Name: Establecimiento y Optimización de una instalación de alto rendimiento para el Estudio Staphylococcus epidermidis Y Mycobacterium marinum La infección como modelo para el descubrimiento de fármacos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprende a establecer un sistema de alto rendimiento para infectar embriones de pez cebra con Staphylococcus epidermidis y Mycobacterium marinum. Este método automatizado permite el análisis de grandes cohortes para descubrimiento de fármacos.

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Estamos muy agradecidos a Leonie de Boer y Bas Zaat (Centro Médico Académico) por darnos la S. cepa epidermidis O-47. Agradecemos Rico Bongaarts, Francis Smet y Angela Comas (Unión Biometrica) en busca de ayuda y asesoramiento con el COPAS XL y análisis Bioimager VAST. Agradecemos a Davy de Witt, Ulrike Nehrdich y Laura van Hulst, de portería peces, y otros colegas de la Universidad de Leiden útil para los debates. Esta investigación forma parte del Proyecto P5.03 IBIZA del programa de investigación del Instituto de Biomédica Materiales, co-financiado por el Ministerio holandés de Asuntos Económicos, y del Programa de Mix Inteligente (NWOA_6QY9BM) del Ministerio de Asuntos Económicos de los Países Bajos y El Ministerio holandés de Educación, Cultura y Ciencia. El apoyo adicional se obtuvo a partir del proyecto de la UE ZF-Salud (FP7-HEALTH-2009-242.048), y RMJ fue apoyado por becas Marie Curie como investigador experimentado en la formación inicial de la red FishForPharma (PITN-GA-201 de la UE1-289209). SJR recibió fondos de la Iniciativa sobre Medicamentos Innovadores empresa común en virtud del acuerdo de subvención n ° 115337, los recursos de los que se componen de la contribución financiera del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) y las empresas de la EFPIA en autores contribution.The amables RECONOCE el apoyo financiero del Fondo de la Universidad de Leiden (LUF) para la robótica y de Cyttron, en el programa de Subvenciones Investeringen Kennisinfrastructuur Besluit, que a su vez cuenta con el apoyo financiero de la Organización Holandesa para la Investigación Científica de las instalaciones de formación de imágenes. La adquisición del sistema COPAS fue parcialmente apoyado por la División de la Tierra y Ciencias de la Vida (ALW) con la ayuda financiera de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO, 834.10.004).

1. Cepas bacterianas y condiciones de cultivo <ol><li> Preparar S. epidermidis inóculo <ol><li> Tome varias colonias individuales de S. epidermidis cepa S-47, que contiene un vector de expresión deriva pWVW189 mCherry (De Boer L. no publicado) a partir de un medio Luria Bertani (LB) placa de agar suplementado con 10 mg / ml de cultivo y cloranfenicol durante la noche a 37 ° C en 25 ml de medio LB suplementado con 10 mg / ml de cloranfenicol a midlog etapa. </li><li> Centrifugar 1 ml del cultivo a 12.000 xg durante 1 min y, posteriormente, se lavan 3 veces con ellos 1 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) con 0,3% (v / v) de Tween-80. </li><li> Medir la densidad óptica a 600 nm (DO 600), y diluir la suspensión bacteriana a una DO 600 de 0,3 en 2% (w / v) de polivinilpirrolidona 40 (pvp 40) en PBS. Nota: un OD 600 de 0,3 corresponde a 1,0 x 10 8 unidades formadoras de colonias / ml (ufc / ml). </li></ol&gt; </li><li> Preparar M. marinum inóculo <ol><li> Tome varias colonias individuales de M. marinum cepa M o E11 contiene el vector pSMT3-mCherry que expresan establemente mCherry 10 de una placa de agar Middlebrook 7H10 con 10% (v / v) de enriquecimiento de Middlebrook OADC suplementado con 50 mg / ml de higromicina y la cultura durante la noche a 28 ° C en 10 ml de caldo de Middlebrook 7H9 con 10% (v / v) de enriquecimiento de Middlebrook ADC suplementado con 50 g / ml de higromicina. </li><li> Centrifugar 1 ml del cultivo a 12.000 xg durante 1 min y, posteriormente, la lavan 3 veces con 1 ml de PBS estéril con 0,3% (v / v) de Tween-80. </li><li> Medir el diámetro exterior 600, y diluir la suspensión bacteriana a una DO 600 de 0,3 en 2% (w / v) pvp 40 en PBS. Nota: un OD 600 de 1 corresponde a 1,0 x 10 8 ufc / ml. </li></ol></li></ol> 2. Preparar huevos de pez cebra <ol><li> Coloque un máximo de 70 hombres y 50 mujeres ty salvajepe pez cebra por separado en el recipiente de cría de gran tamaño. Nota: Coloque el pescado de la mujer en la parte inferior del recipiente de cría de gran tamaño. </li><li> Retire el separador al día siguiente por la mañana, para que el pez cebra se inicia la reproducción. </li><li> Recoger los huevos en la parte inferior del criadero flotante grande a través del colector de huevo en un tubo de 50 ml llena con agua de huevo (60 g de sal marina Instant Ocean ml /). </li></ol> 3. Las agujas de inyección <ol><li> Obtener disponibles comercialmente por encargo agujas capilares de vidrio con un diámetro interno de 10 micras. </li></ol> 4. Esquema experimental de Inyección <ol><li> Hervir 100 ml de 1% (w / v) de agarosa en agua de huevo y fresco hasta aproximadamente 40 º C. Verter en la placa de agarosa microinyectores automatizado y colocar el sello de 1024-hasta bien entrada la agarosa. Nota: La placa está listo para usar cuando se enfría. </li><li> Por microinyector operativo de software automatizado clic en &quot;Calibrar etapa &#39;,a continuación, haga clic en la parrilla bien &#39;1024 &#39;y coloque la placa de agarosa en microinyector y calibrar la placa haciendo clic en la pantalla en la posición del centro del pozo. </li><li> Ir al menú &#39;aguja&#39; y haga clic en &quot;soporte de la aguja de calibración &#39;. </li><li> Llene la aguja de inyección usando una punta microloader con 10 l pvp 40 que contiene 100 ufc / nl S. epidermidis o 30 ufc / nl M. marinum o uso pvp 40 como inyección simulada. </li><li> Coloque la aguja en el micro-inyector automatizado y calibrar la posición x, y al bajar o mover la aguja hacia arriba y haciendo clic en la pantalla en la posición de la aguja. Luego calibrar la posición z de la aguja haciendo clic en la pantalla en la posición de la punta de la aguja. </li><li> Distribuya los huevos sobre la cuadrícula de agarosa utilizando una pipeta de plástico y retire el exceso de agua del huevo. Coloque la rejilla de agarosa en el microinyector automatizado. </li><li> Ir a la &#39;injectioMenú n &#39;y cambie la &quot;presión de inyección&quot; establecer a 200 hPa,&#39; Tiempo de inyección &#39;0.2 segundos y la &quot;presión de Compensación&#39; 15 hPa, que se correlaciona con 1 nl, en el menú de ajustes FemtoJet. </li><li> Haga clic en &#39;Inyectar todo&#39; para inyectar toda la placa. </li><li> Recoger los huevos después de la inyección mediante el lavado de ellos en una placa de Petri (92 x 16 mm), con un máximo de 70 embriones por placa de Petri, y se incuba a 28 ° C. </li></ol> 5. Análisis citómetro de flujo <ol><li> Preparar el flujo de partícula grande citómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante y llenar la copa de muestra y el contenedor de fluido de funda con agua huevo. </li><li> En el software operativo, vaya al menú &quot;PMT&quot; y utilizar los siguientes valores: 650 V para el canal &#39;Red&#39; y 0 V para la &#39;Verde&#39; y canales &#39;Yellow&#39;. A continuación, vaya al menú &quot;Umbrales&quot; y utilice la siguiente configuración: &#39;Optical densidad &#39;señal de umbral: 975 mV (valor COPAS XL: 50) y el &quot;tiempo de vuelo&quot; (TOF) como mínimo a 320 microsegundos (valor COPAS XL: 800) con el fin de reducir la influencia de los escombros. </li><li> Para el análisis sin clasificar los embriones vaya al paso 5.4, para el análisis y la clasificación de los embriones en una placa de Petri vaya al paso 5.5 o para el análisis y la clasificación de los embriones en una placa de 96 pocillos vaya al paso 5.6. </li><li> Colocar los embriones en la copa de muestra y haga clic en &quot;Inicio&quot; para iniciar el análisis. Cuando se analizan los embriones detener el análisis, haga clic en &#39;stop&#39;. Guarde los datos haciendo clic en &quot;tienda de todo &#39;. Nota: Todos los datos se almacenan como TXT, LMD, DAT, archivos CSV y MRSE. Siga el protocolo en el paso 5.7. </li><li> Colocar los embriones en el recipiente para muestras y definir el máximo de 70 embriones por placa para ser resuelto mediante la introducción de 70 en el menú &quot;Ordenar&quot;. Coloque un plato vacío Petri bajo el clasificador y haga clic en &#39;Ordenar Manual&#39;. Cuando el di Petri<html> sh está lleno, guardar los datos haciendo clic en &quot;Tienda de todos&quot;. Nota: Todos los datos se almacenan como TXT, LMD, DAT, archivos CSV y MRSE. Siga el protocolo en el paso 5.7. </li><li> Colocar los embriones en el recipiente para muestras y definir el máximo de 1 embrión por pocillo para ser resuelto mediante la introducción de 1 en el menú &quot;Ordenar&quot;. Coloque una placa de 96 pocillos vacíos en el soporte de la placa de la izquierda y haz clic en &quot;Fill placa &#39;. Cuando se llena la placa de 96 pocillos, guardar los datos haciendo clic en &quot;tienda de todo &#39;. Nota: Todos los datos se almacenan como TXT, LMD, DAT, archivos CSV y MRSE. Siga el protocolo en el paso 5.7. </li><li> Obtener el archivo TXT para procesar los datos en bruto, utilice los siguientes ajustes de filtro de datos: &#39;seleccione Estado&#39;: 40, y si se utiliza el módulo de clase &#39;Estado sort&#39;:. 6 A continuación, utilice los números de la señal de fluorescencia total de la &#39;Red &#39;canal para calcular la media y el error estándar de la media. Trazar estos conjuntos de datos en la barra o de dispersión gráficos. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. Tratamiento de Drogas <ol><li> Analizar e inyección especie a los 3 días post (dpi), M. marinum infectado embriones en dos grupos iguales utilizando la partícula grande citómetro de flujo (paso 5.5). Tratar a un grupo con un compuesto de interés en su vehículo disolvente y otro con disolvente portador solo (control). Aplicar tratamientos similares para burlarse de control inyectado a la prueba de los efectos secundarios de los antibióticos. </li><li> Repetir a las 4 y 5 dpi análisis (paso 5.5) y refrescar el agua de huevo o agua de huevo que contiene el compuesto. </li></ol> 7. Imágenes de alta resolución <ol><li> Anestesie los embriones con 0,02% (w / v) tamponada éster etílico del ácido 3-aminobenzoico (tricaína) en agua de huevo 10 min antes del análisis. </li><li> Prepare el sistema de tecnología de tramado de Vertebrados automatizado y el sampler de partículas Large acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Seleccione las imágenes de referencia correspondientes a la edad de los embriones del &#39;Imaging - Objeto211; Menú Configuración de detección ». </li><li> Seleccione la cantidad de imágenes y orientación a realizar por el sistema de tecnología de tramado de Vertebrados Automatizado del &#39;Imaging - Almacenamiento automático de imágenes &quot;del menú. </li><li> Coloque una placa de 96 pocillos llenos de embriones (desde el paso 5.6) en el soporte de la placa izquierda de la partícula grande Sampler, y haga clic en &quot;Ejecutar placa &#39;. </li><li> Cuando se detecta un embrión y correctamente posicionado; la imagen de la cabeza y la cola por separado con el CLSM utilizando un objetivo de llanura seca 10X y unir las imágenes después utilizando el software de procesamiento de imágenes. </li></ol>

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</ol>

JS es propietario de Life Science BV Métodos que produce instrumentos utilizados en este artículo.

La metodología de alto rendimiento se describe en este documento se proporciona una tubería rápida y rentable para la detección de alto número de embriones y larvas de peces con diferentes tipos de infecciones. El uso de la gran criadero flotante en lugar de tanques de cría individuales o familiares tradicionales facilitó el control del proceso de desove y la generación de mayor número de huevos síncronos. Con una versión mejorada del sistema de micro-inyección automatizada 7, es posible inyectar hasta 2.500 huevos casi todos en la misma etapa de célula dentro de 1 h. Con estas actualizaciones y software mejorado que es factible inyectar más huevos que previamente era posible que se pueden utilizar para llevar a cabo grandes pantallas de drogas con la proliferación bacteriana como leer. Sin embargo este método es todavía limitada a la yema de la inyección, otras vías de inyección, por ejemplo, descritos por Benard et al. (2012) 6, esperemos que se incorporarán en el sistema de micro-inyección automatizada en el futuro cercano. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Aunque estos métodos son comparados para el cribado de pez cebra, que sería útil para aplicaciones con otras especies de peces también. Por ejemplo, la carpa común se ha indicado que tienen ventajas para el análisis de drogas. Al igual que el pez cebra, huevos y embriones en fase inicial de la carpa común son transparentes pero con la principal ventaja de su gran tamaño desove de cientos de miles de huevos y la disponibilidad de líneas puras que ofrecen una base genética más constante 16. El análisis de grandes cantidades de embriones infectados se realiza con el alto rendimiento de gran flujo de partículas citómetro. Este dispositivo especie puede analizado embriones en placas de pocillos múltiples o una placa de Petri por lo que es especialmente adecuado para probar un gran número de compuestos. Si se necesita una resolución de imágenes superior, que la configuración se adapta de una manera que el gran flujo de partículas citómetro de la tecnología se puede utilizar para la selección previa y posteriormente analizar las muestras en un medio a travésponer en una resolución más alta. Esto se puede hacer utilizando la tecnología de tramado de Vertebrados automatizado 17, 18. Este dispositivo puede recopilar automáticamente embriones vivos o fijas entre 2 y 7 días después de la fecundación de una placa de múltiples pozo o recipiente a granel, la imagen 360 ° a través de un capilar mediante CLSM o microscopia estéreo y disponer de nuevo en 2 contenedores a granel que permite la selección manual de los embriones basada en las imágenes microscópicas. Futuras mejoras permitirán la clasificación del embrión después de la formación de imágenes en la placa de pocillos múltiples, por lo tanto, por lo que es posible seleccionar automáticamente gran número de embriones individuales en el tiempo con CLSM. Suponiendo que en futuras aplicaciones del sistema de tecnología de tramado vertebrado automatizados también se puede conectar a la gran flujo de partículas citómetro de la tecnología sin la necesidad de larvas de dispensación antes en placas de pocillos múltiples, dará lugar a una clasificación más avanzada. En este trabajo se describe la creación de und optimización de una instalación de alto rendimiento para estudiar S. epidermidis y M. infección marinum como un modelo para el descubrimiento de fármacos. Esto demuestra que el resultado de estas bacterias inyectadas en la yema depende de la etapa de desarrollo de los huevos en el momento de la inyección. La inyección de M. marinum E11 en la etapa de células 16-128 o de la cepa M en la etapa de células 16-64 conduce al mismo patrón de infección como inyección en la vena caudal 2, 6. Sin embargo, esta configuración no se limita a la proliferación de sólo patógenos bacterianos. Se ha demostrado antes que es posible inyectar robóticamente soluciones que contienen ADN, ARN o morfolinos para la transgénesis, la sobre expresión y el gen knock-down estudios, respectivamente 13. Además, se demostró que esta configuración también es útil para el estudio de la proliferación de células cancerosas y la migración. Por lo tanto esta tubería presenta un método versátil para pantallas de alto rendimiento de una variedad de mecanismos de señalización en el contextode la inmunidad innata, aplicada a las enfermedades infecciosas y el desarrollo de cáncer. Estas pantallas se pueden combinar con otros para el descubrimiento de la medicina, sino también con el análisis de los posibles efectos tóxicos de los fármacos aplicables identificados.

Hasta la fecha, el pez cebra (Danio rerio) se ha establecido con éxito como un modelo eficiente para estudiar una variedad de enfermedades infecciosas 1. El embrión de pez cebra ofrece único en posibilidades de formación de imágenes in vivo debido a su transparencia y el gran número de líneas transgénicas reportero existentes que expresan proteínas fluorescentes. Esta poderosa combinación hace posible el seguimiento de diferentes tipos de células inmunes en el tiempo, mientras que la interacción con patógenos tales como Mycobacterium marinum, el pariente más cercano de M. tuberculosis 2, o Staphylococcus epidermidis, el causante principal del biomaterial infección asociada 3-5. Diferentes rutas de infección se pueden utilizar en embriones de pez cebra en función de los propósitos del estudio 6. Una de estas vías de infección es la inyección de yema de las bacterias. La principal ventaja de este método en comparación con los otros es que infecti yemaen se puede realizar de forma automática a través de la inyección robótico, reduciendo significativamente el tiempo de inyección y lo que permite una alta reproducibilidad de la infección 7, 8. El trabajo previo, usando el pez cebra como un alto rendimiento del sistema modelo in vivo para el estudio de S. en epidermidis y M. infección marinum demostró ser acertado 7, 8. Este sistema es capaz de detectar la progresión de la enfermedad a través de la inyección de yema de robótica de embriones tempranos y el uso de la fluorescencia de lectura como una medida para la carga bacteriana. De acuerdo con esta noción, esta configuración ha sido optimizado y establecido una tubería de alto rendimiento altamente eficiente con el potencial de generar un gran número de embriones infectados de forma homogénea y realizar un seguimiento de la progresión de la infección durante el tiempo después del tratamiento con un número de compuestos. Con la configuración establecida es posible generar hasta 8.000 embriones sincrónicos a la pantallapara la progresión de la enfermedad, el procesamiento de esta manera hasta 2.500 embriones por hora. Los embriones se clasifican en función de su carga bacteriana mediante un sistema automatizado, asegurando grupos homogéneos de larvas infectadas. Además, para validar la configuración, efectos de referencia conocidos para prevenir la progresión de la tuberculosis en mamíferos se han probado en embriones infectados con M. cepa marinum E11 o la cepa más virulenta M 9. Este estudio describe en detalle la tubería de alto rendimiento que se ha establecido para ser capaz de generar un gran número de embriones infectados y el posterior análisis de la progresión bacteriana durante el desarrollo y después de tratamiento con compuesto.

<table><tbody><tr><td>Agar Middlebrook 7H10</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Middlebrook 7H9</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>BBL Enriquecimiento de albúmina dextrosa catalasa (OADC) de ácido oleico Middlebrook</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU</td>. <td>211886</td><td></td></tr><tr><td>BBL Enriquecimiento de albúmina dextrosa catalasa (ADC) de Middlebrook</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>agar LB</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EE. UU</td>. <td>L5542</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Caldo LB</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EE. UU.</td><td>L3022</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Bio-connect, Huissen, Países Bajos</td><td>16785.03</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Higromicina</td><td>Bio-connect, Huissen, Países Bajos</td><td>25966.01</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td><td>P1754</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona40</td><td>Calbiochem, San Diego, California, EE.UU.</td><td>529504</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Sal de 3-aminobenzoato de metanosulfonato de etilo (Tricaína)</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EE. UU</td>. <td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sphaero-Q, Gorinchem, Países Bajos</td><td>S103</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Sal marina oceánica instantánea</td><td>Sera Marin, Heinsberg, Alemania</td><td>5460</td><td></td></tr><tr><td>iSPAWN</td><td>Techniplast, Buguggiate, Italia</td><td>iSPAWN</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microinyección automatizado</td><td>Life Science Methods BV, Leiden, Países Bajos</td><td>Sistema</td><td></td></tr> <tr><td>de microinyección automatizadoAnalizador y clasificador de partículas de objetos complejos XL (COPAS XL)Union</td> <td>BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, EE. UU</td>. <td>COPAS XL</td><td></td></tr><tr><td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td><td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, EE. UU.</td><td>VAST BioImager</td><td></td></tr><tr><td>LP Sampler</td><td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, EE. UU</td>. <td>LP Sampler</td><td></td></tr><tr><td>Escaneo láser confocal microscopio</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de inyección 10 &micro; m diámetro interior</td><td>Qvotek, Mississauga, Canadá</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento y optimización de una instalación de alto rendimiento para el estudio<em&gt; staphylococcus epidermidis</em&gt; y<em&gt; mycobacterium marinum</em&gt; la infección como modelo para el descubrimiento de fármacos

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

El pez cebra se están convirtiendo en una herramienta valiosa en la fase preclínica de exámenes de detección de drogas como un modelo animal entero con alto rendimiento posibilidades de detección. Ellos se pueden utilizar para cerrar la brecha entre ensayos basados ​​en células en las etapas anteriores y en la validación in vivo en modelos de mamíferos, reduciendo, de esta manera, el número de compuestos que pasan a través de la prueba en los modelos mucho más caros de roedores. En este sentido, en el presente manuscrito se describe una nueva tubería de alto rendimiento utilizando el pez cebra como sistema modelo in vivo para el estudio de Staphylococcus epidermidis y la infección por Mycobacterium marinum. Esta configuración permite la generación y el análisis de gran número de embriones síncronos infectados de forma homogénea. Además, la flexibilidad de la tubería permite al usuario implementar fácilmente otras plataformas para mejorar la resolución del análisis cuando sea necesario. La combinación de la pez cebra junto con innovadora alta TE rendimientochnologies abre el campo de pruebas de drogas y el descubrimiento de nuevas posibilidades no sólo debido a la fuerza de la utilización de un modelo de animal completo, pero también a causa de la gran cantidad de líneas transgénicas disponibles que se pueden utilizar para descifrar el modo de acción de nuevos compuestos.

Los presentes resultados muestran que la tubería de alto rendimiento para estudiar S. epidermidis y M. infección marinum se ha establecido con éxito y que puede ser extendido a otros modelos de la infección. En primer lugar, el uso de la vasija grande de cría (Figura 1A), basado en el sistema publicado por Adatto et al. (2011) 11, permite generar un gran número de huevos síncronos en eventos individuales que ofrezcan un alto control del proceso de desove. Siguiente a ser capaz de inyectar gran número de embriones en un corto período de tiempo, se utilizó una versión mejorada del sistema de micro-inyección automatizado desarrollado previamente 7 (Figura 1A). Para evaluar cual es la mejor etapa de desarrollo para la infección yema de huevo, inyecciones con S. epidermidis y M. marinum se realizaron en todas las diferentes etapas entre células etapa 1 y 512, de acuerdo con la descripción hecha por Kimmel et al. (1995) 12 </sup&gt;. Las inyecciones con 100 ufc de S. epidermidis entre la etapa 16 y 128 células proporcionado el mejor patrón de la infección (Figura 2). Las bacterias proliferan dentro de la yema durante 3 días y se propagan en el cuerpo a partir de 3 dpi en adelante. Realizar inyecciones antes de la etapa 16 de células condujo a una alta mortalidad de 4 dpi, y la inyección después de la etapa de célula 256 mostró un crecimiento principalmente bacteriana dentro de la yema sin apenas difusión de bacterias dentro del cuerpo del embrión. La cuantificación de la carga bacteriana se realizó por análisis de la intensidad de fluorescencia usando la partícula grande citómetro de flujo como se describe por Veneman, et al. (2013) 8 (Figura 3). Las observaciones mostraron que la etapa de desarrollo óptimo para la inyección de 30 ufc M. inyección marinum es de entre 16 a 128 células etapa para la cepa E11 (Figura 4A) y entre la etapa de células 16-64 con el strai M más virulentaN (Figura 4B). Los embriones inyectados en estas etapas mostraron crecimiento bacteriano dentro de la yema y la propagación de las bacterias a través del embrión (Figura 7). La infección con ambas cepas en las primeras etapas presentó crecimiento bacteriano generalizado inespecífico llevando a los embriones a morir después de 4 dpi. Por otro lado, en embriones inyectados en etapas posteriores carga bacteriana se restringió a la yema. A continuación, la clasificación previa con partículas grandes citómetro de flujo (Figura 1B) genera grandes grupos homogéneos de peces infectados con exclusión de los embriones no-o altamente infectadas (Figuras 5A y 6A). Después de la clasificación previa, M. embriones infectados marinum fueron tratados con rifampicina, un fármaco de primera línea contra la tuberculosis. Estudios previos demostraron que el tratamiento con rifampicina a una dosis de 200 M reduce de manera eficiente M. infección marinum en el pez cebra 7, 13. Tomando advantage de la gran número de embriones homogéneamente infectadas generadas con el alto rendimiento de configuración, el tratamiento con diferentes dosis se realizó. Los embriones infectados con M. marinum cepa M y se trató durante 48 h con 12, 24, y 200 mM rifampicina mostraron para reducir la infección micobacteriana de manera eficiente en una manera dependiente de la dosis (Figura 5B). En vista de la reducción eficaz de la infección usando Rifampicina a una dosis de 200 mM esta concentración se utilizó para los experimentos futuros. En línea con el resultado anterior, el estudio de la progresión de la carga bacteriana mediante M. cepa marinum E11 se observó una significativa reducción de las 24 horas en adelante después del tratamiento con rifampicina 200 mM (Figura 6B). Además, si se requiere imágenes de gran aumento de estos embriones, que se puede mostrar de forma automática en placas de 96 pocillos (Figura 1C), desde donde las muestras se pueden analizar utilizandoel sistema de tecnología de tramado de Vertebrados automatizado con el grande de partículas Sampler montado sobre un CLSM. El sistema de tecnología de tramado de Vertebrados automatizado con el sampler de partículas Large es un sistema que puede montarse sobre una CLSM o un microscopio estéreo. Este dispositivo permite la carga de embriones vivos o fijos a partir de una placa de 96 pocillos o recipiente a granel de forma automática a través de un capilar de vidrio, y se orienta en frente de la cámara en el ángulo deseado (por ejemplo, dorsal o lateral). Las imágenes del embrión en todas las orientaciones se pueden hacer con la cámara de a bordo o con un CLSM externa (Figura 7). Los embriones serán posteriormente transferidos en el recipiente de recogida o de residuos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> Figura 1. Outl experimental Mainstreamine. A) Los peces adultos se juntan para aparearse, los huevos se recogen, alineados en una placa de agarosa y se inyecta. B) los óvulos inyectados se incuban a 28 ° C y serán pre-ordenados para su posible tratamiento farmacológico. C) El análisis posterior por el gran partículas citómetro de flujo y / o partículas grandes Sampler / Vertebrados Automatizado tecnología de tramado con CLSM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> Figura 2. Establecimiento de mejor etapa celular para S. epidermidis yema de inyección. embriones de pez cebra fueron inyectados en la yema en distintas etapas de desarrollo 1-512 fase celular con 100 ufc de S. epidermidis. Los embriones inyectados entre 1 unaetapa de célula ND 8 mostró el crecimiento bacteriano en la yema y la alta mortalidad de 4 dpi. Los embriones inyectados entre la etapa celular 16 y 128 mostraron crecimiento bacteriano en la yema y el interior del cuerpo a partir de 3 dpi. Los embriones inyectados entre la etapa 256 y 512 células mostraron muchos crecimiento bacteriano dentro de la yema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> Figura 3. Cuantificación de la carga bacteriana mediante flujo de partículas grandes citómetro. 100 ufc de S. epidermidis se inyecta en la yema de embriones de pez cebra. a) hasta el 5 dpi, cada día, grupos de 10 embriones fueron homogeneizados y se sembraron directamente, que muestra el promedio de crecimiento exponencial basado en dos réplicas biológica (barras de error= SEM). B) Ampliación de flujo de partículas citómetro de análisis muestra la media de la señal de fluorescencia de no inyectada y S. epidermidis inyecta embriones. Se analizaron 30 a 160 embriones por condición (barras de error = SEM), letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas por ANOVA de una vía seguida por el test de Tukey post-hoc (P &lt;0,001), ns:. No diferencias significativas C) Correlación entre UFC y media de la señal de fluorescencia de los grupos de 10 S. epidermidis infectado embriones (barras de error = SEM). Esta cifra ha sido modificado desde Veneman et al. (2013) 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> Figura 4. EstablisADJUNTO de la mejor etapa de célula de M. marinum yema de inyección. embriones de pez cebra fueron inyectados en todas las diferentes etapas de desarrollo 1-512 fase móvil con 30 ufc de M. marinum E11 y la tensión M. A, B) a partir de embriones inyectados etapa de célula 1-8 mostró similares difusión y la mortalidad con ambas cepas. A) embriones inyectados entre la etapa de células 16-128 con la cepa E11 mostró la formación de granulomas y la infección sistémica, mientras que aquellos inyectados 256-512 células etapa mantuvo la carga bacteriana en la yema. B) Los embriones inyectados entre la etapa de células 16-64 con la cepa M mostraron formación de granuloma como las estructuras y la infección sistémica, mientras que los inyectados de 128 a 512 células etapa mantiene la carga bacteriana en la yema . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 5" fo: Content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; /&gt; Figura 5. Tratamiento de M. infección aguda marinum con una primera línea de medicamentos contra la tuberculosis. Los embriones inyectados entre la etapa de células 16-64 con 30 cfu de M. cepa M marinum se realizaron a través de la partícula grande citómetro de flujo a 3 dpi ser clasificados en dos grupos después de descartar las que no y / o embriones altamente infectados. A) de fluorescencia de embriones individuales en ambos grupos. B) Los embriones tratados con rifampicina (RIF ) durante 48 horas a dosis de 12, 24, y 200 mM se analizaron a 4 ppp; su carga bacteriana se reduce significativamente. C) COPAS perfiles representativos de los embriones tratados con DMSO y rifampicina a dosis de 12, 24, y 200 mM durante 24 horas. Carga y distribución bacteriana está indicado por los picos rojos. La línea azul representa el perfil del elemento ordenados (4 dpf pez cebra embryo) por las COPAS. Se analizaron 60-90 embriones por condición. Cada punto de datos representa un embrión individual. Los valores se indican como media ± SEM. ns: diferencias no significativas. Análisis de la significación estadística de las diferencias se realizó mediante ANOVA de una vía seguida por el test post hoc de Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> Figura 6. Tratamiento de M. marinum infección crónica con un fármaco de primera línea contra la tuberculosis. Los embriones inyectados entre la etapa de células 16-64 con 30 cfu de M. cepa marinum E11 se ejecuta a través del flujo de partículas grandes citómetro a 3 dpi ser clasificados en dos grupos después de descartar las que no y / o embriones altamente infectados.<html> A) Fluorescencia de embriones individuales en ambos grupos. B) se analizaron los embriones tratados con rifampicina (RIF) en 200 mM durante 4 días mostrando una reducción significativa de la carga bacteriana después de 1 día de tratamiento. Se analizaron 90 embriones por condición. Los valores se indican como media ± SEM. Letras diferentes indican diferencias significativas entre los puntos de tiempo del mismo tratamiento. * Indica diferencias significativas con el grupo control. ns: diferencias no significativas. El análisis de significación estadística de las diferencias se realizó por ANOVA de una vía seguido por la prueba post hoc de Tukey. (P &lt;0,05). Figura B) ha sido modificado desde Spaink et al. (2013) 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> hres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Resultado de la M. inyección yema marinum E11 fotografiada usando Vertebrados automatizada tecnología de tramado y CLSM. pila Z Confocal (cosido 3 imágenes) de un 5 dpi fli1-egfp 14 embriones. A) embrión vivo que muestra proliferación de M. bacterias marinum E11 (rojo) en todo el cuerpo. B) fija 5 dpi fli-egfp embrión mostrando M. bacterias marinum E11 (rojo) en todo el cuerpo co-localizar con leucocitos (azul claro) detectada por L-plastina inmunotinción 15.

Este artículo describe la tubería de vídeo de alto rendimiento que se ha establecido con éxito para infectar y analizar un gran número de embriones de pez cebra que proporcionan una nueva herramienta potente para las pruebas de compuesto y el descubrimiento de fármacos usando todo un organismo animal vertebrado.

Establecimiento y Optimización de una instalación de alto rendimiento para el Estudio<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Y<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; La infección como modelo para el descubrimiento de fármacos

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

El objetivo general de este procedimiento es generar un gran número de embriones de pez cebra infectados para realizar pruebas de compuestos de alto rendimiento que permitan el descubrimiento de fármacos. Esto se logra primero utilizando un recipiente de cría de gran tamaño para obtener un gran número de huevos de pez cebra sincrónicos en un solo evento. A continuación, los huevos se alinean en una cuadrícula aros e infectan con bacterias en la yema mediante un microinyector automatizado.Cuando la infección se ha diseminado a través de los embriones, estos se preordenan mediante citometría de flujo de partículas grandes antes de ser tratados con fármacos. Finalmente, se analizan los niveles de carga bacteriana en embriones infectados tras el tratamiento con el compuesto. En última instancia, un análisis de alta resolución mediante microscopía confocal de la vértebra.El cribado automatizado y el muestreo de partículas grandes se utilizan para mostrar con mayor detalle los efectos que tienen los compuestos sobre la infección. La principal ventaja de este método frente a técnicas existentes como inyecciones manuales o análisis con escáner PIX, es que con él podemos generar una gran cantidad de embriones afectados de manera homogénea, que podemos analizar de forma de alto rendimiento. Para preparar el inóculo de S epiderm, aísle varias colonias individuales de una placa de la cepa S epiderm O 47 que contiene el vector de expresión M cherry derivado de A PW VW 180 9, e inocule.25 mililitros de LB suplementado con 10 microgramos por mililitro de cloranfenicol, incubar durante la noche a 37 grados Celsius hasta la fase de crecimiento medio logarítmico al día siguiente, centrifugar un mililitro de la cultura a 12.000 ×g durante un minuto y usar un mililitro de PBS estéril con 0,3% volumen por volumen de entre 80 para lavar el sedimento tres veces. Medir la densidad óptica a OD 600 y usar 2% peso por volumen de polivinil pirrolidona 40 o PVP 40 en PBS para diluir la suspensión bacteriana hasta un OD 600 igual a 0,3 o una vez 10 a la ocho UFC por mililitro.Para preparar el inóculo de aminum, aísle varias colonias individuales de la cepa M Meum M o E 11 que expresan establemente el vector PS MT 3M cherry de un Middlebrook siete H 10, airee e inocule 10 mililitros de caldo Middlebrook siete H nueve que contenga 10% volumen por volumen. Suplemente con enriquecimiento Middlebrook A DC y 50 microgramos por mililitro de higromicina, incube durante la noche a 28 grados Celsius. Al día siguiente, centrifugue un mililitro de la cultura a 12.000 ×g durante un minuto y use un mililitro de PBS estéril con 0,3% volumen por volumen entre 80 y lave el sedimento tres veces.Mida la DO a 600 nm de la suspensión bacteriana al 2% peso por volumen. Diluya PVP 40 en PBS hasta una DO a 600 nm de 0,3 o 0,3 veces 10 a la ocho UFC por mililitro para obtener los huevos de pez cebra. La noche antes de la recolección, coloque un máximo de 50 hembras de pez cebra en la cámara inferior de un recipiente de apareamiento grande y 70 machos en la parte superior del recipiente. A la mañana siguiente, retire el separador del recipiente. Después de aproximadamente una hora, recolecte los huevos a través del recolector de huevos en la base del recipiente de apareamiento, colocándolos en un tubo de 50 mililitros lleno con agua para huevos.Después de preparar las placas para inyección, según el protocolo descrito en el software operativo del microinyector automatizado, haga clic en calibrar la platina, luego haga clic en la cuadrícula de 10 24 pocillos y coloque la placa aros en el microinyector; calibre la placa haciendo clic en la pantalla sobre la posición central del pocillo. A continuación, vaya al menú de la aguja y haga clic en calibrar el portaagujas.Utilizando una punta de microcargador, llene una aguja de inyección de 10 micrones de diámetro con 10 microlitros de PVP 40 que contenga 100 UFC por nanolitro de S epiderm, 30 UFC por nanolitro de erum o solo PVP 40 para inyecciones simuladas. Coloque la aguja en el microinyector automático y calibre la posición XY bajando o moviendo la aguja hacia arriba y haciendo clic en la pantalla en la posición de la aguja. Luego, calibre la posición Z de la aguja haciendo clic en la pantalla en la posición de la punta de la aguja. A continuación, utilice una pipeta de transferencia de plástico para distribuir los huevos sobre la rejilla aros y elimine cualquier agua excesiva de los huevos.Luego, coloque la rejilla de agros llena de huevos en el microinyector automatizado, en el menú de inyección. Ajuste la presión de inyección a 200 hectopascales, el tiempo de inyección a 0,2 segundos y la presión de compensación a 15 hectopascales, lo que equivale a un nanolitro en el menú de configuración del Femto jet. Haga clic en inyectar todo e inyecte toda la placa de embriones. Recolecte los huevos lavándolos en una placa de Petri e incúbelos a 28 grados Celsius.Una vez configurado el citómetro de flujo para partículas grandes, acceda al menú de PMT y ajuste el canal rojo a 650 voltios y los canales verde y amarillo a cero voltios. Luego, dentro del menú de umbrales, establezca la señal de umbral de densidad óptica en 50, lo que corresponde a 975 milivoltios, y el tiempo mínimo de vuelo en 800, lo que equivale a 320 microsegundos. Con el fin de reducir la influencia de los residuos, coloque los embriones en la copa de muestra y, en el menú de clasificación, seleccione un máximo de 70 embriones por placa para ser clasificados ingresando 70.Coloque una placa de Petri vacía debajo del clasificador y haga clic en clasificación manual. Cuando la placa de Petri esté llena, guarde los datos haciendo clic en almacenar. Si se requiere análisis de alta resolución o imágenes, los embriones pueden clasificarse individualmente en los pocillos de una placa de 96 pocillos.Coloque los embriones en la copa de muestra y defina un máximo de un embrión por pocillo para ser clasificado. Luego, coloque una placa de 96 pocillos vacía en el soporte izquierdo para placas y haga clic en llenar placa. Cuando la placa esté llena, guarde los datos haciendo clic en almacenar para analizar embriones tratados con fármaco a los tres días posteriores a la inyección con erum.Trate un grupo de embriones con un compuesto de interés en disolvente y un segundo grupo con disolvente únicamente. Coloque los embriones tratados a cuatro y cinco días post fertilización en la cubeta de muestra del citómetro de flujo y configure la clasificación para 70 embriones por placa tras anestesiar los embriones en trica, y configurar el sistema automatizado de cribado de vertebrados y la sonda de partículas grandes. Según el protocolo de texto del menú de configuración de detección de objetos en imágenes, seleccione las imágenes de referencia correspondientes a la edad de los embriones en el menú de imágenes almacenadas automáticamente por el sistema de imágenes, seleccione el número de imágenes que se crearán y la orientación que se utilizará.Coloque una placa de 96 pocillos llena de embriones en el soporte izquierdo de placas del muestreador de partículas grandes y haga clic en ejecutar placa. Cuando un embrión esté correctamente posicionado, utilice un objetivo seco sencillo de 10 x e imagine por separado la cabeza y la cola. Luego, use un software de procesamiento de imágenes para unir las imágenes y evaluar en qué estadio de desarrollo es mejor la infección del vitelo.Se realizaron inyecciones con dermitis y un marum en todas las etapas diferentes entre el estadio de una célula y el de 512 células. Como se observa aquí, las inyecciones con 100 UFC de dermitis realizadas entre el estadio de 16 y 128 células proporcionaron el mejor patrón de infección. Las bacterias se proliferaron dentro del vitelo durante tres días y se extendieron al cuerpo a partir de los tres días posteriores a la infección.La cuantificación de alto rendimiento de la carga bacteriana se realizó mediante análisis de la intensidad de fluorescencia utilizando un citómetro de flujo de partículas grandes. Como se muestra aquí, la cantidad de bacterias vivas presentes dentro del embrión corresponde muy bien con la señal fluorescente medida. Esta figura demuestra que la etapa de desarrollo óptima para la inyección de 30 UFC de aminum se encuentra entre la etapa de 16 y 128 células para la cepa E 11 y entre la etapa de 16 y 64 células.Con la cepa EM más virulenta, los embriones inyectados en estas etapas mostraron crecimiento bacteriano dentro del embrión y diseminación de las bacterias a través del mismo. Después del tratamiento previo de embriones infectados con emerina con diferentes concentraciones de rifampicina, se observó una reducción de la infección micobacteriana de manera dependiente de la dosis. El uso del fármaco a una dosis de 200 micromolar demostró que detuvo eficazmente la progresión bacteriana de M mein E 11, 24 horas y posteriores tras el tratamiento, tras su desarrollo.Estas técnicas allanaron el camino para investigadores en el campo de la prueba de compuestos y el desarrollo de fármacos, en busca de nuevos tratamientos para enfermedades infecciosas como la tuberculosis o infecciones asociadas a biomateriales.

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