Microdisección de segmentos de tejido Renal primaria y la incorporación con la tecnología de construcción de andamio-libre nuevo

Ingeniería de tejido renales construcciones proporcionan una solución para la escasez de órganos y los efectos deletéreos de la diálisis. Aquí, describimos un protocolo micro disecar riñones murinos para el aislamiento de segmentos córtico-medular. Estos segmentos están implantados en construcciones celulares libre de andamio, formando organoides renal.

El objetivo general de este procedimiento de disección microscópica es aislar segmentos discretos de tejido renal vivo con arquitectura renal intacta para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos, como por ejemplo, ¿se pueden recolectar estérilmente segmentos enteros de tejido de órgano primario aislado y mantenerse vivos en cultivo? La principal ventaja de esta técnica es que los segmentos contienen una arquitectura renal intacta, en lugar de utilizar líneas celulares para recrear un órgano complejo con más de 26 tipos de células diferentes.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la enfermedad renal en etapa terminal, ya que estas construcciones mejorarán la filtración y pueden ayudar a los pacientes a mantenerse alejados de la diálisis. Durante la cirugía, use equipo quirúrgico adecuado, incluida una mascarilla y una gorra, para minimizar el riesgo de contaminación. Del mismo modo, haga todo lo posible para mantener la esterilidad en todo momento.

Comience los preparativos cubriendo la mesa de operaciones. A continuación, abra el paquete de instrumentos esterilizados en autoclave sobre las cortinas estériles. Deben incluir tres hemostáticos pequeños, pinzas finas con dientes, pinzas finas sin dientes y tijeras de iris rectas.

Cubra el centro de la mesa de operaciones con un segundo paño quirúrgico no fenestrado. Antes de montar el quirófano, prepare 50 mililitros de DBPS suplementado con antibióticos y alícuota cinco mililitros en un tubo de 15 mililitros. Ahora anestesia a un ratón C57 negro de seis semanas de edad de ocho a 12 semanas y controle periódicamente el nivel de anestesia evaluando su reflejo pedal con un pellizco firme en el dedo del pie.

A continuación, utiliza una crema depilatoria para eliminar todo el vello de la zona ventral del torso y enjuaga la crema y el vello con agua destilada. A continuación, transfiera el ratón a la mesa de operaciones y colóquelo en decúbito supino bajo la cortina no fenestrada. Ahora corta una fenestración cuadrada de dos centímetros en la cortina sobre el abdomen del ratón.

A continuación, frote la piel expuesta con povidona yodada seguida de etanol al 70% tres veces para esterilizar la piel y completar los preparativos para la cirugía. Comience la cirugía utilizando pinzas finas con dientes y tijeras para iris. Haga una incisión en la piel de tres a cuatro centímetros paralela a la línea media, medio centímetro a la izquierda de la línea media.

A continuación, agarre el peritoneo con pinzas finas sin dientes e incida con unas tijeras de iris para entrar en la cavidad abdominal. A continuación, aplique hemostáticos en los bordes laterales superior e inferior de la piel y el peritoneo para colocar tensión lateralmente y mejorar la exposición. Ahora desplaza delicadamente el contenido intestinal a la derecha del abdomen para exponer el riñón izquierdo.

Luego, coloque suavemente la tracción sobre el riñón para elevarlo fuera del abdomen. Ahora coloque un hemostático a través del hilio del riñón y use unas tijeras de iris para seccionar el uréter y los vasos renales. A continuación, transfiera el riñón al tubo de DBPS con estreptococo en pluma al 1 % en hielo.

Lleve este tubo a una campana de cultivo estéril para su procesamiento. Allí, transfiera el riñón a una placa de Petri de 60 milímetros y enjuáguelo dos veces con cinco mililitros frescos de DPBS que contienen calcio y magnesio. Después del segundo lavado, suspenda el riñón en cinco mililitros nuevos de DBPS en un plato nuevo de 60 milímetros.

A continuación, prepare una placa de Petri adicional que contenga sólo cinco mililitros de DBPS para su uso posterior. Continúe usando técnicas estériles, incluidos guantes estériles, mascarilla quirúrgica y bouffant para minimizar los riesgos de contaminación. A continuación, cubra el área del escenario y el área que rodea el microscopio estereoscópico.

A continuación, coloque láminas adhesivas de plástico en las perillas de enfoque del microscopio y rocíelas con etanol al 70%. A continuación, encienda el iluminador de cuello de cisne doble para iluminar el escenario. Ahora, sobre las cortinas estériles, abra un paquete de instrumentos esterilizados que contiene pinzas finas sin dientes, un mango de bisturí, una hoja de bisturí número 15, dos hemostáticos rectos y dos agujas de calibre 30,5 de ánima hueca.

Coloque la hoja número 15 en el mango del bisturí y conecte un hemostático a cada cubo adaptador de aguja para crear instrumentos de disección con aguja. Ahora transfiera las dos placas, una con el riñón en DPBS y la otra solo DPBS, al área del microscopio. Retire la tapa de la placa de riñón y enfoque el microscopio en la superficie anterior o posterior del riñón con un aumento de 3,2 a 4X.

A continuación, con la mano no dominante, utilice unas pinzas finas sin dientes para perforar y sujetar el riñón contra el plato en los polos inferior y superior del riñón. Luego, con la mano dominante, use la cuchilla número 15 para eliminar la capa capsular fibrosa translúcida de la superficie expuesta. Afeitar los 0,5 milímetros más superficiales de la superficie expuesta del riñón para eliminar el resto de la cápsula.

Continúe usando la hoja número 15 para diseccionar una pirámide invertida de tejido del área desencapsulada que mide aproximadamente dos milímetros cuadrados. Luego, transfiera el tejido a la placa limpia de DBPS y deseche el resto del riñón. Ahora concéntrese en el tejido diseccionado y disminuya el aumento a 1.5 a 2.0X.

Usando los dos instrumentos de aguja hemostática como herramientas de corte, corte el fragmento de tejido en pedazos progresivamente más pequeños hasta que los segmentos de tejido sean del tamaño de las puntas de la aguja o más pequeños. Se deben producir alrededor de 50 segmentos. Esta es una parte crítica del procedimiento.

Cada segmento debe aproximarse mucho al diámetro de la punta de la aguja de calibre 30-1/2 para evitar segmentos grandes que puedan dificultar la difusión. Vuelva a colocar el tejido en la campana de cultivo de tejidos y retire el DPBS con una micropipeta P1000. A continuación, vuelva a añadir cinco milímetros de DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de estreptococo en pena.

A continuación, cultive el tejido o implante inmediatamente dentro de las construcciones celulares. La viabilidad de los segmentos renales intactos producidos por el procedimiento descrito se examinó durante tres días en cultivo mediante un ensayo de viabilidad. El calcio AM fluorescente verde está presente con actividad esterasa intracelular indicativa de células vivas.

El homodímero-1 de etidio fluorescente rojo se observa con pérdida de la integridad de la membrana plasmática. Cuando los segmentos renales se incrustaron en construcciones de fibroblastos endoteliales libres de andamio, al tercer día se incorporaron con las construcciones celulares para formar estructuras intactas. Los constructos mantuvieron su red endotelial prevascular mostrada por el marcaje con factor de von Willebrand.

Las células epiteliales renales se pueden ver en verde marcadas con citokertaína-18. Para probar la funcionalidad renal in vitro, los constructos se incubaron con albúmina marcada con FITC. Si bien se encontró albúmina residual lejos de los segmentos de tejido renal incrustado, también hubo puntos calientes en las células epiteliales tubulares renales.

Estos puntos calientes son la albúmina que atraviesa intraluminalmente, lo que se cree que representa la recaptación de albúmina en la construcción celular del segmento renal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar segmentos renales de riñones murinos para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en una a 1-1/2 horas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, incluida la siembra de constructos celulares, con el fin de responder a otras preguntas sobre la fabricación y caracterización de constructos renales. No olvide que trabajar con instrumentos quirúrgicos y cilindros de oxígeno presurizados puede ser extremadamente peligroso. Tenga cuidado cuando trabaje con objetos afilados y recuerde anclar los tanques de oxígeno a una mesa de laboratorio.