Name: Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales En vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-02T16:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 44 s
Description: Aprende a controlar neuronas piramidales individuales con optogenética de alta fidelidad in vivo. Este método permite activar o silenciar poblaciones neuronales definidas genéticamente con resolución temporal de milisegundos.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas (NIDA) de subvención R01 DA24040 (DCC) de la Universidad de Colorado Fondo Semilla Innovador (DCC), y NIDA beca de formación T32 DA017637 (MVB).

1. Almacenamiento Virus y Preparación <ol><li> El uso de vectores AAV incompetentes para la replicación para la entrega de genes opsina para el cerebro de roedores está aprobado para el Nivel de Bioseguridad 1 (BSL-1) y requiere de una adecuada protección y procedimientos de manejo como se describe en la publicación de Gobierno de los EE.UU., Bioseguridad en Microbiología y Laboratorios Biomédicos, disponible en los Centros para el sitio web de Control de Enfermedades al ( <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ). </li><li> Con el fin de evitar los ciclos de congelación-descongelación, el virus de la pipeta de vial del fabricante en alícuotas de trabajo más pequeños en una clase II de Bioseguridad Gabinete y almacenar en un -80 ° C congelador. </li><li> Antes de la inyección estereotáxica, permite una alícuota de descongelar en hielo y luego girar brevemente abajo con una centrífuga de sobremesa. </li><li> Lentamente rellenar una jeringa de vidrio Hamilton y aguja con una pequeña cantidad de silicona o aceite mineral.Asegúrese de que no haya burbujas de aire visibles en el cuerpo de la jeringa. Inserte la jeringa en una bomba microinyector y conecte la bomba directamente al brazo estereotáxica vertical (es decir, manipulador estereotáxica). </li><li> Bajar el brazo estereotáxica hasta que la punta de la aguja toca el fondo del tubo alícuota de virus. Utilice el controlador para la bomba de microinyector de retirar el volumen deseado del virus (1,5 l para una inyección de 1 l). </li><li> Todo el material y las superficies que entran en contacto con el virus deben descontaminarse con un desinfectante como cloro (10%). </li></ol> 2. La cirugía y la Inyección de virus <ol><li> Se anestesia de los animales con una mezcla de ketamina (de rata; 125 mg / kg, ip) - xilazina (rata; 10 mg / kg, ip) cóctel. Para medir la efectividad de la anestesia, compruebe si hay una respuesta refleja a una pizca dedo del pie y dar dosis suplementarias de ketamina si es necesario. El uso de métodos quirúrgicos asépticas estándar, colocar los animales en un aparato estereotáxico (David Kopf Eninstrumentos). </li><li> Haga una incisión en la línea media a través de la piel en la parte superior del cráneo de los animales con pequeñas tijeras quirúrgicas o bisturí. Separar suavemente el tejido conjuntivo y limpiar la parte superior del cráneo con un pequeño raspador de hueso. </li><li> Verifique que la cabeza del animal está a nivel tal que el z coordenadas de bregma y lambda son iguales. Determine las coordenadas estereotáxica para el área del cerebro objetivo de un atlas del cerebro tales como el cerebro de rata en estereotáxica Coordenadas (George Paxinos y Charles Watson, Academic Press, 2007) o El cerebro de ratón en estereotáxica Coordenadas (BJ Keith Franklin y George Paxinos, Academic Press , 2007). Marcar el sitio previsto de la inyección con una pluma quirúrgica. </li><li> Cuidadosamente delgada del cráneo por encima del área de destino usando un taladro de mano y se detendrá cuando la broca de perforación alcanza la parte inferior del cráneo. Con un par de pinzas finas adicionales, retirar el hueso adelgazado con el fin de exponer la duramadre. </li><li> Colocar la aguja de la jeringa sobre el objetivo sonA y bajar la aguja hasta que toque la duramadre y utilizar este punto para calcular la coordenada z. Muy bajar lentamente la aguja de inyección en el cerebro hasta que se alcanza la posición correcta z. En este protocolo, la región prelimbic de la corteza prefrontal medial (2,7 mm anterior al bregma, ± 0,5 mm lateral a la línea media, y -2,2 mm de duramadre) o subiculum dorsal (-6.0 mm anterior al bregma, ± 3,0 mm lateral a la línea media, y -2,0 mm a partir de la duramadre) se dirige en un adulto de rata Sprague Dawley macho (aprox. 275 g). </li><li> Inyectar el virus a una tasa de 0,1 l / min. Después de que se complete la inyección de esperar 10 minutos antes de retirar la aguja para evitar el flujo de retorno del virus a la superficie del cerebro. </li><li> Utilice una sutura de coser con aguja fija para sellar la piel y aplicar antibióticos a la herida. </li><li> El curso temporal de la expresión funcional ChR2 y NpHR de vectores de AAV variará dependiendo del diseño experimental y el título viral. Para este experimento, in vivo </em&gt; grabaciones se realizaron inyección de 18-21 días después. </li></ol> 3. Entrega Luz y En vivo Grabación de ChR2 o neuronas que expresan NpHR <ol><li> Conecte un electrodo de tungsteno (~ 1-1.5 MΩ, minipostes) a un tubo capilar de vidrio (Fisher Scientific) usando pegamento. </li><li> Utilice una herramienta de extracción de la fibra (Thorlabs) para exponer el extremo desnudo de una fibra óptica multimodo (200 m de diámetro del núcleo, Thorlabs) y punta de fibra limpia con etanol. Muy ligera marcar punta de la fibra con un cuchillo de diamante en forma de cuña (Thorlabs) y retirar con cuidado el exceso de fibra (por ejemplo, con unas pinzas finas). La fibra debe adherirse fácilmente a la partitura. </li><li> Conectar el extremo de FC de la fibra en el conector de PC en el puerto de salida de un solo láser de diodo de 200 mW ( <a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) con la longitud de onda deseada. Asegúrese de que las gafas de protección adecuada se usa en todo momento cuando se trabaja con el láser. </li><li> Mida la lintensidad aser en la punta de la fibra óptica utilizando un medidor de potencia óptica ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Por in vivo grabaciones, intensidad de la luz tan poco como 20 a 100 mW / mm 2 puede evocar fiable ChR2-o la activación o silenciamiento mediado por NpHR, respectivamente, de la actividad neuronal. </li><li> Inserte la fibra óptica en el tubo capilar. Coloque la punta de la fibra de aproximadamente 500 m por encima de la punta del electrodo de tungsteno y atar un hilo de sutura fina dos veces en unos pocos puntos cerca de la punta de modo que el electrodo y la fibra son rectas. Asegúrese de que la distancia entre la punta del electrodo y el nudo más cercano es el tiempo suficiente para la inserción de la región de destino. </li><li> Preparar el animal como en los pasos 2.1 y 2.2. Utilice la craneotomía inicial como guía para hacer una nueva ventana pequeña limpia en el cráneo para colocar el Optrode ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Haga una pequeña incisión en la parte dura usando una aguja fina. </li><li> Baje con cuidado la Optrode a través de la ventana de cráneo y en el cerebro para la región transducidas utilizando un micromanipulador (Narishige). Luego avanzar el Optrode lentamente en 10-50 micras pasos hasta la aparición de una célula responde a la luz. </li><li> Una interfaz de usuario de software personalizado (NeuroLux Pro <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) escrito en LabVIEW (National Instruments) se utiliza para controlar el láser de diodo único y para visualizar y registrar la actividad neuronal en curso. Señales grabadas se capturaron con una EJEMPLOS-20K (Kation Scientific) amplificador de paso de banda de filtrado (0,3-8 kHz), y un análogo de National Instruments para pizarra digital (NI USB-6009). La interfaz de usuario NeuroLux Pro permite la elección de las entradas analógicas (dos canales para elegir el neuronal y la señal TTL) y salida digital. El usuario puede definir la frecuencia de muestreo (20 kHz), el período de referencia (antes de la luz), y el período posterior a la luz. El usuario puede definir el stimulati láser TTLla anchura del impulso, frecuencia y periodo de estimulación (si la frecuencia es de 20 Hz y la estimulación periodo es de 500 ms, 10 pulsos láser con ancho de pulso definido se entregan). El usuario también puede elegir una entrega de luz continua (por ejemplo, la Figura 1). Para grabaciones repetidas, el usuario también puede definir el número de trenes de impulsos y el intervalo entre trenes. Los datos pueden ser adquiridos con o sin la grabación en el disco. </li><li> Tras la grabación, los animales se anestesian con el cóctel de ketamina / xilazina y transcardially perfundidos con solución salina fisiológica y paraformaldehído (4%) con el fin de verificar la colocación Optrode y expresión opsina. </li></ol>

<ol><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-color+optical+activation%2C+silencing%2C+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299(2007).</li>
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<li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, eg <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2%2B%2Fcalmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li>
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<li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li>
<li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+local+circuits+in+vivo%3A+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li>
<li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+optogenetic+silencing+of+orexin%2Fhypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li>
<li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li>
<li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Una amplia gama de técnicas disponibles para la genética de metas de genes opsina microbianas a regiones discretas del cerebro en los roedores. La entrega de genes viral proporciona un enfoque relativamente barata y rápida para mediar ChR2 y NpHR expresión con especificidad de tipo celular. Sistemas de vectores de AAV son una opción común para uso en experimentos optogenetic debido a títulos altos de producción que permanecen estables durante el almacenamiento, su falta de patogenicidad, y su capacidad de producir la expresión génica a largo plazo 10. Muchas de las construcciones opsina con promotores específicos de células de tipo están comercialmente disponibles en una variedad de serotipos de AAV de instalaciones básicas de vectores, tales como la Universidad de Pennsylvania ( <a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ) o la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill ( <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ). Un inconveniente de la tecnología de AAV es lacapacidad limitada de embalaje (~ 4,7 kb), que impone una restricción en el tamaño de la casete del transgén que puede ser utilizado para la orientación específica de la célula. Como alternativa, los vectores lentivirales, que tienen una capacidad de envasado más grande, son capaces de acomodar opsina dirigidos bajo el control de secuencias promotoras más grandes. El uso de un Optrode permite la detección fiable de señales electrofisiológicas en combinación con la entrega de luz temporalmente-precisa. Como se describió anteriormente, sin embargo, es necesario tener cuidado suficiente en su construcción. Dado que la fibra óptica escindido es frágil, atar el hilo de sutura con demasiada fuerza puede hacer que la fibra se rompa. A pesar de que la Optrode se puede utilizar para realizar varias grabaciones, el electrodo y la fibra óptica se deben limpiar (o manualmente troceados en el caso de la extremo desnudo de la fibra óptica) antes de la inserción debido a que la impedancia del electrodo y la calidad de la luz entregada se degradará con el uso repetido. Durante elegrabaciones ctrophysiological es importante que el Optrode ser avanzado lentamente. El Optrode utilizado aquí tiene aproximadamente 350 micras de espesor (electrodo de tungsteno: 125 micras; núcleo de fibra óptica: 200 m) y el descenso rápido podría conducir a un movimiento de tejido cerebral. Artefactos inducidos por luz también se pueden considerar con especial registro y entrega de la luz reglajes 11-12. Aunque no se encontraron artefacto inducido por la luz en nuestra condición experimental, grabaciones fuera de la zona del cerebro transducidas potencialmente se pueden utilizar como un control para los artefactos de luz. Otra consideración durante el proceso de grabación es la intensidad de la luz necesaria para observar los cambios en las neuronas CHR2 o NpHR expresan, especialmente para largas grabaciones de duración. Intensidad del láser fuerte y la iluminación láser de largo podría resultar en el daño tisular y / o una disminución de la respuesta a la luz posterior entrega 12-13. Para la experimentación del comportamiento se requiere el uso de un vector viral de control para eliminating ningún efecto debido al calor emitido desde la fibra. Para muchas de las construcciones optogenetic disponibles comercialmente existen construcciones de control complementarios en los que se ha eliminado la secuencia del gen de la opsina. Cabe señalar que diseñado ChR2 variantes con propiedades mejoradas y la cinética se han desarrollado junto con otros opsinas de silenciamiento que pueden ser más adecuados para ciertos preguntas experimentales 14-15. Por ejemplo, una nueva variante ChR2 establecido a través de mutagénesis dirigida, denominada &quot;Cheta&quot;, puede conducir de alta fidelidad Rematar neuronal en las frecuencias (hasta al menos 200 Hz) por encima de la del original ChR2 14. La combinación de in vivo de suministro de luz y la grabación simultánea de las respuestas neuronales es un paso crítico en el establecimiento de relaciones de causalidad entre la actividad con dibujos en las poblaciones de células genéticamente específicos y eventos de comportamiento en el tiempo de bloqueo correspondientes. Los procedimientos y hardware descrito aquí proporciona un enfoque directo para la aplicación de la optogenética para Vivo grabaciones cabeza-fija en en roedores.

La capacidad de activar o silenciar un tipo celular específico dentro de un circuito neuronal de una manera temporal precisa es crítica para la comprensión de cómo los circuitos neuronales procesan diferentes tipos de información subyacentes emoción y la cognición. El control experimental sobre la actividad neural intacto ha empleado herramientas loss-/gain-of-function (por ejemplo, la estimulación eléctrica, la modulación farmacológica, lesión) que no proporcionan la necesaria selectivamente para controlar poblaciones específicas de neuronas, ya sea en una escala temporal o espacial. Dirigiéndose directamente estos retos tecnológicos, el desarrollo y la aplicación de herramientas sensibles a la luz genéticamente codificables ha permitido a los neurocientíficos para controlar la actividad eléctrica de selectos tipos de células durante los eventos de conducta bien definidos. Muchas de estas proteínas sensibles a la luz son de origen microbiano, con el canal de la luz-ción cerrada, canalrodopsina-2 (ChR2) 1, y la bomba de cloruro impulsada por la luz, halorhodopsin (NpHR) 2,3, de uso generalizado. Una ventaja importante de la optogenética es la capacidad de poblaciones específicas de células genéticamente-diana en regiones del cerebro heterogéneos y la técnica se ha aplicado con éxito a un número de organismos modelo (invertebrados a los primates no humanos) 4-6. Muchos animales transgénicos optogenetic se han generado y se encuentran disponibles comercialmente 7,8, sin embargo el establecimiento de líneas transgénicas pueden ser mano de obra intensiva y el costo prohibitivo. Aquí se describe un protocolo para la entrega mediada por virus-de los genes Chr2 y NpHR bajo el promotor CaMKIIα en la rata corteza prelimbic y subículo dorsal usando un virus adeno-asociado recombinante (AAV). Dentro del cerebro anterior, la expresión CaMKIIα es exclusiva de las neuronas piramidales glutamatérgicas 9. AAV se utiliza comúnmente para la investigación básica debido a su relativa facilidad de la producción y la falta de patogenicidad, así como la fuerte y Persila expresión del transgen stent que se ha conseguido con estos vectores 10. Además delineamos los pasos y hardware para la entrega de la luz y grabación simultánea en ratas cabeza-fijo anestesiados.

<table><tbody><tr><td>Jeringa </td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>10 &mu; l</td></tr><tr><td>Aguja extraíble</td><td>Hamilton</td><td>7803-03</td><td>calibre 31, punta biselada</td></tr><tr><td>Bomba de microinyector</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de bomba</td> World <td>Precision Instruments</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de silicona</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12728</td><td></td></tr><tr><td>Laser Protective Eyeware</td><td>Kentek</td><td>KMT-4501</td><td></td></tr><tr><td>Fibra óptica multimodo</td><td>Thorlabs</td><td>BFL37-200</td><td>200 &mu; m de diámetro del núcleo, 0.37 NA</td></tr><tr><td>Herramienta de pelado de fibra</td><td>Thorlabs</td><td>T12S21</td><td>para 200 &mu; Medidor</td></tr> de potencia óptica de fibra multimodo con núcleo de m <tr><td>de</td> diámetro <td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Fotodetector</td><td>Newport</td><td>818-SL/DB</td><td></td></tr><tr><td>Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td><td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a> </td><td>acoplado a un 200 &mu; m fibra multimodo con adaptador FC/PC </td></tr><tr><td>Green Laser (532 nm, 100-200 mW)</td><td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td><td>acoplado a un 200 &mu; m fibra multimodo con adaptador FC/</td></tr><tr><td>PC Tungsteno/Fibra Optrode</td><td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td><td>Lumitrode</td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-566</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador hidráulico</td><td>Narishige</td><td>MO-22</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Kation Scientific</td><td>Dispositivo de adquisición de datos ExAmp-20K</td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6009</td><td></td></tr><tr><td>Reposacabezas para roedores para grabación</td><td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>Unidad estereotáxica <td></td></tr> para <tr><td>animales pequeños</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 963</td><td></td></tr></tbody></table>

un método para la alta fidelidad optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; en vivo</em

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Métodos optogenética se han convertido en una herramienta poderosa para la aclaración de la actividad del circuito neural que subyace a un conjunto diverso de conductas a través de una amplia gama de especies. Herramientas optogenética de origen microbiano se componen de proteínas de la membrana sensible a la luz que son capaces de activar (por ejemplo, canalrodopsina-2, ChR2) o silencio (por ejemplo, halorhodopsina, NpHR) actividad neuronal tipos de células definidas ingenetically-en escalas de tiempo conductualmente relevantes. En primer lugar, demostramos un enfoque simple para la entrega mediada por virus adeno-asociado de Chr2 y NpHR los transgenes a la subículo dorsal y región prelimbic de la corteza prefrontal en la rata. Debido a ChR2 y NpHR son genéticamente objeto de orientación, se describe el uso de esta tecnología para controlar la actividad eléctrica de poblaciones específicas de neuronas (es decir, las neuronas piramidales) incrustados en el tejido heterogéneo con alta precisión temporal. Se describe en el presente documento el hardware, software a medidainterfaz de usuario y los procedimientos que permitan la entrega simultánea de luz y de registro eléctrico de las neuronas piramidales transducidas en un anestesiado en preparación vivo. Estas herramientas responde a la luz proporcionan la oportunidad para identificar las contribuciones causales de los diferentes tipos de células en el procesamiento de la información y la conducta.

La Figura 1 muestra una captura de pantalla del software a medida (NeuroLux Pro) desarrollado en el entorno de LabVIEW (National Instruments) utilizado para la grabación simultánea de la actividad neuronal y el control de los parámetros del pulso de luz (es decir, frecuencia del pulso, ancho de pulso, periodo de estimulación). El programa de software envía una señal de comando a un dispositivo de adquisición digital que genera pulsos TTL para el control sobre el láser de diodo único. Además, el programa muestra el software y tiendas de la actividad neuronal registrada y señales TTL entregados. Estas señales son digitalizadas a través del dispositivo de adquisición a una tasa de muestra definida (por ejemplo, 20 kHz). Señales grabadas se almacenan como una matriz de doble precisión de dos dimensiones en un archivo binario. La Figura 2 muestra el Optrode personalizado que consiste en un electrodo de tungsteno unido a una fibra óptica. Una fibra óptica se fija al electrodo usando hilo de sutura delgada en trespuntos. Si es necesario, pegamento se puede utilizar para adherir ellos. Sin embargo, evitar la fijación de la fibra óptica de forma permanente al electrodo porque aunque el electrodo puede ser reutilizado varias veces, la transmisión de luz a través de la fibra se degradará con el uso repetido y debe ser escindido y limpiado o reemplazado con cada inserción en el cerebro. Paneles izquierdo de la Figura 3 muestran imágenes fluorescentes de la proteína fluorescente de color amarillo, lo que indica una mayor real ChR2 y expresión NpHR. Estas fotografías muestran la expresión NpHR representante en subiculum dorsal de rata (Figura 3A) y la expresión en la corteza ChR2 prelimbic (Figura 3B). La expresión viral se restringió principalmente a la subículo dorsal y corteza prelimbic (por ejemplo, algunos de fluorescencia se observó en el giro dentado (Figura 3A, izquierda)). También se observaron las huellas de los electrodos (pista fina, punta de flecha) y fibra óptica (pista de espesor, flecha). la Figura 4 muestra que ChR2 inducida Rematar temporal preciso en rata corteza prelimbic. Figura 4A es un ejemplo de rastreo de los potenciales de acción activada-ChR2 en respuesta a 20 Hz entrega de 10 mseg pulsos de luz azul a la rata prelimbic corteza. Raster parcela (Figura 4 B) muestra la activación inducida por ChR2 en seis neuronas representativas. Todas las neuronas registradas mostraron clavar luz evocada con fidelidad perfecta. En contraste con ChR2, NpHR rápidamente y de manera reversible silenciada actividad espontánea in vivo en la corteza prelimbic de rata (panel de la derecha de la figura 4). Figura 4C es un ejemplo de rastreo que muestra que la iluminación continua 532 nm (10 s) de la corteza prelimbic expresar bajo el NpHR promotor CaMKllα elimina la actividad de una sola unidad espontánea in vivo. Tenga en cuenta que el silenciamiento completa de la actividad de células piramidales prelimbic es tiempo-bloqueado en el suministro de luz continua 10 seg. Bajoer raster parcela (Figura 4D) muestra silenciamiento inducido por NpHR en seis neuronas representativas. Ambas grabaciones en vivo son típicas que se obtienen a partir de ratas adultas Sprague-Dawley, en el que la entrega de AAV-mediada por los genes opsina microbianos produjo 18-21 días antes. La Figura 5 muestra el resultado de la estimulación repetida ChR2 de un piramidal neurona prelimbic rata. Pulso de luz azul (10 ms) se entregó a 20 Hz durante 5 seg (100 pulsos total). Trazas de tensión del spiking luz evocados fueron adquiridos repetidamente cada 2 minutos durante una sesión de grabación de 2 horas (61 repeticiones en total). Incluso cuando se utiliza este protocolo de estimulación repetitiva, ChR2 indujo clavar estable y robusto en respuesta a la administración de luz. Las figuras 6 y 7 muestran los resultados de la fotoinhibición inducida por NpHR y fotoactivación impulsado-ChR2 de rata actividad de la neurona subicular. Como es el caso en la corteza prelimbic, NpHR y ChR2 pudieronmediar en la inhibición y la activación de las neuronas subicular opsina transducidas con alta reproducibilidad del tiempo de salida al mar inducida por la luz. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> Figura 1. Captura de pantalla de la interfaz del software Pro NeuroLux para la entrega simultánea de luz y el registro electrofisiológico. En la foto se muestra traza silenciamiento NpHR inducida de la actividad espontánea de la rata de células piramidales prelimbic en respuesta a 10 segundos del continuo suministro de luz 532 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> Figura 2. Imagen de alta potencia de Optrode personalizado. Una fibra óptica se inserta en el tubo capilar de vidrio unido a un electrodo de tungsteno y fija al electrodo usando hilo de sutura. La distancia de centro a centro de entreen la punta del electrodo y la punta de la fibra es de aproximadamente 500 micras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> Figura 3. La expresión viral y la colocación Optrode. (Izquierda) Las fotografías muestran la expresión NpHR representante en subiculum dorsal (A) y la expresión en la corteza ChR2 prelimbic (B). (Derecha) Esquema que representa la ubicación donde se tomó cada fotografía. La punta de flecha y la flecha en cada fotografía indican la ubicación del electrodo de tungsteno y de fibra óptica, respectivamente. SUB: subiculum, DG: giro dentado, PL:. Córtex prelimbic <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> Figura 4. En vivo registros electrofisiológicos de ChR2 o transducidas-NpHR prelimb ratacorteza IC. (A) Ejemplo rastro de los potenciales de acción provocados-ChR2 en respuesta a 20 Hz entrega de azul (473 nm) de impulsos de luz (10 ms, azul de barras). (B) parcela Raster mostrando clavar inducida ChR2 en seis neuronas representativas. Cada unidad de actividad se representa como un punto. (C) Ejemplo rastro de supresión inducida por NpHR de la actividad espontánea en verde continuo (532 nm) de iluminación de luz (10 seg, barra de color verde). (D) parcela Raster mostrando silenciamiento inducido por NpHR en seis neuronas representativas. Cada actividad de la unidad se representa como un punto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> Figura 5. Rematar impulsado ChR2 repetitivo 20 Hz de una neurona piramidal prelimbic rata in vivo. (A) Tensión rastros del spiking luz evocadosadquirido en los puntos temporales 0, 30, 60, 90, 120 minutos después del comienzo de las grabaciones. (B) parcela Raster mostrando todas las 61 repeticiones (2 minutos de intervalo entre ensayos, 120 min en total) de la activación inducida por la luz. Cada actividad de la unidad se representa como un punto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> Figura 6. En vivo registros electrofisiológicos de subiculum dorsal de rata transducidas-NpHR. (A) Ejemplo de rastreo mostrando que 10 seg continua iluminación 532 nm (barra verde) del subiculum dorsal expresar NpHR elimina la actividad espontánea. (B) Promedio de formas de onda de las dos unidades de grabado de la traza anterior. El umbral de amplitud se utiliza para la identificación de dos neuronas distintas. (C) parcela Raster muestra cinco repeticioness de silenciamiento inducido por NpHR de estas unidades. Cada unidad de actividad se representa como un punto. <img alt="La figura 7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> Figura 7. Repetitivo 20 Hz CR2 impulsada enriquecidas de una rata dorsal subicular neuronas in vivo. (A) Tensión rastros de luz-evocó la Rematar adquiridas en los puntos de tiempo 0, 30, 60, 90, 120 minutos después del inicio de las grabaciones. Recuadro: la actividad de ruptura típica de esta célula. (B) parcela Raster mostrando todas las 61 repeticiones (2 minutos de intervalo entre ensayos, 120 min en total) de la activación inducida por la luz. Cada actividad de la unidad se representa como un punto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

El reciente desarrollo de herramientas de la neurociencia, que combinan la genética y la óptica, denominada &quot;optogenética&quot;, permite el control sobre la actividad de circuitos neuronales con un nivel sin precedentes de la resolución espacial y temporal. Aquí les ofrecemos un protocolo para la integración en la grabación vivo con la manipulación optogenética de subconjuntos definidos genéticamente las neuronas piramidales corticales y subicular prefrontales.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en activar o silenciar rápidamente poblaciones neuronales definidas genéticamente en una escala de tiempo fisiológicamente relevante. Esto se logra mediante la administración de un vector viral que porta transgenes que codifican el opsin del canal que activa neuronas con luz azul u opsin hall que silencia neuronas con luz verde a neuronas definidas genéticamente. Como segundo paso, se construye un op road emisor de luz que consiste en una fibra óptica fijada a un electrodo de registro, lo que permite la administración simultánea de luz y la grabación eléctrica.A continuación, se posiciona el TRO sobre la región cerebral transducida por opsina y se introduce en ella. Con el fin de evocar respuestas mediadas por la opsina del canal y la ha opsina, se obtienen resultados que muestran la activación e inhibición inducidas por la luz en neuronas transducidas por channel redsin y ha hallin, basándose en la técnica de registro unitario individual que permite grabar actividad de neuronas individuales. Este método satisface una necesidad fundamental en neurociencia al permitirnos determinar con exactitud qué tan eficaz puede ser la luz para inducir actividad neuronal con resolución temporal de milisegundos y en subtipos neuronales específicos, y demostrar esto será tarea de Chin Nakamura.Un postdoctorado en mi laboratorio debe asegurarse de que se sigan los procedimientos de nivel de bioseguridad uno al preparar y manipular el virus, y de que se cumplan todas las normas locales y gubernamentales relativas a los animales. Antes de la inyección estereotáxica, deje que una alícuota de virus se descongele sobre hielo y luego centrifúguela brevemente. En una centrífuga de banco, llene lentamente desde atrás una jeringa de vidrio Hamilton y su aguja con una pequeña cantidad de aceite de silicona o aceite mineral.Asegúrese de que no haya burbujas de aire visibles en el cuerpo de la jeringa. Inserte la jeringa en una bomba de inyección micro y conecte la bomba directamente al brazo estereotáxico vertical. Después de colocar el tubo del alícuota del virus en una posición estable, baje el brazo estereotáxico hasta que la punta de la aguja toque el fondo del tubo del alícuota del virus.Utilice el controlador de la bomba microinyectora para retirar el volumen deseado de virus. Después de anestesiar una rata con ketamina y xilacina, verifique la respuesta refleja a un pellizco en el dedo del pie para asegurar una profundidad adecuada de anestesia utilizando métodos asépticos estándar. Coloque al animal en un aparato estereotáxico tras realizar una incisión media a través de la piel en la parte superior del cráneo del animal con tijeras quirúrgicas pequeñas o un escalpelo.Separar suavemente el tejido conectivo y limpiar la parte superior del cráneo con un raspador óseo pequeño. Bajar la aguja y verificar que las coordenadas Z para bgma y lambda sean iguales para asegurar que la cabeza esté nivelada. Luego, mover el brazo estereotáxico a las coordenadas correspondientes a la estructura cerebral de interés.Marque el sitio previsto para la inyección con un bolígrafo quirúrgico. Utilice un taladro manual para adelgazar cuidadosamente el cráneo sobre el área objetivo. Deténgase cuando la broca alcance la base del cráneo y use un par de pinzas extrafinas para retirar el hueso adelgazado.Después de exponer la dura, coloque la aguja de la jeringa sobre el área objetivo y baje la aguja hasta que toque la dura. Utilice este punto para calcular la coordenada Z. Ahora, baje muy lentamente la aguja de inyección hacia el cerebro hasta alcanzar la posición Z adecuada.En este protocolo, se dirige la región prelímbica de la corteza prefrontal medial. Inyecte el virus a una velocidad de 0,1 microlitros por minuto. Una vez finalizada la inyección, espere 10 minutos antes de retirar la aguja para evitar el reflujo del virus hacia la superficie del cerebro.Después de usar una sutura de coser con aguja adjunta para cerrar la piel, aplique antibióticos sobre la herida. Primero, sujete un electrodo de tungsteno de 1 a 1,5 megaohmios a un tubo capilar de vidrio utilizando pegamento rápido. Luego, utilice una herramienta de pelado de fibra para exponer el extremo desnudo de una fibra óptica multimodo y limpie muy ligeramente la punta de la fibra con etanol.Marque la punta de la fibra con un cuchillo de diamante de forma cuña y utilice pinzas finas para retirar cuidadosamente el exceso de fibra. La fibra debe romperse fácilmente en el punto marcado. Utilice un medidor de potencia óptica para medir la intensidad del láser en la punta de la fibra óptica.Para grabaciones in vivo, una intensidad de luz tan baja como 20 a 100 milivatios por milímetro cuadrado puede evocar de manera confiable la activación mediada por channel redsin o la silenciación mediada por hallin de la actividad neuronal, respectivamente. A continuación, inserte la fibra óptica en el tubo capilar. Coloque la punta de la fibra aproximadamente a 500 micrones por encima de la punta del electrodo de tungsteno y ate un hilo de sutura delgado dos veces en varios puntos cercanos a la punta, de modo que el electrodo y la fibra queden rectos.Asegúrese de que la distancia entre la punta del electrodo y el nudo más cercano sea suficientemente larga para la inserción en la región objetivo, como se muestra aquí. Prepare el animal para la cirugía como antes. Luego, utilice la craneotomía inicial como guía para realizar una nueva ventana pequeña y limpia en el cráneo.Para posicionar el tro. Utilice una aguja fina para realizar una pequeña incisión en la duramadre. Baje cuidadosamente el TRO a través de la ventana craneal y dentro del cerebro hasta la región transducida utilizando un micromanipulador.Luego, avance el objetivo fuera de foco lentamente en pasos de 10 a 50 micrones hasta la aparición de una célula sensible a la luz. Aquí, se utiliza una interfaz de usuario de software personalizado escrita en LabVIEW para controlar el láser de un solo diodo y para visualizar y grabar la actividad neuronal en curso. Las señales grabadas se capturan con un amplificador ExaMP 20 K con filtro de paso de banda de 0,3 a ocho kilohercios y una tarjeta de conversión analógica a digital de National Instruments.La interfaz de usuario Neuro Lux Pro permite seleccionar entradas analógicas y salida digital. Elija dos canales analógicos para la señal neuronal y lógica de transistor o TTL. Establezca la frecuencia de muestreo en 20 kilohercios, el período de línea base previo a la luz en dos segundos y el período posterior a la luz en dos segundos.Luego, configure el ancho del pulso de estimulación láser TTL, la frecuencia y el período de estimulación. Aquí, la frecuencia es de 20 hercios y el período de estimulación es de 500 milisegundos, lo que significa que se entregan 10 pulsos láser con un ancho de pulso definido. El usuario puede elegir entre entrega continua de luz o grabaciones repetidas.Pueden elegir el intervalo entre los pulsos y el número de series de pulsos. Los datos se pueden adquirir con o sin grabación en disco después de la grabación. El animal es sacrificado según procedimientos aprobados y el tejido cerebral se procesa para verificar la colocación del electrodo y la expresión de la opsina, como se muestra aquí.Esta captura de pantalla de la interfaz del software Neuro LX Pro configurado para la administración simultánea de luz y la grabación electrofisiológica muestra la silenciación inducida por Hall Rod Dobson de la actividad espontánea de una célula paramedial pre-límbica del rap en respuesta a 10 segundos de luz continua de 532 nanómetros. Esta fotografía muestra la expresión representativa de hallo redsin en el ulu dorsal. El esquema de la derecha representa la ubicación donde se tomó la fotografía.La punta de flecha indica la posición del electrodo de tungsteno y la flecha indica la posición de la fibra óptica. Esta fotografía muestra la expresión representativa del opsin del canal en la corteza prelímbica. Nuevamente, el esquema de la derecha representa la ubicación donde se tomó la fotografía.La punta de flecha indica la posición del electrodo de tungsteno y la flecha indica la posición de la fibra óptica. Este trazo de ejemplo registrado desde la corteza pre-límbica de rata muestra dos potenciales de acción desencadenados por canales rojos en respuesta a la administración de pulsos de luz azul de 473 nanómetros a 20 hercios, durante 10 milisegundos cada uno, como indica la barra azul inferior. El diagrama de dispersión muestra la activación inducida por canales rojos en seis neuronas representativas.Cada actividad unitaria se representa como un punto. Este trazo de ejemplo muestra la supresión inducida por la opsina hall de la actividad espontánea durante una iluminación continua con luz verde de 532 nanómetros durante 10 segundos, como indica la barra verde en la misma región cerebral. El diagrama de raster muestra el silenciamiento inducido por haller dosin en seis neuronas representativas.Cada actividad unitaria se representa como un punto. Esta imagen muestra repetidos potenciales de acción inducidos por canales opsina a 20 hercios en una neurona parametal prelímbica de rata in vivo. A la izquierda, se muestran trazas de voltaje de los potenciales de acción evocados por luz, adquiridos en los momentos 0, 30, 60, 90 y 120 minutos después del inicio de las grabaciones. A la derecha, el diagrama de raster muestra las 61 repeticiones de la activación inducida por luz.Cada actividad unitaria se representa como un punto. Aquí arriba se muestran grabaciones electrofisiológicas in vivo procedentes del tálamo dorsal de rata transducido con Haller Dossin. El trazo de ejemplo demuestra que una iluminación continua de 10 segundos con luz de 532 nanómetros, indicada por la barra verde en el tálamo dorsal que expresa Hall Dobson, elimina la actividad espontánea.A continuación se muestran las formas de onda promedio de las dos unidades registradas de la traza anterior. El umbral de amplitud se utilizó para identificar dos neuronas distintas. Finalmente, el diagrama de raster muestra cinco repeticiones del silenciamiento inducido por Haller dossin de estas unidades.Cada actividad unitaria se representa como un punto. Por último, esta imagen muestra repetitivos potenciales de acción de 20 hercios inducidos por canales opsina en una neurona dorsal subicular de rata, registrados in vivo mediante trazas de voltaje evocadas por luz, adquiridas en los momentos 0, 30, 60, 90 y 120 minutos. A la izquierda se muestran los inicios de las grabaciones; el recuadro inferior muestra la actividad típica en ráfagas de esta célula.El gráfico de raster a la derecha muestra las 61 repeticiones de la activación inducida por luz. La actividad de cada unidad se representa como un punto. Esta técnica es importante porque demuestra que subtipos neuronales específicos pueden activarse o silenciarse durante períodos prolongados de tiempo.De hecho, hemos demostrado que podemos activar neuronas durante más de dos horas y aplicarlo. En última instancia, el objetivo sería aplicarlo al animal en comportamiento, en animales que realicen tareas atencionales o de memoria, para poder activar circuitos específicos y observar cómo esto controla diferentes funciones de la memoria.

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Investigación

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Neurociencia

Este video demuestra el método para usar la optogenética para modular la dinámica de la red del hipocampo mediante la activación de interneuronas sensibles a la luz modificadas genéticamente en un corte de cerebro de ratón, mejorando la sincronización de la oscilación theta y estudiando el comportamiento de los circuitos neuronales.

Control optogenético de la dinámica de la red del hipocampo

Se describe un método para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en funcional predeterminada micro-dominios del neocórtex. En primer lugar, la imagen de la señal óptica intrínseca se utiliza para obtener un mapa funcional. Luego de dos fotones microscopía se utiliza para etiquetar y neuronas imagen dentro de un dominio de micro del mapa.

Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

Describimos un método para caracterizar la topografía funcional y las propiedades sinápticas de los circuitos del prosencéfalo utilizando un enfoque optogenético para fotoestimular poblaciones neuronales in vitro.

Fotoestimulación de barrido láser de circuitos del prosencéfalo optogenéticamente dirigidos

optogenética se ha convertido en una poderosa herramienta para su uso en experimentos de neurociencia conductual. Este protocolo ofrece una guía paso a paso para el diseño y la configuración de sistemas láser, y proporciona un protocolo completo para llevar a cabo estimulaciones optogenéticas in vivo múltiples y simultáneas compatibles con la mayoría de los paradigmas de pruebas de comportamiento de roedores.

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Aquí describimos nuestra estrategia para obtener registros estables y bien aislados de una sola unidad a partir de interneuronas inhibitorias identificadas en la corteza del ratón anestesiado. Las neuronas que expresan ChR2 se identifican por su respuesta a la luz azul. El método utiliza un equipo de registro extracelular estándar y sirve como una alternativa económica a las imágenes de calcio o a los parches guiados visualmente.

Una guía para En vivo Single-unidad de grabación de Optogenetically Identificado cortical inhibitorio interneuronas

Aquí, presentamos un protocolo para la grabación de la red neuronal rítmica teta y oscilaciones gamma de una preparación de hipocampo aislado todo. Describimos los pasos experimentales desde la extracción del hipocampo hasta los detalles de las grabaciones de parches de campo, unitarios y de células enteras, así como la estimulación optogenética del ritmo teta.

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Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.

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El presente protocolo describe cómo utilizar la optogenética inalámbrica combinada con videografía de alta velocidad en una sola tarea de alcance a agarre de pellets para caracterizar los circuitos neuronales involucrados en el rendimiento del comportamiento motor hábil en ratones que se mueven libremente.

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