Tridimensional Tecnología Biomimética: Novel biorubber Crea Definido micro y macro escala Arquitecturas de colágeno hidrogeles

El objetivo general de este protocolo es diseñar andamios de colágeno tridimensionales que puedan parecerse a las características arquitectónicas, la composición y las propiedades mecánicas del tejido in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos, como las interacciones de las células ECM, la influencia de las características arquitectónicas en la creación de tejidos de ingeniería y el desarrollo de reemplazos de tejidos, entre otros. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un procedimiento viable para recapitular la microgeometría de canales y caminos de flujo interiores con alta fidelidad en un material biodegradable.

La demostradora del procedimiento estará a cargo de Verónica Rodríguez-Rivera, asociada postdoctoral en mi laboratorio. Los materiales utilizados para preparar el caucho BSA deben almacenarse y mantenerse fríos hasta que estén listos para usar para que el caucho BSA no se endurezca prematuramente. La esterilidad también es muy importante en este procedimiento.

En primer lugar, esteriliza el dispensador. En una campana de cultivo no celular, coloque las juntas tóricas, la jeringa, su tapa, la punta de mezcla y el dispensador de cuatro a uno. Los rayos UV esterilizan estos materiales durante 30 minutos.

Primero, atornille las dos piezas del molde de acero inoxidable y coloque la cerradura Luer. Antes de montar el dosificador, rocíe las pipetas y los reactivos antes de introducirlos en la campana con etanol al 70%. Primero coloque la tapa de la punta en el soporte de la solución.

A continuación, cargue la solución de BSA al 30% en la cámara más grande sin contaminar la otra cámara. Deje suficiente espacio para colocar la junta tórica. Luego, cargue la cámara dispensadora más pequeña con un tres por ciento de glutaraldehído y coloque otra junta tórica.

Ahora, conecte la jeringa al dispensador. A continuación, incline el conjunto para que la tapa quede en la parte superior y reemplace la tapa con una punta mezcladora. A continuación, golpee suavemente los lados para permitir que las burbujas de aire se desplacen hacia arriba.

A continuación, coloque el dispensador dentro de una bolsa esterilizada en autoclave para contener la solución de escape. En la bolsa, con el dispensador en posición vertical, dispense una pequeña cantidad de solución para eliminar todo el aire de la jeringa. Eliminar el aire es muy importante.

Luego, rápidamente, conecte el bloqueo Luer del molde Y de acero inoxidable a la punta de la jeringa. Ahora, con el molde en su mano no dominante, alterne la solución de expulsión en los escapes izquierdo y derecho de los canales de salida. Presione los escapes, llenando así los vacíos internos con solución.

A continuación, coloque el molde horizontalmente e inyecte más solución hasta que se haya utilizado la mitad del volumen del dispensador. El molde ahora debe colocarse en un plato, envolverse en parafilm y almacenarse a cuatro grados centígrados durante la noche. Este procedimiento se escala a cuatro gramos de colágeno acidificado.

Manténgalo frío hasta que se use. Una vez que se ha pesado el colágeno, se procede a esterilizar la solución mediante radiación gamma. En preparación, prepare una solución fresca de HEPES normal 0,2 en agua.

Luego transfiera el contenido a un tubo cónico de 50 mililitros. Ajuste el pH a nueve usando hidróxido de sodio concentrado. Asegúrese de esterilizar la capucha con rayos UV y esterilizar en autoclave las pinzas, la espátula y el bisturí.

En el capó, mezcle 1,5 mililitros de la solución HEPES con 1,5 mililitros de MEM 10x. Guarde esta mezcla en hielo. Además, enfríe un plato de 12 pocillos y una jeringa de 20 mililitros en el congelador durante 10 minutos.

Para mayor esterilidad, rocíe los tubos y placas involucrados con etanol al 70% antes de colocarlos en la campana. Rocíe la placa del molde y colóquela en la campana. A continuación, retire los moldes de goma BSA con pinzas.

Luego, corte los canales de escape del molde con un bisturí. A continuación, agita brevemente la mezcla HEPES-MEM y añade un mililitro al colágeno. Luego, mezcle bien la solución con una espátula estéril.

Siga con un breve vórtice y transfiera rápidamente la solución a la jeringa fría de 20 mililitros. Ahora, mientras asegura el caucho BSA dentro del pozo, dispense la mitad de la solución de hidrogel de colágeno en el fondo del pozo. A continuación, con unas pinzas, coloque el molde de modo que los extremos de entrada y salida de goma toquen las paredes del pozo.

A continuación, cubre el molde con hidrogel de colágeno. Ahora, selle el pozo con parafilm y cargue la placa en una incubadora a 37 grados centígrados. Espere una hora para que el colágeno se polimerice.

Durante este tiempo, mantenga encendida la luz ultravioleta del capó. Además, configure el aparato de reticulación UV para que entregue 630, 000 microjulios por centímetro cuadrado. Ahora, rocíe sus manos enguantadas con etanol al 70% y cargue la placa con los moldes cubiertos de colágeno en el reticulante y comience el proceso de irradiación.

Después de la irradiación, vuelva a rociar los guantes y descargue la placa del reticulante. Luego, con una espátula estéril, retire el gel del pocillo, déle la vuelta y reticule el fondo del hidrogel. Después del ciclo final de reticulación, proceda con la digestión enzimática.

Para eliminar el caucho BSA sin alterar el andamio de colágeno, utilice una solución estéril de tripsina al 0,25% a pH 7,8 y presiónela a través de un filtro de 0,20 micras. Transfiera suficiente solución de tripsina filtrada a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Luego, transfiera el hidrogel de colágeno al tubo cónico que contiene la solución enzimática.

Asegúrese de que el hidrogel esté completamente cubierto con la solución. Selle el tubo con parafilm y vórtelo suavemente durante aproximadamente un minuto. Luego, incuba el tubo a 30 grados centígrados y deja que la digestión dure de 15 a 24 horas.

Durante las primeras cuatro horas, retire el tubo cada 15 a 30 minutos y vórtelo suavemente para ayudar a completar la digestión del caucho BSA. Al día siguiente, la digestión se considera completa cuando no flota caucho en la solución o no hay piezas descompuestas del caucho en el hidrogel. Ahora, reemplace la solución de tripsina por una solución estéril de Mosconas y deje que el tubo agite a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.

Más tarde, aspire la solución de Mosconas y repita este paso dos veces más para limpiar completamente el andamio de colágeno. Se utilizaron un gran número de pruebas para optimizar el uso del biocaucho y se describieron en detalle en el protocolo de texto. Utilizando el protocolo optimizado y tres piezas sólidas de molde, se fabricaron y examinaron en detalle los hidrogeles de colágeno.

El molde Y necesario se fabricó en una máquina Microlution. El molde Y se inyectó con un 30% de BSA y un tres por ciento de glutaraldehído, que reaccionó durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, el caucho BSA se moldeó con el colágeno y se calentó a 37 grados centígrados durante una hora.

El caucho fue digerido enzimáticamente durante 15 horas, lo que lo debilitó hasta el punto de caerse sin afectar la geometría del hidrogel de colágeno. El canal de entrada de cuatro milímetros proyectado por el molde se midió con calibradores para tener una precisión de cuatro milímetros en el hidrogel de colágeno. Al probar la estabilidad del molde, se descubrió que dimensiones tan pequeñas como 300 micras podían diseñarse de manera confiable.

Además, los andamios fueron analizados en busca de glutaraldehído residual después de los lavados de Mosconas, y no se encontró ningún residuo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar andamios de colágeno en 3D con el potencial de imitar geometrías in vivo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos que complementan esta técnica, como la creación de modelos 3D de tejidos in vivo y la fabricación de moldes con características arquitectónicas específicas para responder preguntas adicionales.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos exploraran la interacción entre las características arquitectónicas internas y los componentes de la matriz con las células en modelos in vitro.