Adaptación de la tecnología de matriz de microelectrodos para el estudio de la neurotoxicidad inducida por la anestesia en el cerebro intacto cochinillo

El objetivo general de este procedimiento experimental es utilizar una aplicación novedosa de la tecnología de matriz de microelectrodos basada en enzimas para medir los neurotransmisores en lechones neonatos. En este ejemplo, se examina la actividad del glutamato in vivo para estudiar la neurotoxicidad inducida por la anestesia. La principal ventaja de esta técnica es que puede medir in vivo la actividad de los neurotransmisores con una resolución espacial y temporal excepcional en un modelo animal clínicamente relevante de neurotoxicidad inducida por la anestesia.

Aunque este método puede proporcionar información sobre los mecanismos de la neurotoxicidad inducida por la anestesia, también se puede aplicar a otros estados patológicos, como el traumatismo cerebral pediátrico, la epilepsia y el accidente cerebrovascular. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el uso del modelo de lechón requiere experiencia y práctica en su implementación. Además, el uso de matrices de microelectrodos requiere un conjunto de habilidades especializadas.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos quirúrgicos y de colocación de microelectrodos son difíciles de aprender, debido a su naturaleza delicada. Para este experimento, use lechones durante su momento pico de crecimiento cerebral, cuando tienen de tres a cinco días de edad. Permíteles aclimatarse durante al menos 24 horas antes del experimento.

El personal capacitado debe cuidar de los lechones. Se les debe proporcionar acceso improvisado a nutrición, mantas y algunos juguetes para estímulos. Al menos tres horas antes de la anestesia, retire el sustituto de leche de la jaula para asegurarse de que el estómago del lechón esté vacío.

Siga las pautas de ARRIVE para eliminar cualquier posible factor de confusión basado en el sexo. Posteriormente, en un puesto de anestesia equipado con un ventilador pediátrico y dispositivos de monitorización adecuados, intubar y ventilar mecánicamente al lechón. Luego, administre anestesia con sevoflurano a 1 MAC durante 3,5 horas de anestesia.

Ahora, use un pellizco en el dedo del pie para confirmar una profundidad adecuada de anestesia, luego asegure al lechón a un marco estereotáxico específico para lechones que tenga un acolchado adecuado. Coloque los dientes del maxilar sobre la barra dentada. A continuación, fije y apriete las dos barras penetrantes de la oreja con el lechón centrado en la línea media.

Inserte las barras de los oídos con la suficiente firmeza como para escuchar el estallido de las membranas timpánicas. Inicie una dosis de carga de rocuronio y una infusión para evitar movimientos mientras el lechón está asegurado en el marco. Es vital que el lechón se mantenga caliente y que se controlen sus signos vitales.

Use una lámpara de calor y/o una manta para mantener la termia normal. Asegúrate de que la lámpara de calor no esté tan cerca que se queme. Si se desea la supervivencia de los lechones, se deben tomar preparaciones adicionales para mantener estéril el campo quirúrgico.

Ahora, proceda con la implantación de la guía de microelectrodos. Para comenzar, haz una incisión de cuatro a seis centímetros en la línea media a lo largo del cráneo, teniendo cuidado para evitar rayar el cráneo con el bisturí. Una vez hecha la incisión, use una retracción suave y una disección roma para elevar el cuero cabelludo desde el cráneo.

A continuación, frote suavemente el cráneo con una gasa para eliminar cualquier tejido conectivo y exponer las líneas de sutura. A continuación, determine la ubicación prevista para la craneotomía. Si el área de interés permanece oscurecida, refleje aún más el cuero cabelludo.

Ahora, use un taladro quirúrgico para crear una ventana de craneotomía que esté aproximadamente 0,25 centímetros cuadrados por encima de la estructura de interés. Tenga cuidado de no lesionar la duramadre o el cerebro subyacente. Según sea necesario, use herramientas quirúrgicas finas para extirpar la duramadre que recubre el tejido cerebral.

Tenga mucho cuidado para evitar dañar el cerebro. Este experimento utiliza una matriz de microelectrodos basada en enzimas previamente descrita prerrecubierta con glutamato oxidasa y galvanizada con mPD. Las guías de microelectrodos tienen un eje rígido de 40 milímetros, personalizado para su uso con lechones.

Fije el brazo metálico al micromanipulador y, a continuación, coloque la guía de microelectrodos lo más verticalmente posible sobre el bregma. Luego, baje con cuidado la matriz lo más bajo posible sin tocar la superficie del cráneo, anotando las coordenadas de bregma. Ahora use un atlas de cerebro de lechón para determinar las coordenadas estereotáxicas exactas de la estructura de interés, luego reposicione el microelectrodo en consecuencia.

A continuación, coloque el electrodo de pseudorreferencia debajo del cuero cabelludo, asegurando el contacto con el animal. Ahora baje lentamente la matriz de microelectrodos en el cerebro hasta casi la profundidad adecuada. Para los últimos dos milímetros de recorrido, utilice un microaccionamiento hidráulico para bajar suavemente el conjunto a la estructura de interés con un traumatismo tisular mínimo.

Después de colocar la guía de microelectrodos, espere 30 minutos para permitir que los electrodos alcancen la línea de base. Luego, tome medidas durante unas tres horas. Si el lechón va a sobrevivir al experimento, cierre la incisión después de recolectar los datos.

Se tomaron mediciones de glutamato in vivo en tiempo real en el hipocampo de lechones de tres a cuatro días de edad bajo anestesia con sevoflurano, como se describe. Las sesiones de grabación superaron las tres horas. Las mediciones de amperometría se registraron a 4 hercios y se convirtieron en concentración mediante una regresión lineal basada en parámetros de calibración.

Para cada punto de tiempo, las señales de los dos sitios sensibles al glutamato se promediaron antes de restar la señal centinela promediada, para producir una señal de glutamato corregida. La concentración basal media de glutamato fue de aproximadamente 4,6 micromoles, y se mantuvo relativamente estable durante el transcurso de la exposición al anestésico. La actividad glutamatérgica transitoria se identificó mediante el análisis de picos en la señal que no estaban correlacionados con la señal centinela y tenían una relación señal-ruido superior a tres.

Se detectaron un total de 116 picos transitorios durante el período experimental. En general, se observó que la amplitud de los picos transitorios resultantes estaba dentro del rango de 1 micromol. Con el fin de cuantificar la duración de cada transitorio, se obtuvo el tiempo requerido para que cada valor máximo de pico decaiga un 80%, y se encontró que fue de aproximadamente 4 a 5,5 segundos.

Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en cuatro horas, si se realiza de manera metódica y cuidadosa. Al intentar este procedimiento, es importante recordar minimizar cualquier daño tisular no intencional que pueda confundir los datos experimentales. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la medición de otros analitos electroquímicos, para responder preguntas adicionales.