Name: Tridimensional Tecnología Biomimética: Novel biorubber Crea Definido micro y macro escala Arquitecturas de colágeno hidrogeles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Aprende a fabricar andamios tridimensionales de colágeno que replican la microgeometría de tejidos in vivo utilizando goma de BSA como material sacrificial. Este método biomimético permite estudiar interacciones célula-ECM con alta fidelidad arquitectónica.

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Este trabajo fue apoyado por NIH-NIDCR IRO1DE019355 (MJ Yost, PI) y NSF-EPSCoR (EPS-0903795).

1. Determinar el porcentaje de sólidos en el lote de colágeno <ol><li> Extraer el colágeno siguiendo un procedimiento previamente publicado 13. Descongelar un mínimo de 20 ml de colágeno. Determinar el porcentaje inicial de sólidos de colágeno en el lote con el fin de manipular la concentración de colágeno en los hidrogeles formados. <ol><li> Cortar tres piezas de papel de aluminio (alrededor de 6 x 6 cm) y la forma de cada uno de ellos como un pan mediante el uso de la parte inferior de un vaso de precipitados de 25 ml. Anotar el peso de cada bandeja. </li><li> Añadir una pequeña cantidad de colágeno para cada pan y registrar el peso total de la bandeja de aluminio y colágeno. Añada 0,5 - 0,8 g de colágeno en cada recipiente de aluminio. Nota: Después de este paso, hay tres moldes de papel de aluminio y cada uno debe tener una pequeña cantidad de colágeno. Asegúrese de registrar el peso de cada uno (en total 3) bandeja de aluminio vacía y el peso de la sartén después de la adición de colágeno. </li><li> Calcular el peso del colágeno en cada molde con el fespués de fórmula: El colágeno de peso = Pan y el peso de colágeno - Pan de peso </li><li> Coloque las tres bandejas de aluminio que sujetan el colágeno en el horno a 100 ° C durante 24 horas. </li><li> Después de 24 horas, se registra el peso de cada recipiente de aluminio y el colágeno deshidratado. </li><li> Calcular el peso del colágeno deshidratado usando la siguiente ecuación: peso deshidratado colágeno = Pan y el peso de colágeno deshidratado - Pan de peso </li><li> Calcular el porcentaje de sólidos para las tres muestras para determinar la concentración de sólidos de colágeno utilizando la siguiente fórmula: <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/53578/53578eq2.jpg" /></li><li> Calcular el contenido de sólidos de colágeno media del lote usando el porcentaje de sólidos de colágeno para cada una de las tres muestras. Nota: El colágeno que se utilizará es lo que queda del colágeno hidratado. será necesario utilizar ninguno de colágeno deshidratado. </li><li> Después de determinar el porcentaje de colágeno sólido (iconcentración de colágeno nitial) del lote, continuar usando el colágeno hidratado restante. Utilice un medidor de pH calibrado para ajustar el pH del lote de colágeno a 3. <ol><li> Añadir pequeñas cantidades (2-5 l a la vez) de 12 N de ácido clorhídrico (HCl). Mantener en hielo en todo momento. No añadir el ácido clorhídrico directamente al colágeno - añadir el ácido al lado del tubo. Después de añadir el ácido, utilizar la espátula para empujar el ácido al colágeno y rápidamente se agita la mezcla. </li></ol></li><li> Una vez que se alcanza un pH de 3, dejar que el colágeno se sientan O / N a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de la BSA de goma <ol><li> Preparar la solución de albúmina de suero bovino (BSA) siguiendo el procedimiento que aparece a continuación. <ol><li> Preparar la solución de 2x tampón fosfato salino (PBS). Añadir dos comprimidos de PBS a 100 ml de agua para hacer una solución 0,02 M PBS. </li><li> Combinar BSA con PBS 2x para crear una solución de BSA 30% usando el procedimiento enumerado a continuación. <ol><li> Por ejemplo, para hacer una BSA 30% con 30 ml de 2x PBS, utilizar 12,9 g de BSA. Añadir 1/3 de la 2x PBS (por ejemplo, 10 ml) a un matraz con una barra de agitación. Añadir 1/2 de la BSA (por ejemplo, 6,45 g BSA) al matraz y el uso de una espátula, mojar el soluto seco. </li><li> Repita este proceso de adición de PBS y luego BSA hasta que todo el soluto y el disolvente es en el matraz. Utilice la espátula para mojar todo el soluto. Se parece a una mezcla de un poco de líquido y macizos. Dejar reposar durante aproximadamente 30 minutos. </li><li> A continuación, gire el agitador en un ciclo de baja y asegurarse de que no hay grumos de todo el barra de agitación. Se debe tomar 90 minutos para conseguir todo en solución o se puede dejar de agitar O / N a 4 ° C. Después de que el soluto se disuelve todo, colocar la solución en una jeringa de 20 ml y se tapó con un filtro de jeringa de 0,20 micras. Presione el émbolo para expulsar el líquido a través del filtro y recoger la solución esterilizada en un tubo nuevo. Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparar 3% de glutaraldehído solutien diluyendo solución de glutaraldehído al 25% esterilizada por filtración con 2x PBS. Por ejemplo, para 10 ml de solución de glutaraldehído al 3%, utilizar 2 ml de 25% de glutaraldehído y 8 ml de 2x PBS. Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Tratamiento Moldes Nota: El prototipo que se describe en este documento utiliza un acero inoxidable Y pieza de molde hecho a medida. El molde contiene una entrada y dos canales de salida de 4 y 3 mm, respectivamente. En primer lugar, los moldes limpios, rociarlas con manteca de cerdo no saturado, y esterilizarlos. Preparar los moldes siguiendo el procedimiento descrito a continuación. <ol><li> Limpiar moldes de acero inoxidable utilizando ultrasonidos a una frecuencia de 35 kHz. Colocar los moldes en el baño de ultrasonidos y sumergirlos en agua y hielo. Mantenga los moldes de frío en todo momento, mientras que el aparato de ultrasonidos se está ejecutando. Ejecutar el aparato de ultrasonidos durante 2 períodos de 90 minutos. <ol><li> Después de cada período, utilizar una aguja para asegurarse de que no hay ningún material en el Luer Lock de acero inoxidable o bRass conector. Use agua y jabón para limpiar toda la superficie de los dos lados de los moldes. Compruebe que no hay ninguna obstrucción en los canales. </li></ol></li><li> Colocar los moldes, tornillos y conector de cierre Luer en una bolsa de autoclave y dejar él. </li><li> Llene la botella que se conecta a una mitad de camino pistola de aire con manteca de cerdo disponible en el mercado (agente de liberación de ácidos grasos mixtos). Vuelva a colocar la tapa con una tapa de botella regular. Colocarlo en una bolsa de autoclave y dejar él. Nota: Manteca de cerdo se utiliza para facilitar la liberación del material que va a ser inyectado reacción más adelante (BSA caucho). No coloque la tapa de la botella del rociador en el autoclave- que puede dañar la junta interna. </li><li> Calentar la manteca durante 45 segundos o hasta que la clara y líquida en un microondas. Tornillo de la tapa de pistola de aire a la botella de manteca de cerdo. Conectar la tapa con el pulverizador. Coloque el pulverizador a la fuente de aire a la mesa del laboratorio. Abrir la válvula de aire, y abrir la boquilla del pulverizador hasta que comienza a mojar la superficiede una toalla de papel. </li><li> Pulverizar la manteca de cerdo perpendicular a la superficie del molde hasta que la superficie está totalmente cubierto. Después de cada pieza ha sido pulverizada, colocarlos en una placa de Petri y sellarlo. Colocar los moldes a 4 ° C durante 2 horas. </li><li> Proceder para esterilizar los moldes mediante la exposición de la superficie a luz UV durante 30 min. Coloque de nuevo a 4 ° C hasta que estén listos para ser inyectada reacción. </li></ol> 4. Reacción de inyección de la BSA de goma Nota: Todos los materiales y la solución se deben mantener en frío hasta que esté listo para usar para prevenir endurecimiento prematuro de la goma de BSA en los próximos pasos. <ol><li> Preparar el dispensador para la entrega de la goma de BSA a los moldes siguientes estos pasos. <ol><li> Esterilizar todos los componentes de mezcla (dos anillos O, tapa de la jeringa, doble jeringa, la punta de mezcla, y 4: 1 dosificador) al exponerlos a la luz UV durante 30 minutos en la campana de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Nota: Una campana de PCR se utilizó porque tsu procedimiento implica fijadores. Estos productos químicos no se pueden utilizar en la campana de cultivo de células / tejidos debido al riesgo de la exposición y la toxicidad a las células. Cualquier otra campana que contiene una luz ultravioleta será adecuado. </li><li> Coloque la tapa de punta en el soporte de la solución. </li><li> Realizar la mezcla y la inyección a una proporción de 4: 1 de BSA: glutaraldehído. Añadir el 30% de BSA a la cámara de doble jeringa que va a ofrecer la más alta cantidad de solución (Tardará aproximadamente 4 ml para rellenar). Asegúrese de dejar suficiente espacio para colocar la junta tórica con el fin de evitar la contaminación y desbordante de la cámara adyacente. </li><li> Añadir solución de glutaraldehído al 3% a la otra cámara (que tomará alrededor de 1 ml para rellenar). Asegúrese de dejar suficiente espacio para colocar la junta tórica para evitar la contaminación y el desborde de la cámara adyacente. </li><li> Coloque la jeringa doble en el dispensador. Incline el conjunto verticalmente, de modo que la tapa de la jeringa es en la parte superior. Vuelva a colocar la tapa con la punta de mezcla. </li><li> Carolina del SurRew las dos piezas de molde de acero inoxidable juntos. </li><li> Coloque el conjunto en el interior de una bolsa de autoclave. </li><li> Para eliminar el aire en el dispensador, mantenerlo en la posición vertical y rápidamente apretar el mango de una vez para liberar una pequeña cantidad de la BSA mezclado con el glutaraldehído. A continuación, conecte de forma rápida conector de cierre Luer el acero Y del molde de acero a la punta de la jeringa. </li><li> Sostenga el molde de acero inoxidable Y con la mano izquierda y el dispensador mezcla de BSA-glutaraldehído a la derecha. cubriendo alternativo cada uno de escape izquierda y derecha de los canales colectores presionando el tubo de escape a los lados de la bolsa de autoclave para asegurarse de que los huecos en el interior se llenan con la solución. A continuación, colocar los moldes de forma horizontal e inyectar de nuevo. </li><li> Separar los moldes de dispensador y colocar en una placa de Petri de 25 mm. </li><li> Coloque Parafilm alrededor de la placa de Petri para prevenir la deshidratación de la goma. </li><li> Colocar el molde en la nevera 4 ° C O / N. </li></ol></li></ol> Nota: El colágeno debe mantenerse en hielo en todo momento durante el proceso. <ol><li> Modificar la concentración de colágeno utilizando el porcentaje de sólidos de colágeno. <ol><li> Hacer 10 ml de colágeno 1,75% mediante el ajuste de la concentración inicial de colágeno con agua fría. </li><li> El uso de un medidor de pH calibrado, ajustar el pH a 3 utilizando 12 N ácido clorhídrico. No añadir el ácido clorhídrico directamente al colágeno añadir el ácido al lado del tubo. Después de añadir el ácido, utilizar la espátula para empujar el ácido en el colágeno y rápidamente se agita la mezcla. </li><li> Pesar 4 g de colágeno en un tubo cónico separado. </li><li> Centrifugar el colágeno para eliminar el aire a 4 ° C y 9.343 xg durante 20 a 30 min. </li><li> UV esterilizar la campana de cultivo de células durante 30 minutos, y añadir 14 l de laminina al colágeno 4 ml. Esto dará lugar a una concentración de laminina final de 10 g / l. Nota: La laminina ofrece sintegridad STRUCTURALES, adhesión, y promueve diversas respuestas celulares. </li><li> Girar la PCR luz ultravioleta durante 20-30 minutos antes de usar la campana para la esterilización. </li><li> Coloque la tapa de cierre Luer, para adjuntar a una jeringa de 20 ml, en etanol durante una hr 2. Luego, deje que se seque y lo coloca a la luz UV. </li><li> Gamma irradiar el colágeno de 8,6 minutos para llegar a 1.200 cGy. Nota: El tiempo dependerá de la decadencia de la fuente de cesio. Ajustar el tiempo para llegar a la misma dosis. </li></ol></li></ol> 6.Casting colágeno en BSA goma <ol><li> Para polimerizar el colágeno, usar un 8: 1 ratio: 1 (colágeno: HEPES: MEM). El siguiente procedimiento se basa en un 4 g inicial de colágeno acidificado (de la etapa 5.1.8). <ol><li> Hacer una solución 0,2 N HEPES en agua, y ajustar el pH a 9 mediante la adición de pequeñas cantidades (1 a 5 l) de solución de hidróxido de sodio 1 a 5 M (NaOH). El uso de un medidor de pH calibrado, controlar el pH de la solución después de cada adición. Almacenar a 4 ° C o keep sobre hielo. </li><li> Encienda la luz UV de la campana de cultivo de tejidos durante 20-30 minutos para esterilizar el capó. </li><li> fórceps autoclave, espátula, y el bisturí para la esterilización. </li><li> Mezclar 1,5 ml de 0,2 N HEPES (pH 9) y 1,5 ml de 10x MEM utilizando el campana de cultivo de tejido. Asegúrese de mantener en hielo y agitar durante 5 segundos antes de su uso. Almacenar a 4 ° C o mantener en hielo. </li><li> Para esterilizar el capó PCR, encender la luz UV durante 30 minutos. </li><li> Colocar una placa de 12 y una jeringa de 20 ml en -20 ° C durante 10 min, o hasta que esté listo para continuar. Nota: Mantenga todos los materiales en frío hasta que esté listo para su uso. El aumento de la temperatura induce fibrilogénesis prematura de colágeno. </li><li> Rociar todos los tubos y placas, así que van a estar en la campana con un 70% de etanol y dejar secar durante la esterilización. Coloque una jeringa de 20 ml en hielo para enfriar para su uso posterior. </li><li> En la campana de PCR, abrir los moldes de acero inoxidable para liberar el caucho de BSA y el uso de un bisturí, cortar los canales de escape de la BSA rubber molde. </li><li> Bajo el capó PCR, abrir los tubos de colágeno estériles y añadir 1 ml de la solución de HEPES-MEM (asegúrese de que antes de extraer la solución de HEPES-MEM, que se mezcla bien y no hay depósitos sólidos). </li><li> Usando la espátula estéril, mezclar a fondo la solución de colágeno y tampón. </li><li> Cerrar y agitar rápidamente para asegurar un hidrogel bien mezclada. </li><li> Transferencia a una jeringa de 20 ml fría. </li><li> Con una mano, sostenga el BSA de goma en el interior del pozo y, con la otra, dispensar medio de la solución de hidrogel de colágeno en la parte inferior del pozo. </li><li> Usando las pinzas estériles, asegúrese de que los extremos de flujo de entrada y de salida de goma estén en contacto con las paredes del pozo. </li><li> Verter solución de colágeno en la parte superior de la goma hasta que está completamente cubierto. </li><li> Asegúrese de que el caucho de BSA está suspendido dentro del colágeno y de que no hay burbujas, especialmente cerca de los extremos de la goma. </li><li> Coloque la tapa y se envuelve alrededor de la Parafilmcircunferencia del pozo. </li><li> Poner en la incubadora durante 1 hora a 37 ° C. Mantenga la luz UV en la PCR. </li></ol></li><li> Después de la polimerización del colágeno, UV reticular el hidrogel a través de la siguiente procedimiento. Nota: La reticulación del colágeno se realiza utilizando un aparato de agente de reticulación UV en la que la cantidad de energía puede ser controlada. <ol><li> Encienda el agente de reticulación UV y utilizar la configuración de energía para irradiar la cámara de vacío con 630.000 mu J / cm2. </li><li> Retire los geles de la incubadora. </li><li> Pulverizar las manos con etanol, y, dentro de la cámara, retire la tapa lo más rápido posible. </li><li> Cierre la cámara de UV y reticular los hidrogeles mediante la selección de la configuración de energía y la irradiación de 630.000 mu J / cm2. </li><li> Después del ciclo de reticulación, apagar la luz UV en el capó de PCR </li><li> Pulverizar las manos con etanol y abrir la cámara, colocar rápidamente la tapa de nuevo en la placa también. Mover la placa dea la campana PCR. </li><li> El uso de la espátula estéril, suavemente aflojar y remover el gel del pozo. Voltear los geles bajo el capó para reticular la parte inferior del hidrogel. Repita el paso 6.2.3 y 6.2.4. </li></ol></li></ol> 7. Digestión enzimática de la goma de BSA <ol><li> Con el fin de tener una estructura de colágeno hueco, eliminar BSA de goma de una manera que no afecta a las dimensiones embebidos en el hidrogel. El procedimiento se describe a continuación. <ol><li> Encienda la luz UV durante 20-30 minutos para esterilizar la campana de cultivo de tejidos. </li><li> Hacer 0,25% de solución de tripsina pH 7,8. Por ejemplo, para 15 ml de agua, añadir 0,0376 g de tripsina en un tubo cónico de 50 ml. Ajustar el pH a 7,8 mediante la adición de pequeñas cantidades (2-5 l) de 1 M de NaCl. Colocar la solución en una jeringa de 20 ml y se tapó con un filtro de jeringa de 0,20 micras. Presione el émbolo para expulsar el líquido a través del filtro y recoger la solución estéril en un tubo nuevo. </li><li> Encienda el baño de agua y ajustar la temperatura a 30DO. </li><li> Después de 30 minutos, apagar la luz UV. Pulverizar etanol en todos los tubos y materiales que se utilizarán en la campana. </li><li> Transferir el hidrogel de colágeno bajo el capó y el lugar en el tubo cónico separada. </li><li> Añadir alrededor de 3-5 ml (suficiente para cubrir los geles) de solución de tripsina al 0,25% con un pH de 7,8 a cada tubo. </li><li> Sellar los tubos con Parafilm y agitar suavemente durante aproximadamente 1 min. </li><li> Lugar en el baño de agua a 30 ° C durante 15-24 horas. Mientras que en el baño de agua, ligeramente vórtice los geles con frecuencia hasta que la goma de BSA se ha digerido o retirar material de hidrogel. Nota: Con el fin de determinar si el caucho BSA se ha eliminado, ya sea el caucho está flotando en la solución de tripsina o hay piezas averiados. No debe haber zonas oscuras visuales dentro del hidrogel. </li></ol></li><li> Para asegurarse de que todo el caucho de BSA y la tripsina se ha eliminado de los hidrogeles, enjuagarlo como se describe a continuación. <ol><li> Encienda el hoo PCRd luz UV durante 20-30 min. </li><li> Preparar la solución Mosconas. Combinar cloruro de potasio (KCl, 28.6 mM), (NaHCO3, 11,9 mM), glucosa (9,4 mM) y (NaH 2 PO 4, 0,08 mM) en agua. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH 1 M o solución 12 M HCl. Colocar la solución en una jeringa de 20 ml y el uso de un filtro de jeringa de 0,20 micras para esterilizar la solución. </li><li> Rociar todo con etanol antes de colocarlos en el capó y permitir que el etanol se seque. </li><li> Abrir el tubo y la transferencia de 5-10 ml de solución estéril Mosconas a un nuevo tubo cónico de 50 ml. </li><li> Transferir el hidrogel de colágeno al tubo cónico que contiene la solución de enzima. Asegúrese de que el hidrogel está completamente cubierto con la solución. Deje el tubo en la coctelera en la nevera a 4 ° C durante 30 minutos. </li><li> Aspirar la solución Mosconas y repita el paso 7.2.5 dos veces. </li><li> Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li></ol>

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<li>Chatterji, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+with+hydrophilic%2Fhydrophobic+grafts+and+glutaraldehyde+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks.</a> J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).</li>
<li>Freije, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+modified%2C+immobilized+trypsin+reactor+with+improved+digestion+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency.</a> J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).</li>
<li>Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+gels+for+intratumoral+delivery+of+beta-lapachone%3A+effect+of+cyclodextrins+and+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorldJournal%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol.</a> ScientificWorldJournal. 2012, 126723(2012).</li>
<li>Basak, R., Bandyopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+hydrophobic+drugs+in+Pluronic+F127+micelles%3A+effects+of+drug+hydrophobicity%2C+solution+temperature%2C+and+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH.</a> Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Biofabrication es un campo altamente multidisciplinar en el que los principios de la biología y la ingeniería se fusionan para generar materiales complejos que imitan el tejido nativo. Con el fin de conseguir esto, hay una necesidad de desarrollar técnicas que utilizan la información reunida a partir de tejido in vivo y traducirlo en un andamio in vitro. De esta manera, una plataforma puede diseñarse que se parece mucho a las propiedades arquitectónicas, funcionales y mecánicas del tejido in vivo.<...

En el campo de la ingeniería de tejidos la capacidad de fabricar andamios de tejido es vital. Un andamio de tejido adecuado tiene una estructura 3D, se compone de materiales biocompatibles, e imita la arquitectura del tejido vivo en para facilitar el crecimiento de células y tejidos y remodelación. Este andamio debe permitir el transporte de nutrientes y la eliminación de desechos 1-4. Uno de los principales obstáculos en la producción de estos andamios es la capacidad de recapitular características geométricas específicas en un material biocompatible. Varias técnicas Biofabrication han sido reportados para el control de las características geométricas de estos andamios, ejemplos se electrospinning 5-8, disolvente a presión 9, 10 estereolitografía, y 3D-impresión 11, entre otros. Estas técnicas están a la altura para proporcionar una transferencia relativamente fácil de elementos arquitectónicos internos y externos controlables, son caros, están limitados por su resolución y capacidad de impresión ( <em&gt; Por ejemplo, indicador de la boquilla, la restricción de materiales), o requieren técnicas de fabricación posterior a lo que exige un largo período de tiempo para producir andamios viables 12. En muchos sistemas de fabricación comercial, la creación de vacíos internos, canales y funciones se consigue utilizando arena u otros materiales extraíbles o de sacrificio adecuados. La parte de metal o de plástico se forma alrededor del molde de arena, y una vez que se solidifica, se retira la arena. De la misma manera, la nueva generación de biomateriales necesita la bioarena equivalente. Por lo tanto, el caucho de BSA fue desarrollado como un sustituto de bioarena. El caucho de BSA es un material de nueva formulación que consiste en albúmina de suero bovino reticulado con glutaraldehído. El objetivo final es volver a crear las características arquitectónicas específicas en una estructura de colágeno biodegradable. Se describen las características de la biorubber sacrificial que mantiene la fidelidad dimensional con el molde de tejido original. <p clculo = &quot;jove_content&quot;&gt; Varias combinaciones de concentraciones de BSA y el glutaraldehído se ensayaron usando una variedad de disolventes. Este material fue creado por la reacción entre BSA y glutaraldehído. BSA caucho puede ser de reacción se inyecta en las intrincadas geometrías de los moldes de tejido. Reticulado BSA se tripsina lábil y fácilmente digerido por la enzima en condiciones de pH y temperatura suaves. Por el contrario, el tipo intacto I colágeno es muy resistente a la digestión con tripsina. Estas características se han capitalizado para eliminar selectivamente el caucho BSA dejando el colágeno atrás. El presente trabajo consistió en determinar los parámetros ideales necesarios para obtener un molde lábil que puede ofrecer características arquitectónicas específicas para un andamio biocompatible. Las características específicas que se evaluaron incluyen capacidad de mezcla, digestión con enzimas, de soporte de carga, y la capacidad de ser de reacción se inyecta en un molde negativo. La combinación de 30% de BSA y 3% de glutaraldehído cumple estos requisitos. Este protocolo proporciona la necessdirectrices ary para crear estos andamios tridimensionales. El prototipo consiste en un andamio de colágeno que representa una arquitectura ramificado con un solo flujo de entrada y flujo de salida de dos canales con diámetros de 4 y 3 mm, respectivamente. Esta técnica tiene el potencial para imitar macro y micro-ambientes del tejido de interés. Esta tecnología proporciona una técnica viable para entregar un instructivo geométrico específico de un material biodegradable en un asunto relativamente fácil y oportuno con alta fidelidad, que puede ser sintonizado para imitar la elasticidad de los tejidos in vivo y otras características del tejido de interés.

<table><tbody><tr><td>Colágeno tipo I</td><td></td><td></td><td>Colágeno extraído de la piel de becerro</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón de fosfato (comprimidos de PBS)</td><td>MP Biomedical</td><td>U5378 1</td><td>comprimido por 100 ml rinde 1x</td></tr><tr><td>PBS Albumium a partir de suero bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>G5882</td><td>Campos de</td></tr><tr><td>manteca de cerdo</td> tóxica <td></td><td>3090</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de</td><td></td><td></td> acero inoxidable <td>fresados con máquina de microlución</td></tr><tr><td>Kit de aerógrafo</td><td>Neumático Central</td><td>47791</td><td></td></tr><tr><td>Punta de mezcla para jeringa doble</td><td>Medmix</td><td>ML2.5-16-LLM</td><td>Mezclador, DN2,5X16, 4:1 marrón, med</td></tr><tr><td>Junta tórica pequeña para jeringa doble</td><td>Medmix</td><td>PPB-X05-04-02SM</td><td>Pistón B, 5 ml, 4:1, PE</td></tr><tr><td>natural Doble Jeringa tapón&nbsp;</td><td>Medmix</td><td>VLX002-SM</td><td>Capón, 4:1/10:1, PE marrón, med</td></tr><tr><td>Junta tórica grande para jeringa doble</td><td>Medmix</td><td>PPA-X05-04-02SM</td><td>Pistón A, 5 ml, 4:1</td></tr><tr><td>Jeringa Doble</td><td>Medmix</td><td>SDL X05-04-50M</td><td>Jeringa doble, 5 ml, 4:1</td></tr><tr><td>Dispensador de jeringa doble</td><td>Medmix</td><td>DL05-0400M</td><td>Dispensador, 5 ml, 4:1, med, plain</td></tr><tr><td>Laminim</td><td></td><td></td><td>3.6 mg/ml - extraído USC lab</td></tr><tr><td>Jeringa de 20 ml Luer Lock Tip</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock</td><td>Caps Fisher</td><td>JGTCBLLX</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM)</td><td>Life Technologies</td><td>1143-030</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Life Technologies</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Reticulante UV&nbsp;</td><td>Spectroline UV</td><td>XLE1000</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>S271-10</td><td>Para preparar Mosconas</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P5405-250</td><td>Para preparar Mosconas</td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sodio (NaHCO3)</td><td>Fisher</td><td>BP328-500</td><td>Para preparar Mosconas</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>G-8270</td><td>Para preparar Mosconas</td></tr><tr><td>Fosfato Sódico didasico (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-7907</td><td>Para preparar Mosconas</td></tr><tr><td>Filtro Estéril para jeringas</td><td>Corning</td><td>431224</td><td></td></tr></tbody></table>

tridimensional tecnología biomimética: novel biorubber crea definido micro y macro escala arquitecturas de colágeno hidrogeles

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

andamiaje de tejido juegan un papel crucial en el proceso de regeneración de los tejidos. El andamio ideal debe cumplir varios requisitos, tales como que tiene la composición adecuada, el módulo de objetivo, y las características arquitectónicas bien definidas. Biomateriales que recapitular la arquitectura intrínseca de tejido in vivo son de vital importancia para el estudio de enfermedades, así como para facilitar la regeneración de tejido blando y perdido con formato incorrecto. Una nueva técnica fue desarrollada Biofabrication que combina la proyección de imagen del arte, la impresión en tres dimensiones (3D), y la actividad enzimática selectiva para crear una nueva generación de biomateriales para la investigación y aplicación clínica. El material desarrollado, albúmina de suero bovino de caucho, es la reacción se inyecta en un molde que mantiene características geométricas específicas. Este material de sacrificio permite la transferencia adecuada de las características arquitectónicas de un material de soporte natural. El prototipo consiste en una estructura de colágeno 3D con 4 y 3 mm canales que represent una arquitectura ramificada. En este trabajo se hace hincapié en el uso de esta técnica Biofabrication para la generación de construcciones naturales. Este protocolo utiliza un software asistido por ordenador (CAD) para la fabricación de un molde sólido que va a ser la reacción inyectado con goma BSA seguido de la digestión enzimática de la goma, dejando sus características arquitectónicas dentro del material de soporte.

Los resultados demuestran que esta técnica Biofabrication es eficiente en la generación de andamios 3D que pueden imitar la disposición espacial visto en el tejido in vivo. Las características arquitectónicas son parámetros vitales para la aplicación de la ingeniería de tejidos, que juegan un papel crucial en la interacción de las células in vivo y la funcionalidad de los tejidos. La consistencia y la capacid...

Se desarrolló una innovadora técnica de biofabricación para diseñar construcciones tridimensionales que se asemejan a las características arquitectónicas, componentes y propiedades mecánicas del tejido in vivo. Esta técnica presenta un material de sacrificio recientemente desarrollado, el caucho BSA, que transfiere características espaciales detalladas, reproduciendo las arquitecturas in vivo de una amplia variedad de tejidos.

Tridimensional Tecnología Biomimética: Novel biorubber Crea Definido micro y macro escala Arquitecturas de colágeno hidrogeles

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

El objetivo general de este protocolo es diseñar andamios tridimensionales de colágeno que puedan asemejarse a las características arquitectónicas, composición y propiedades mecánicas de los tejidos in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos, como las interacciones célula-ECM, la influencia de las características arquitectónicas en la creación de tejidos diseñados y el desarrollo de reemplazos tisulares, entre otras. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un procedimiento viable para recapitular con alta fidelidad la microgeometría de los canales y trayectos internos de flujo en un material biodegradable.La procedimiento será demostrado por Veronica Rodriguez-Rivera, una asociada posdoctoral en mi laboratorio. Los materiales utilizados para preparar el caucho de BSA deben almacenarse y mantenerse fríos hasta que estén listos para usar, de modo que el caucho de BSA no se solidifique prematuramente. La esterilidad también es muy importante para este procedimiento.Primero, esterilice el dispensador. En una campana no destinada al cultivo celular, coloque los anillos O, la jeringa, su tapa, la punta mezcladora y el dispensador de cuatro a uno. Esterilice estos materiales con luz UV durante 30 minutos.Primero, enrosque las dos piezas del molde de acero inoxidable y fije el cierre Luer. Antes de armar el dispensador, rocíe las pipetas y los reactivos con etanol al 70 % antes de introducirlos en la cabina. Primero coloque la tapa del puntero en el portador de la solución.A continuación, cargue la solución de BSA al 30 % en la cámara más grande sin contaminar la otra cámara. Deje suficiente espacio para colocar el anillo O. Luego, cargue la cámara dispensadora más pequeña con glutaraldehído al tres por ciento y coloque otro anillo O.Ahora, fije la jeringa al dispensador. Luego incline el conjunto de modo que la tapa quede en la parte superior, y sustituya la tapa por una punta mezcladora. A continuación, golpee suavemente los lados para permitir que las burbujas de aire asciendan.A continuación, coloque el dispensador dentro de una bolsa autoclavada para contener la solución de desecho. Dentro de la bolsa, con el dispensador en posición vertical, expulse una pequeña cantidad de solución para eliminar todo el aire de la jeringa. Es muy importante eliminar el aire.Luego, rápidamente, conecte el bloqueo Luer del molde en Y de acero inoxidable a la punta de la jeringa. Ahora, sosteniendo el molde con la mano no dominante, alterne la expulsión de la solución en las salidas izquierda y derecha de los canales de salida. Presione las salidas para llenar los espacios internos con la solución.Luego, coloque el molde horizontalmente e inyéctele más solución hasta que se haya utilizado la mitad del volumen del dispensador. A continuación, el molde debe colocarse en un recipiente, envolverse con parafilm y almacenarse a cuatro grados Celsius durante la noche. Este procedimiento está escalado para cuatro gramos de colágeno acidificado.Manténgalo refrigerado hasta su uso. Después de pesar el colágeno, proceda a esterilizar la solución mediante radiación gamma. Como preparación, prepare una solución fresca de HEPES 0,2 normales en agua.Luego transfiera el contenido a un tubo cónico de 50 mililitros. Ajuste el pH a nueve utilizando hidróxido de sodio concentrado. Asegúrese de esterilizar con luz UV la cabina y autoclavar la pinza, la espátula y el bisturí.En la campana, mezcle 1,5 mililitros de la solución de HEPES con 1,5 mililitros de MEM 10x. Almacene esta mezcla sobre hielo. Además, enfríe una placa de 12 pocillos y una jeringa de 20 mililitros en el congelador durante 10 minutos.Para mayor esterilidad, rocíe los tubos y placas con etanol al 70 % antes de colocarlos en la cabina. Rocíe la placa de molde y colóquela en la cabina. Luego, retire los moldes de caucho de BSA con pinzas.A continuación, corte los canales de escape del molde utilizando un escalpelo. Luego, vortex brevemente la mezcla de HEPES-MEM y añada un mililitro al colágeno. A continuación, mezcle bien la solución con una espátula estéril.Siga con un breve vortex y transfiera rápidamente la solución a la jeringa fría de 20 mililitros. Ahora, mientras sujeta el caucho de BSA dentro del pocillo, dispense la mitad de la solución de hidrogel de colágeno en el fondo del pocillo. A continuación, utilizando pinzas, coloque el molde de manera que los extremos de entrada y salida del caucho toquen las paredes del pocillo.Luego, cubra el molde con hidrogel de colágeno. Ahora, selle el pocillo con parafilm y coloque la placa en un incubador a 37 grados Celsius. Deje transcurrir una hora para que el colágeno se polimerice.Durante este tiempo, mantenga encendida la luz UV en la cabina. Además, configure el aparato de reticulación UV para que entregue 630.000 microjulios por centímetro cuadrado. Ahora, rocíe sus manos con guantes usando etanol al 70 %, cargue la placa con los moldes recubiertos de colágeno en el reticulador e inicie el proceso de irradiación.Después de la irradiación, rocíe nuevamente sus guantes y retire la placa del cruzador. Luego, utilizando una espátula estéril, retire el gel del pocillo, inviértalo y cruzelíncule la parte inferior del hidrogel. Después del ciclo final de cruzamiento, continúe con la digestión enzimática.Para eliminar el caucho de albúmina sérica bovina sin perturbar el andamiaje de colágeno, utilice una solución estéril de tripsina al 0,25 % a pH 7,8 y pásela a través de un filtro de 0,20 micrones. Transfiera suficiente solución de tripsina filtrada a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, transfiera el hidrogel de colágeno al tubo cónico que contiene la solución enzimática.Asegúrese de que el hidrogel esté completamente cubierto con la solución. Selle el tubo con parafilm y vortexee suavemente durante aproximadamente un minuto. A continuación, incube el tubo a 30 grados Celsius y deje que la digestión continúe durante 15 a 24 horas.Durante las primeras cuatro horas, retire el tubo cada 15 a 30 minutos y vórtexelo suavemente para ayudar a completar la digestión del caucho con BSA. Al día siguiente, la digestión se considera completa cuando no hay caucho flotando en la solución o no quedan fragmentos descompuestos del caucho en el hidrogel. Ahora, reemplace la solución de tripsina con solución estéril de Mosconas y deje que el tubo agite a cuatro grados Celsius durante 30 minutos.Posteriormente, aspire la solución de Mosconas y repita este paso dos veces más para limpiar completamente el andamio de colágeno. Se utilizaron un gran número de pruebas para optimizar el uso del biocauchos, las cuales se describen en detalle en el protocolo escrito. Utilizando el protocolo optimizado y tres piezas moldeadas sólidas, se fabricaron hidrogeles de colágeno y se examinaron detalladamente.El molde en Y necesario fue fabricado en una máquina Microlution. El molde en Y se inyectó con BSA al 30 % y glutaraldehído al tres por ciento, que reaccionaron durante la noche a cuatro grados Celsius. A continuación, el caucho de BSA se mezcló con el colágeno y se calentó a 37 grados Celsius durante una hora.Se realizó una digestión enzimática del caucho durante 15 horas, lo que lo debilitó hasta el punto de desprenderse sin afectar la geometría del hidrogel de colágeno. El canal de entrada de cuatro milímetros moldeado por el encofrado se midió con un calibrador y se determinó que tenía exactamente cuatro milímetros en el hidrogel de colágeno. Al evaluar la estabilidad del molde, se encontró que podían obtenerse con fiabilidad dimensiones tan pequeñas como 300 micrones.Además, se analizaron los andamios en busca de glutaraldehído residual después de los lavados Mosconas, y no se encontró ningún residuo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar andamios tridimensionales de colágeno con la capacidad de imitar geometrías in vivo. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos que complementan esta técnica, como la creación de modelos tridimensionales de tejidos in vivo y la fabricación de moldes con características arquitectónicas específicas, para responder preguntas adicionales.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos exploraran la interacción entre las características arquitectónicas internas y los componentes de la matriz con las células en modelos in vitro.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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Fabricación de micro-tejidos, utilizando los módulos de gel de colágeno las células que contienen

Aprende a fabricar andamios tridimensionales de colágeno que replican la microgeometría de tejidos in vivo utilizando goma de BSA como material sacrificial. Este método biomimético permite estudiar interacciones célula-ECM con alta fidelidad arquitectónica.

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