Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales En vivo

El objetivo general del siguiente experimento es activar o silenciar rápidamente poblaciones neuronales definidas genéticamente en una escala de tiempo fisiológicamente relevante. Esto se logra mediante la entrega de un vector viral portador de transgenes que codifican el canal de activación de la neurona de luz azul opsina o la opsina hall de silenciamiento de la neurona de luz verde a neuronas genéticamente definidas. Como segundo paso, se construye una carretera emisora de luz que consiste en una fibra óptica fijada a un electrodo de registro, lo que permite el suministro simultáneo de luz y el registro eléctrico.

A continuación, la TRO se coloca y se desciende a la región cerebral transducida por Opsina. Con el fin de evocar las respuestas mediadas por opsina de canal y ha opsina, se obtienen resultados que muestran la activación e inhibición inducida por la luz de las neuronas transducidas por el canal redsin y ha hallin basadas en la técnica de registro de una sola unidad que permite el registro de neuronas individuales. Este método aborda una necesidad fundamental en la neurociencia al permitirnos determinar exactamente qué tan efectiva puede ser la luz para impulsar la actividad neuronal con una resolución de tiempo de milisegundos y en subtipos neuronales específicos, y lo demostrará.

Un postdoctorado en mi laboratorio Asegurar que se sigan los procedimientos de bioseguridad de nivel uno mientras se prepara y manipula el virus, y que se observan todas las directrices locales y gubernamentales relacionadas con los animales. Antes de la inyección estereotáctica, deje que una alícuota de virus se descongele en el hielo y luego gire brevemente hacia abajo. En una centrífuga de sobremesa, rellene lentamente una jeringa y aguja de vidrio Hamilton con una pequeña cantidad de silicona o aceite mineral.

Asegúrese de que no haya burbujas de aire visibles en el cilindro de la jeringa. Inserte la jeringa en una bomba de microinyector y conecte la bomba directamente al brazo estereotáxico vertical. Después de colocar el tubo alícuota del virus en una posición estable, baje el brazo estereotáxico hasta que la punta de la aguja toque la parte inferior del tubo alícuota del virus.

Utilice el controlador de la bomba de microinyector para extraer el volumen deseado de virus. Después de anestesiar a una rata con ketamina y xilacina, verifique la respuesta refleja a un pellizco en el dedo del pie para garantizar una profundidad adecuada de anestesia utilizando métodos asépticos estándar. Coloque al animal en un aparato estereotáxico después de hacer una incisión en la línea media a través de la piel en la parte superior del cráneo del animal con pequeñas tijeras quirúrgicas o bisturí.

Separe suavemente el tejido conectivo y limpie la parte superior del cráneo con un pequeño raspador de hueso. Baje la aguja y verifique que las coordenadas Z para bgma y lambda sean iguales para establecer que la cabeza está nivelada. A continuación, mueva el brazo estereotáxico a las coordenadas correspondientes a la estructura cerebral de interés.

Marque el lugar de la inyección con una pluma quirúrgica. Use un taladro de mano para adelgazar cuidadosamente el cráneo sobre el área objetivo. Deténgase cuando la broca llegue a la parte inferior del cráneo y use un par de pinzas extrafinas para extraer el hueso delgado.

Después de exponer la duramadre, coloque la aguja de la jeringa sobre el área objetivo y baje la aguja hasta que toque la duramadre. Y usa este punto para calcular la z. Coordenada ahora, muy lentamente, baje la aguja de inyección en el cerebro hasta que se alcance la posición Z adecuada.

En este protocolo, se dirige a la región prelímbica de la corteza prefrontal medial. Inyectar el virus a una velocidad de 0,1 microlitros por minuto. Una vez completada la inyección, espere 10 minutos antes de retirar la aguja para evitar el reflujo del virus a la superficie del cerebro.

Después de usar una sutura de costura con una aguja adjunta para sellar la piel, aplique antibióticos a la herida. Primero, conecte un electrodo de tungsteno de uno a 1,5 mega ohmios a un tubo capilar de vidrio con superpegamento. A continuación, utilice una herramienta de pelado de fibra para exponer el extremo desnudo de una fibra óptica multimodo y limpie la punta de la fibra con etanol muy ligeramente.

Marque la punta de la fibra con un cuchillo de diamante en forma de cuña y use pinzas finas para eliminar con cuidado el exceso de fibra. La fibra debe cortarse fácilmente en la puntuación. Utilice un medidor de potencia óptica para medir la intensidad del láser en la punta de la fibra óptica.

Para las grabaciones in vivo, la intensidad de la luz de tan solo 20 a 100 milivatios por milímetro cuadrado puede evocar de manera confiable la activación o el silenciamiento mediado por el canal redsin o hallin, respectivamente, de la actividad neuronal. A continuación, inserte la fibra óptica en el tubo capilar. Coloque la punta de la fibra aproximadamente 500 micras por encima de la punta del electrodo de tungsteno y ate un hilo de sutura delgado dos veces en algunos puntos cerca de la punta para que el electrodo y la fibra queden rectos.

Asegúrese de que la distancia entre la punta del electrodo y el nudo más cercano sea lo suficientemente larga para la inserción en la región objetivo como se ve aquí. Prepare al animal para la cirugía como antes. Luego, use la craneotomía inicial como guía para hacer una ventana nueva, limpia y pequeña en el cráneo.

Para posicionar el tro. Use una aguja fina para hacer una pequeña incisión en la duramadre. Baje con cuidado la TRO a través de la ventana del cráneo y dentro del cerebro hasta la región transducida con un manipulador de micrómetros.

A continuación, avance el todoterreno lentamente en pasos de 10 a 50 micras hasta que surja una célula sensible a la luz. Aquí, se utiliza una interfaz de usuario de software personalizada escrita en la vista de laboratorio para controlar el láser de diodo único y para visualizar y registrar la actividad neuronal en curso. Las señales grabadas se capturan con un paso de banda de amplificador ex AMP 20 K filtrado a 0,3 a ocho kilohercios y la placa analógica a digital de un instrumento nacional.

La interfaz de usuario de neuro lux Pro permite elegir entre entradas analógicas y salidas digitales. Elija dos canales analógicos para la neurona y el transistor, la lógica del transistor o la señal TTL. Establezca la frecuencia de muestreo en 20 kilohercios, el período de preluz de referencia en dos segundos y el período de luz posterior en dos segundos.

A continuación, configure el ancho de pulso, la frecuencia y el período de estimulación de la estimulación láser TTL. Aquí la frecuencia es de 20 hercios y el período de estimulación es de 500 milisegundos, lo que significa que se entregan 10 pulsos láser con un ancho de pulso definido. El usuario puede elegir entre la entrega continua de luz o para grabaciones repetidas.

Pueden elegir el intervalo entre los pulsos y el número de deformaciones de pulsos. Los datos se pueden adquirir con o sin grabación en el disco después de la grabación. El animal se sacrifica de acuerdo con los procedimientos aprobados y el tejido cerebral se procesa para verificar la ubicación de la erosión y la expresión de opsina, como se muestra aquí.

Esta captura de pantalla de la interfaz del software Neuro LX Pro configurada para la entrega simultánea de luz y el registro electrofisiológico muestra el silenciamiento inducido por Hall Rod Dobson de la actividad espontánea de la celda de parametal pre límbico rap en respuesta a 10 segundos de entrega continua de luz de 532 nanómetros. Esta fotografía muestra una expresión representativa de hallo redsin en el ulu dorsal. El esquema de la derecha representa el lugar donde se tomó la fotografía.

La punta de flecha indica la posición del electrodo de tungsteno y la flecha indica la posición de la fibra óptica. Esta fotografía muestra la expresión representativa del canal opsina en la corteza prelímbica. De nuevo, el esquema de la derecha representa el lugar donde se tomó la fotografía.

La punta de flecha indica la posición del electrodo de tungsteno y la flecha indica la posición de la fibra óptica. Este rastro de ejemplo registrado de la corteza prelímbica de rata muestra el canal rojo en dos potenciales de acción activados en respuesta a la entrega de 20 hercios de pulsos de luz azul de 473 nanómetros durante 10 milisegundos cada uno, como lo indica la barra azul. Abajo. El diagrama ráster muestra el pico inducido por la redsin del canal en seis neuronas representativas.

Cada actividad unitaria se representa como un punto. Este rastro de ejemplo muestra la supresión inducida por opsina Hall de la actividad espontánea durante la iluminación continua de luz verde de 532 nanómetros durante 10 segundos, como lo indica la barra verde en la misma región del cerebro. El diagrama ráster muestra el silenciamiento inducido por la dosina de Haller en seis neuronas representativas.

Cada actividad unitaria se representa como un punto. Esta imagen muestra un pico repetitivo impulsado por opsina de canal de 20 hercios de una neurona parametálica prelímpica de rata en vivo En el lado izquierdo se muestran trazas de voltaje de la luz evocada, pico, adquirida en los puntos de tiempo 0, 30, 60, 90 y 120 minutos después del comienzo de las grabaciones. En el lado derecho, el gráfico ráster muestra las 61 repeticiones de la activación inducida por la luz.

Cada actividad unitaria se representa como un punto. Aquí, in vivo, se muestran en la parte superior los registros electrofisiológicos del sicm dorsal de rata transducido por Haller Dossin. El trazo de ejemplo demuestra que 10 segundos continuos de iluminación de 532 nanómetros indicados por la barra verde del subm dorsal que expresa Hall Dobson elimina la actividad espontánea.

A continuación se muestran las formas de onda promedio de las dos unidades registradas de la traza anterior. El umbral de amplitud se utilizó para identificar dos neuronas distintas. Finalmente, el diagrama ráster muestra cinco repeticiones del silenciamiento inducido por Haller dossin de estas unidades.

Cada actividad unitaria se representa como un punto. Finalmente, esta imagen muestra un aumento repetitivo impulsado por opsina de canal de 20 hercios de una neurona subular dorsal de rata en trazas de voltaje in vivo de la luz evocada, pico, adquirida en los puntos de tiempo 0, 30, 60, 90 y 120 minutos. Después de que se muestra el comienzo de las grabaciones a la izquierda, el recuadro a continuación muestra la actividad de ráfaga típica de esta celda.

El gráfico ráster de la derecha muestra las 61 repeticiones de la activación inducida por la luz. Cada actividad unitaria se representa como un punto. Esta técnica es importante porque demuestra que subtipos neuronales específicos pueden activarse o silenciarse durante largos períodos de tiempo.

De hecho, hemos demostrado que podemos activar neuronas durante más de dos horas y aplicarlas. En última instancia, el objetivo sería aplicar esto al animal que se comporta en animales que están realizando tareas de atención o memoria para que podamos activar circuitos específicos y ver cómo controla diferentes funciones de memoria.