Evaluación visual y microscópica de mutantes desarrollo de Streptomyces

El objetivo general de las siguientes técnicas es capacitar a investigadores principiantes para trabajar con Streptomyces y otras especies relacionadas en el laboratorio de enseñanza universitaria y en las aulas de la escuela secundaria. La observación fenotípica es importante para los muchos investigadores que ingresan al campo de la investigación de Streptomyces. Este video describe los métodos para la propagación bacteriana, el almacenamiento y el examen visual y microscópico.

Los métodos de fenotipación descritos aquí utilizan Streptomyces coelicolor como modelo. Sin embargo, los métodos son aplicables a todos los miembros del género grande, así como a los Actinomyces estrechamente relacionados. La principal ventaja de estas técnicas es que están diseñadas para ser accesibles a los investigadores novatos en un aula de secundaria o en un laboratorio de enseñanza de pregrado, así como al personal de laboratorio experimentado.

Después de ver este video y leer el protocolo que lo acompaña, los nuevos investigadores deberían poder manipular sus cepas de Streptomyces, almacenarlas adecuadamente y comenzar los experimentos de caracterización visual. Los encargados de demostrar los procedimientos estarán a cargo de Garret Kandell y Sean Kirk, estudiantes de investigación de pregrado de mi laboratorio en la Universidad de Otterbein. Para empezar, utilice un método estándar, como el método de rayas de cuadrante demostrado en Saunders 2012 para rayar cepas de Streptomyces en placas de agar MS y cultivarlas en colonias individuales.

Cada cuatro a seis días, elija una sola colonia y vuelva a colocarla en un plato nuevo. A medida que las colonias envejecen, se vuelven propensas a mutaciones aleatorias. Después de llevar a cabo la mutagénesis de acuerdo con el protocolo de texto, tome nota de la morfología de la colonia para cada mutante en comparación con la cepa parental de tipo salvaje.

Al caracterizar nuevas especies de Streptomyces, se compara el nuevo aislado con el de una especie bien estudiada, observando la forma básica, la superficie de la colonia, la opacidad, la elevación y la pigmentación. Etiquete una placa de agar MS y raye cepas de tipo salvaje y mutantes en patrones de cuña. Tenga cuidado de que ninguna cepa toque otra cepa para evitar la contaminación cruzada.

Anote la fecha y la hora en que las cepas se rayan en el plato. Luego incubar las placas a 30 grados centígrados. Recuerde que es extremadamente importante proteger siempre su muestra de Streptomyces de la contaminación.

Utilice su mejor técnica estéril para todos los pasos, abriendo placas y tubos durante el menor tiempo posible. Coloque placas de Petri cultivadas en papel de color o blanco para homogeneizar el fondo. Escriba en el papel el nombre de la cepa, la fecha, la temperatura de incubación y el tiempo desde el primer rayado de la placa.

Tome fotografías digitales de la placa con la información de la tensión escrita en el fondo de papel para que la confusión sea mínima. Esterilice las pinzas lavándolas con etanol al 70% y luego pasándolas por una llama de mechero Bunsen para evaporar el etanol. Esterilice los cubreobjetos lavándolos con etanol al 70% y luego dejándolos secar en una placa de Petri estéril.

A continuación, para preparar un cubreobjetos de crecimiento bacteriano, utilice pinzas estériles para recoger un cubreobjetos estéril y colóquelo en una placa de agar MS donde el crecimiento bacteriano sea denso. Con unas pinzas, presione suavemente la parte posterior del cubreobjetos para asegurar una transferencia suficiente de esporas bacterianas y micelio aéreo. Levante el cubreobjetos de la placa y colóquelo en un ángulo de 45 grados con el material de la célula mirando hacia la superficie de un portaobjetos de microscopio que contiene una gota de 15 microlitros de 50% de glicerol.

Deje que el cubreobjetos caiga sobre el glicerol, lo que reducirá las burbujas de aire. Para realizar microscopía de contraste de fase en varios intervalos de tiempo, coloque el portaobjetos preparado en la platina del microscopio y agregue una gota de aceite de inmersión en el centro del cubreobjetos. Gire el objetivo de fase 100x en su lugar y configure la torreta del condensador en la configuración de fase adecuada para igual.

Una vez que la lente del objetivo esté en contacto con el aceite, use solo la perilla de ajuste fino para enfocar la imagen. Examine varios campos de visión para discernir diferencias notables y consistentes entre las cepas mutantes y el tipo salvaje. Como la capacidad de formar esporas, el tamaño y la forma de las esporas y el número total de esporas.

Con pinzas estériles, prepare un cubreobjetos de una placa de agar MS como antes, donde el crecimiento bacteriano es evidente, tocando suavemente la parte posterior del cubreobjetos con las pinzas para garantizar una transferencia suficiente de esporas bacterianas y filamentos aéreos. Levante el cubreobjetos de la placa y colóquelo en cartulina de modo que el lado con el material de la celda quede hacia arriba para facilitar la manipulación del cubreobjetos. Con metanol helado, inunda el cubreobjetos y déjalo reposar durante cinco minutos.

Con PBS, lave el cubreobjetos dos veces dispensando suavemente y retirando la solución. Agregue 15 microlitros de una solución de yoduro de propidio de 10 microgramos por mililitro y o 10 microgramos por mililitro de WGA-FITC a un portaobjetos. Coloque el cubreobjetos boca abajo sobre una gota de tinte fluorescente.

Incube las muestras en una habitación oscura o con poca luz durante 15 minutos. Las existencias de las tinciones fluorescentes y las muestras de tinción deben protegerse de la luz. Se recomienda que los investigadores utilicen condiciones de poca luz mientras preparan las muestras y que utilicen una caja oscura para guardar las muestras una vez que estén preparadas.

Observe los portaobjetos bajo una lente de objetivo de 100x utilizando un microscopio de contraste de fase o DIC equipado con cubos de excitación de epifluorescencia para yoduro de propidio y FITC. Analice las imágenes de acuerdo con el protocolo de texto. Aquí se muestran ejemplos de mutantes de Streptomyces resultantes de la mutagénesis de transposones.

Un micelio aéreo de color más claro puede indicar un nivel más bajo de pigmento gris causado por un defecto en la esporulación. O la falta de una apariencia borrosa es indicativa de un bloqueo en la formación de micelio aéreo. Como se ve por microscopía de contraste de fase, las colonias de S. coelicolor de tipo silvestre generalmente producen un micelio aéreo alrededor de los dos días de crecimiento.

Y largas cadenas de esporas a los tres días de crecimiento. Los mutantes blancos pueden retrasarse en la formación de esporas, mostrar una reducción en la abundancia de esporas producidas, producir esporas con defectos de forma o tamaño o simplemente producir niveles más bajos del pigmento de esporas grises maduro. La tinción regularmente espaciada para una cadena de esporas en una muestra de tipo salvaje, que se muestra aquí utilizando DIC y microscopía de fluorescencia con tinción PI, se compara con el patrón de tinción intermitente para dos mutantes de inserción de transposones que muestran un defecto de segregación cromosómica.

Utilizando WGA-FITC para teñir la pared celular, la cepa de tipo salvaje S. venezuelae está presente como filamentos aéreos lisos entre cadenas de esporas. Y exhibe el conjunto lateral de septos de división que se ven típicamente durante la esporulación. Trabajar con un organismo filamentoso es muy diferente a trabajar con una bacteria conocida en forma de bastón.

Los protocolos de video aquí deberían servir como un recurso importante para los nuevos investigadores que ingresan al campo de la investigación de Streptomyces. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo comenzar a estudiar las especies de Streptomyces y otras bacterias relacionadas. Después de estos experimentos iniciales, se pueden usar una variedad de técnicas en un laboratorio de investigación para aprender más sobre sus cepas de Streptomyces.

Por ejemplo, algunas de las técnicas avanzadas pueden ser el marcaje de proteínas o los análisis de expresión génica, como la PCR en tiempo real y la secuenciación de ARN. Los experimentos iniciales de fenotipado se utilizan para identificar y caracterizar nuevas cepas y discernir el papel típico de un gen en particular. Estos métodos ya se han utilizado en laboratorios de docencia universitaria para identificar y caracterizar una amplia variedad de cepas de Streptomyces.