Establecimiento y Optimización de una instalación de alto rendimiento para el Estudio Staphylococcus epidermidis Y Mycobacterium marinum La infección como modelo para el descubrimiento de fármacos

El objetivo general de este procedimiento es generar un gran número de embriones de pez cebra infectados para pruebas de compuestos de alto rendimiento que permitan el descubrimiento de fármacos. Esto se logra utilizando primero un gran recipiente de cría para obtener un gran número de huevos de pez cebra sincrónicos en un solo evento. A continuación, los huevos se alinean en una rejilla aros y se infectan con bacterias en la yema mediante un microinyector automatizado.

Cuando la infección se ha diseminado a través de los embriones, estos se preclasifican mediante citometría de flujo de partículas grandes antes de ser tratados con fármacos. Finalmente, se analizan los niveles de carga bacteriana en los embriones infectados después del tratamiento compuesto. En definitiva, análisis de alta resolución mediante microscopía confocal de vértebras.

El cribado automatizado y el muestreo de partículas grandes se utilizan para mostrar con más detalle los efectos que los compuestos tienen en la infección. La principal ventaja de este método frente a las técnicas existentes como las inyecciones manuales o el análisis PIX scan, es que con él podemos generar una gran cantidad de embriones afectados homogéneamente, que podemos analizar de forma de alto rendimiento. Para preparar el inóculo de epidermis S, aísle varias colonias individuales de una placa de cepa de epidermis S, O 47 que contenga un vector de expresión de cereza M derivado de A PW VW 180 9, e inocule.

25 mililitros de LB suplementados con 10 microgramos por mililitro. El cloranfenicol incuba durante la noche a 37 grados centígrados hasta la etapa de bloqueo medio al día siguiente, centrifuga un mililitro del cultivo a 12, 000 GS durante un minuto y usa un mililitro de PBS estéril con 0.3% de volumen por volumen entre 80 para lavar el pellet tres veces. Mida la densidad óptica a OD 600 y use 2%peso por volumen, polivinilo perone 40 o PVP 40 en PBS para diluir la suspensión bacteriana a un OD 600 igual a 0.3 o uno por 10 a las ocho UFC por mililitro.

Para preparar el inóculo de aminum, aislar varias colonias individuales de la cepa M Meum M o E 11 que expresen de manera estable el vector de cereza PS MT 3M de un aireado Middlebrook seven H 10 e inocular 10 mililitros de caldo Middlebrook seven H nine que contenga un 10% de volumen por volumen. El enriquecimiento de Middlebrook A DC complementado con 50 microgramos por mililitro de higromicina se incuba durante la noche a 28 grados centígrados al día siguiente. Centrifugar un mililitro del cultivo a 12.000 GS durante un minuto y utilizar un mililitro de PBS estéril con 0,3%volumen por volumen entre 80 para lavar el pellet tres veces.

Mida el OD 600 de la suspensión bacteriana y con 2%peso por volumen. PVP 40 en PBS diluido a un OD 600 de 0,3 o 0,3 veces 10 a las ocho UFC por mililitro para obtener huevos de pez cebra la noche anterior a la recolección, coloque un máximo de 50 hembras de pez cebra en la cámara inferior de un gran recipiente de cría y 70 machos en la parte superior del recipiente. A la mañana siguiente, retire el separador del recipiente Después de aproximadamente una hora a través del colector de huevos en el fondo del recipiente de cría, recoja los huevos en un tubo de 50 mililitros lleno de agua de huevo.

Después de preparar las placas de inyección, de acuerdo con el protocolo de texto en el software operativo automatizado del microinyector, haga clic en calibrar la etapa, luego haga clic en 10 24. Rejilla del pocillo y coloque la placa aros en el micro inyector, calibre la placa haciendo clic en la pantalla en la posición central del pocillo. A continuación, vaya al menú de la aguja y haga clic en calibrar el portaagujas.

Usando una punta de microcargador, llene una aguja de inyección de punta de 10 micras de diámetro con 10 microlitros de PVP 40 que contenga 100 UFC por nanolitro de epidermis S, 30 UFC por nanolitro de erum o PVP 40 solo para inyecciones simuladas, coloque la aguja en el microinyector automatizado y calibre la posición XY bajando o moviendo la aguja hacia arriba y haciendo clic en la pantalla en la posición de la aguja. A continuación, calibre la posición Z de la aguja haciendo clic en la pantalla en la posición de la punta de la aguja. A continuación, utilice una pipeta de transferencia de plástico para distribuir los huevos sobre la rejilla de aros y eliminar el exceso de agua de los huevos.

A continuación, coloque la rejilla de agros llena de huevos en el microinyector automatizado en el menú de inyección, ajuste el ajuste de la presión de inyección a 200 hectáreas pascales, el tiempo de inyección a 0,2 segundos y la presión de compensación a 15 Hector Pascals, que se correlaciona con un nanolitro en el menú de configuración del chorro Femto. Haga clic en inyectar todo e inyecte toda la placa de embriones después de la inyección. Recoge los huevos lavándolos en una placa de Petri e incubalos a 28 grados centígrados.

Una vez que el citómetro de flujo de partículas grandes esté configurado, ingrese al menú PMT y configure el canal rojo a 650 voltios y los canales verde y amarillo a cero voltios. Luego, dentro del menú de umbrales, configure la señal del umbral de densidad óptica en 50, correspondiente a 975 milivoltios y el tiempo mínimo de vuelo a 800, lo que corresponde a 320 microsegundos. Para reducir la influencia de los residuos, coloque los embriones en el vaso de muestra y en el menú de clasificación para encontrar el máximo de 70 embriones por placa que se clasificarán ingresando 70.

Coloque una placa de Petri vacía debajo del clasificador y haga clic en ordenar manualmente. Cuando la placa de Petri esté llena, guarde los datos haciendo clic en almacenar. Si se requiere un análisis o imágenes de alta resolución, los embriones se pueden clasificar individualmente en pocillos de una placa de 96 pocillos.

Coloque los embriones en el recipiente de muestras y defina el máximo de un embrión por pocillo a clasificar. A continuación, coloque una placa vacía de 96 pocillos en el soporte de placa izquierdo y haga clic en la placa de llenado. Cuando la placa esté llena, guarde los datos haciendo clic en almacenar para analizar los embriones tratados con medicamentos a los tres días después de la inyección con suero.

Tratar un grupo de embriones con un compuesto de interés en disolvente y un segundo grupo con disolvente solo. Coloque los embriones tratados a los cuatro y cinco días después de la fertilización en la taza de muestra en el citómetro de flujo y configure la clasificación a 70 embriones por placa después de anestesiar los embriones en trica y configurar el sistema de detección automatizado de vertebrados y el muestreador de partículas grandes. De acuerdo con el protocolo de texto del menú de configuración de detección de objetos de imagen, seleccione las imágenes de referencia correspondientes a la edad de los embriones en el menú de imágenes de la tienda automática de imágenes, seleccione el número de imágenes que se crearán y la orientación que se utilizará.

Coloque una placa de 96 pocillos llena de embriones en el soporte de placa izquierdo del muestreador de partículas grande y haga clic en ejecutar placa. Cuando un embrión esté colocado correctamente, use un objetivo seco de 10 x y tome imágenes de la cabeza y la cola por separado. A continuación, utilice un software de procesamiento de imágenes para unir las imágenes y evaluar qué etapa de desarrollo es la mejor para la infección por yema.

Se realizaron inyecciones con dermitis y un marum en todas las diferentes etapas entre la etapa de una y 512 células. Como se vio aquí, las inyecciones con 100 UFC de dermitis realizadas entre la etapa de 16 y 128 células proporcionaron el mejor patrón de infección. Las bacterias proliferaron dentro de la yema durante tres días y se extendieron por el cuerpo a partir de los tres días posteriores a la infección.

La cuantificación de alto rendimiento de la carga bacteriana se realizó mediante el análisis de intensidad de fluorescencia utilizando el citómetro de flujo de partículas grandes. Como se muestra aquí, la cantidad de bacterias vivas presentes en el interior del embrión se corresponde muy bien con la señal fluorescente medida. Esta figura demuestra que la etapa de desarrollo óptima para la inyección de 30 UFC de aminum es entre la etapa de 16 y 128 células para la cepa E 11 y entre la etapa de 16 y 64 células.

Con la cepa EM más virulenta, los embriones inyectados en estas etapas mostraron crecimiento bacteriano dentro del roble y propagación de las bacterias a través del embrión. Después del tratamiento preclasificado de los embriones infectados con emerina con diferentes concentraciones de rifampicina mostró una reducción de la infección micobacteriana de manera dependiente de la dosis. El uso del fármaco a una dosis de 200 micromolares demostró que detuvo eficazmente la progresión bacteriana de M mein E 11, 24 horas y en adelante después del tratamiento después de su desarrollo.

Estas técnicas allanaron el camino para los investigadores en el campo de las pruebas de compuestos y el desarrollo de fármacos, que buscaban nuevos tratamientos para enfermedades infecciosas como la tuberculosis o las infecciones asociadas a biomateriales.