incubar los peces, use pinzas curvas finas para transferir cuidadosamente de 50 a 100 embriones desarrollados a la caja de incubación y sumérjalos completamente en una solución de ácido húmico a no más de dos centímetros de profundidad a cuatro grados centígrados.

Un paso crítico en este protocolo es la eclosión de embriones de killis, que se logra transfiriendo embriones incubados en un sustrato seco a una solución de incubación que contiene ácido húmico provisto de suficiente aireación. Cubra la caja de incubación con una tapa e incube a 28 grados centígrados en una incubadora de incubación. Para suministrar suficiente aireación, conecte la caja a un suministro de aire con tubería.

Para mantener una calidad de agua adecuada en la caja de incubación, una vez al día desde el día después de la eclosión, reponga la caja con una proporción de uno a uno de agua del sistema esterilizada en autoclave manteniendo una profundidad final de dos centímetros. Transfiera los embriones no eclosionados al sustrato sólido e intente eclosionar una semana después. Para criar peces juveniles y adultos a los cinco días después de la eclosión, traslade los juveniles al sistema de recirculación de agua mediante el uso de pipetas de plástico desechables o una cuchara de plástico para transferir cuidadosamente cinco juveniles por tanque de 0,8 litros equipado con una criba de alevines de 400 micrómetros.

A los 14 días de edad, transfiera los peces juveniles a un tanque de 2,8 litros equipado con una criba de alevines de 850 micrómetros. A partir de este punto, etiquete cada tanque con una identificación de pez. Para los ensayos de supervivencia, aloje individualmente a cada pez en un solo tanque. Los peces criados para ensayos de supervivencia también se alojan individualmente en un tanque de 2,8 litros.

Durante los siguientes siete días, alimente a los juveniles dos veces al día con cinco mililitros de camarones en salmuera suplementados con uno a tres gusanos de sangre vivos. A las cuatro semanas de edad, alimente a cada pez dos veces al día con camarones en salmuera y un mililitro de gusanos de sangre. En esta etapa, asegúrese de que el pez alcance la maduración sexual completa verificando la presencia de grandes aletas dorsal, anal y caudal con signos de coloración en los machos y abdómenes redondos llenos de huevos en las hembras.

Aquí se muestra una curva de supervivencia representativa de 70 killis turquesa machos. La cría adecuada da como resultado una supervivencia media que oscila entre 12 y 28 semanas en la cepa GRZ. Las variaciones en la mediana de supervivencia dependen de la dieta, la frecuencia de alimentación y las condiciones de temperatura de la vivienda.

La curva de supervivencia de los peces criados en condiciones de cría deficientes revela un aumento de la mortalidad temprana y caídas repentinas repetitivas de la supervivencia a lo largo del tiempo en comparación con los peces criados en condiciones óptimas de cría. Al seguir este protocolo, es importante controlar de cerca el estado del agua y el exceso de comida de los alevines recién eclosionados, ya que es esencial que se mantengan en un ambiente limpio. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran manipulaciones experimentales en killis turquesa, incluida la transgénesis, la edición del genoma y las manipulaciones dietéticas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo criar con éxito killis turquesa en el laboratorio y usar este modelo para explorar la biología del envejecimiento en el vertebrado de vida más corta que se puede criar en cautiverio.