Establecimiento y Optimización de una instalación de alto rendimiento para el Estudio

El objetivo general de este procedimiento es generar un gran número de embriones de pez cebra infectados para realizar pruebas de compuestos de alto rendimiento que permitan el descubrimiento de fármacos. Esto se logra primero utilizando un recipiente de cría de gran tamaño para obtener un gran número de huevos de pez cebra sincrónicos en un solo evento. A continuación, los huevos se alinean en una cuadrícula aros e infectan con bacterias en la yema mediante un microinyector automatizado.

Cuando la infección se ha diseminado a través de los embriones, estos se preordenan mediante citometría de flujo de partículas grandes antes de ser tratados con fármacos. Finalmente, se analizan los niveles de carga bacteriana en embriones infectados tras el tratamiento con el compuesto. En última instancia, un análisis de alta resolución mediante microscopía confocal de la vértebra.

El cribado automatizado y el muestreo de partículas grandes se utilizan para mostrar con mayor detalle los efectos que tienen los compuestos sobre la infección. La principal ventaja de este método frente a técnicas existentes como inyecciones manuales o análisis con escáner PIX, es que con él podemos generar una gran cantidad de embriones afectados de manera homogénea, que podemos analizar de forma de alto rendimiento. Para preparar el inóculo de S epiderm, aísle varias colonias individuales de una placa de la cepa S epiderm O 47 que contiene el vector de expresión M cherry derivado de A PW VW 180 9, e inocule.

25 mililitros de LB suplementado con 10 microgramos por mililitro de cloranfenicol, incubar durante la noche a 37 grados Celsius hasta la fase de crecimiento medio logarítmico al día siguiente, centrifugar un mililitro de la cultura a 12.000 ×g durante un minuto y usar un mililitro de PBS estéril con 0,3% volumen por volumen de entre 80 para lavar el sedimento tres veces. Medir la densidad óptica a OD 600 y usar 2% peso por volumen de polivinil pirrolidona 40 o PVP 40 en PBS para diluir la suspensión bacteriana hasta un OD 600 igual a 0,3 o una vez 10 a la ocho UFC por mililitro.

Para preparar el inóculo de aminum, aísle varias colonias individuales de la cepa M Meum M o E 11 que expresan establemente el vector PS MT 3M cherry de un Middlebrook siete H 10, airee e inocule 10 mililitros de caldo Middlebrook siete H nueve que contenga 10% volumen por volumen. Suplemente con enriquecimiento Middlebrook A DC y 50 microgramos por mililitro de higromicina, incube durante la noche a 28 grados Celsius. Al día siguiente, centrifugue un mililitro de la cultura a 12.000 ×g durante un minuto y use un mililitro de PBS estéril con 0,3% volumen por volumen entre 80 y lave el sedimento tres veces.

Mida la DO a 600 nm de la suspensión bacteriana al 2% peso por volumen. Diluya PVP 40 en PBS hasta una DO a 600 nm de 0,3 o 0,3 veces 10 a la ocho UFC por mililitro para obtener los huevos de pez cebra. La noche antes de la recolección, coloque un máximo de 50 hembras de pez cebra en la cámara inferior de un recipiente de apareamiento grande y 70 machos en la parte superior del recipiente. A la mañana siguiente, retire el separador del recipiente. Después de aproximadamente una hora, recolecte los huevos a través del recolector de huevos en la base del recipiente de apareamiento, colocándolos en un tubo de 50 mililitros lleno con agua para huevos.

Después de preparar las placas para inyección, según el protocolo descrito en el software operativo del microinyector automatizado, haga clic en calibrar la platina, luego haga clic en la cuadrícula de 10 24 pocillos y coloque la placa aros en el microinyector; calibre la placa haciendo clic en la pantalla sobre la posición central del pocillo. A continuación, vaya al menú de la aguja y haga clic en calibrar el portaagujas.

Utilizando una punta de microcargador, llene una aguja de inyección de 10 micrones de diámetro con 10 microlitros de PVP 40 que contenga 100 UFC por nanolitro de S epiderm, 30 UFC por nanolitro de erum o solo PVP 40 para inyecciones simuladas. Coloque la aguja en el microinyector automático y calibre la posición XY bajando o moviendo la aguja hacia arriba y haciendo clic en la pantalla en la posición de la aguja. Luego, calibre la posición Z de la aguja haciendo clic en la pantalla en la posición de la punta de la aguja. A continuación, utilice una pipeta de transferencia de plástico para distribuir los huevos sobre la rejilla aros y elimine cualquier agua excesiva de los huevos.

Luego, coloque la rejilla de agros llena de huevos en el microinyector automatizado, en el menú de inyección. Ajuste la presión de inyección a 200 hectopascales, el tiempo de inyección a 0,2 segundos y la presión de compensación a 15 hectopascales, lo que equivale a un nanolitro en el menú de configuración del Femto jet. Haga clic en inyectar todo e inyecte toda la placa de embriones. Recolecte los huevos lavándolos en una placa de Petri e incúbelos a 28 grados Celsius.

Una vez configurado el citómetro de flujo para partículas grandes, acceda al menú de PMT y ajuste el canal rojo a 650 voltios y los canales verde y amarillo a cero voltios. Luego, dentro del menú de umbrales, establezca la señal de umbral de densidad óptica en 50, lo que corresponde a 975 milivoltios, y el tiempo mínimo de vuelo en 800, lo que equivale a 320 microsegundos. Con el fin de reducir la influencia de los residuos, coloque los embriones en la copa de muestra y, en el menú de clasificación, seleccione un máximo de 70 embriones por placa para ser clasificados ingresando 70.

Coloque una placa de Petri vacía debajo del clasificador y haga clic en clasificación manual. Cuando la placa de Petri esté llena, guarde los datos haciendo clic en almacenar. Si se requiere análisis de alta resolución o imágenes, los embriones pueden clasificarse individualmente en los pocillos de una placa de 96 pocillos.

Coloque los embriones en la copa de muestra y defina un máximo de un embrión por pocillo para ser clasificado. Luego, coloque una placa de 96 pocillos vacía en el soporte izquierdo para placas y haga clic en llenar placa. Cuando la placa esté llena, guarde los datos haciendo clic en almacenar para analizar embriones tratados con fármaco a los tres días posteriores a la inyección con erum.

Trate un grupo de embriones con un compuesto de interés en disolvente y un segundo grupo con disolvente únicamente. Coloque los embriones tratados a cuatro y cinco días post fertilización en la cubeta de muestra del citómetro de flujo y configure la clasificación para 70 embriones por placa tras anestesiar los embriones en trica, y configurar el sistema automatizado de cribado de vertebrados y la sonda de partículas grandes. Según el protocolo de texto del menú de configuración de detección de objetos en imágenes, seleccione las imágenes de referencia correspondientes a la edad de los embriones en el menú de imágenes almacenadas automáticamente por el sistema de imágenes, seleccione el número de imágenes que se crearán y la orientación que se utilizará.

Coloque una placa de 96 pocillos llena de embriones en el soporte izquierdo de placas del muestreador de partículas grandes y haga clic en ejecutar placa. Cuando un embrión esté correctamente posicionado, utilice un objetivo seco sencillo de 10 x e imagine por separado la cabeza y la cola. Luego, use un software de procesamiento de imágenes para unir las imágenes y evaluar en qué estadio de desarrollo es mejor la infección del vitelo.

Se realizaron inyecciones con dermitis y un marum en todas las etapas diferentes entre el estadio de una célula y el de 512 células. Como se observa aquí, las inyecciones con 100 UFC de dermitis realizadas entre el estadio de 16 y 128 células proporcionaron el mejor patrón de infección. Las bacterias se proliferaron dentro del vitelo durante tres días y se extendieron al cuerpo a partir de los tres días posteriores a la infección.

La cuantificación de alto rendimiento de la carga bacteriana se realizó mediante análisis de la intensidad de fluorescencia utilizando un citómetro de flujo de partículas grandes. Como se muestra aquí, la cantidad de bacterias vivas presentes dentro del embrión corresponde muy bien con la señal fluorescente medida. Esta figura demuestra que la etapa de desarrollo óptima para la inyección de 30 UFC de aminum se encuentra entre la etapa de 16 y 128 células para la cepa E 11 y entre la etapa de 16 y 64 células.

Con la cepa EM más virulenta, los embriones inyectados en estas etapas mostraron crecimiento bacteriano dentro del embrión y diseminación de las bacterias a través del mismo. Después del tratamiento previo de embriones infectados con emerina con diferentes concentraciones de rifampicina, se observó una reducción de la infección micobacteriana de manera dependiente de la dosis. El uso del fármaco a una dosis de 200 micromolar demostró que detuvo eficazmente la progresión bacteriana de M mein E 11, 24 horas y posteriores tras el tratamiento, tras su desarrollo.

Estas técnicas allanaron el camino para investigadores en el campo de la prueba de compuestos y el desarrollo de fármacos, en busca de nuevos tratamientos para enfermedades infecciosas como la tuberculosis o infecciones asociadas a biomateriales.