El uso sinérgico de las células precursoras neuronales y Péptidos de autoensamblaje en Experimental cervical Lesión de la Médula Espinal

El objetivo general de este procedimiento es introducir un modelo de clip de compresión por contusión de la LM cervical en ratas, y un protocolo para el tratamiento combinado que involucra inyección de SAP y trasplante de NPC. Primero, se coloca una pinza para aneurisma alrededor de la médula espinal y se mantiene en su lugar durante un minuto. Esto da como resultado una lesión por compresión por contusión bilateral.

A continuación, los SAP se inyectan en el epicentro de la lesión, los NPC se inyectan inmediatamente después de la inyección de SAP. Se inserta una bomba osmótica con un catéter subdural para la administración sostenida de factores de crecimiento. Este procedimiento da como resultado la entrega de NPC a la médula espinal lesionada.

La supervivencia e injerto de las NPCs se apoya en el tratamiento combinado con SAPs y factores de crecimiento. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una terapia para la lesión traumática de la médula espinal porque proporciona un modelo clínicamente relevante que se puede utilizar para estudiar las terapias COMBINATOR basadas en células que promueven la regeneración de la médula espinal. El siguiente protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado Animal de la Red Universitaria de Salud, Toronto, Canadá, y está de acuerdo con las políticas establecidas en la guía para el cuidado y uso de animales de experimentación elaborada por el Consejo Canadiense de Cuidado Animal.

Todos los procedimientos quirúrgicos deben realizarse en condiciones estériles utilizando equipos y soluciones estériles, y de acuerdo con las pautas de la institución y el gobierno, este procedimiento utiliza ratas que pesan de 250 a 270 gramos antes de comenzar el procedimiento. Proporcione a los animales antibióticos en el agua potable durante dos días el día del procedimiento. Después de colocar a la rata en una cámara de anestesia e inducir la anestesia con 5% de flúor ISO en oxígeno uno a uno y óxido nitroso durante un minuto, reduzca el flúor ISO a 1.8 a 2.2%Aplique el ungüento lambic en los ojos y confirme la anestesia quirúrgica realizando un pellizco en la pata.

A continuación, coloca la rata sobre un cojín térmico y fija la cabeza en un marco estereotáxico con un cono nasal. Después de afeitar el pelaje alrededor de la columna cervical, desinfecte la piel con un hisopo con povidona yodado, seguido de etanol al 70% después de hacer una incisión en la línea media desde la región de las vértebras cervicales C dos hasta el proceso prominente del cuerpo vertebral torácico T dos. Use tijeras quirúrgicas para cortar la capa externa de los músculos vertebrales directamente en la línea media en una dirección de mimo craneal, use tijeras quirúrgicas para diseccionar las capas musculares más profundas hasta llegar al proceso, la osis y el laminado.

Inserte los transportadores y sujételos. Abra las capas musculares, luego oriente el proceso posis prominente del cuerpo de las dos vértebras T e identifique los niveles objetivo para la laminectomía. A continuación, utilice un bisturí número 15 para cortar el ligamento y aflojar la lámina y el processis posis.

A continuación, use un cortahuesos para cortar las láminas laterales a la médula espinal y retire suavemente las láminas sin comprimir la médula espinal. Ahora tómese un momento para identificar las raíces nerviosas emergentes para evitar que se corten. A continuación, utilice un gancho para aflojar la duramadre ventral de la cara dorsal de los cuerpos vertebrales y prepare un pasillo para el clip.

Asegúrese de que el resorte anular del clip esté configurado para entregar la fuerza deseada. La fuerza del clip determina el alcance del trauma y la compresión. Inserte el clip abierto alrededor de la médula espinal y deje que se cierre para inducir una lesión por contusión.

A menudo se utilizan fuerzas de corte de entre 15 y 35 gramos con una duración de corte de un minuto después de que se haya realizado la lesión de la médula espinal. Retire el clip y cierre los músculos en dos capas, seguido del cierre de la piel. Una vez que la herida esté bien cerrada, detenga la anestesia y observe a la rata mientras se despierta.

Después de que el animal haya recuperado la conciencia suficiente para estar recostado en eternón, coloque a la rata en una jaula limpia. Debido a la gravedad de este tipo de lesión, es imperativo que se sigan los siguientes tratamientos postoperatorios. En primer lugar, asegúrese de administrar analgésicos como buprenorfina y meloxicam durante tres a cinco días, dependiendo de los síntomas.

También prevenir la deshidratación por vía subcutánea. Inyectar de cinco a 10 mililitros de solución salina dos veces al día durante tres días, y continuar proporcionando antibióticos en el agua potable durante cinco días. Postoperatorio. Apriete la vejiga urinaria dos o tres veces al día hasta que la recuperación constante de la función de la vejiga sea evidente, incluso después de que los animales parezcan recuperados.

Asegúrese de observar a los animales operados para detectar déficits neurológicos y condiciones fisiológicas. La inyección se realiza 14 días después de la lesión de la médula espinal. Antes de comenzar la cirugía, prepare los SAP a una concentración del 1% en peso por volumen en agua estéril y llene un capilar de vidrio de 100 micrómetros conectado a una jeringa Hamilton.

Con la solución, conecte la jeringa Hamilton al marco estereotáxico. Después de la anestesia, la rata coloca la cabeza en el marco estereotáxico y desinfecta el sitio de la cirugía con povidona yodada y alcohol al 70%. Como antes, una vez más, después de abrir la piel, diseccione cuidadosamente el par de músculos vertebrales e inserte retractores.

Use un bisturí número 15 para eliminar el tejido cicatricial de la duramadre y volver a exponer el sitio de la lesión. A continuación, utilice la punta de una aguja afilada para abrir la duramadre con cuidado. Por último, estereotácticamente, insertar el capilar de vidrio a una profundidad de dos milímetros en la médula espinal traumatizada e inyectar las SAP.

Después de inyectar los SAP, deje que el capilar permanezca en el lugar de la inyección durante un minuto antes de retirarlo para permitir que el tejido se estire y acomode la solución inyectada. A continuación, repita la inyección en el siguiente sitio. Aquí, los NPC se aislaron de la zona paraventricular de un ratón rojo DS adulto y se cultivaron de acuerdo con los procedimientos publicados anteriormente.

Justo antes de la microinyección, diluya las NPC en el medio de crecimiento a una concentración de 50 veces 10 por la tercera célula viva por microlitro para el trasplante de células y cárguelas en un capilar de vidrio en una jeringa Hamilton. Los NPC se inyectan inmediatamente después de la inyección de SAP. Para ello, inserte el capilar de vidrio de la jeringa Hamilton a 0,2 milímetros rostral del sitio de la lesión y a 1,5 milímetros por debajo de la superficie dorsal de la médula espinal.

Inyecte dos microlitros de la suspensión celular a una velocidad de aproximadamente 0,5 microlitros por minuto. Una vez completada la primera inyección, deje que el capilar permanezca en la médula espinal durante un minuto como antes, luego retraiga el capilar, muévalo a un sitio adyacente y repita el procedimiento de inyección. Después de esperar un minuto, como antes, retraiga el capilar y muévalo dos milímetros hasta el sitio de la lesión.

Realice dos inyecciones de dos microlitros en este lugar. Esta imagen muestra todos los sitios de inyección en relación con la lesión de la médula espinal. La implantación de minibombas osmóticas subdurales para el soporte del factor de crecimiento se realiza inmediatamente después de las inyecciones de NPC.

En primer lugar, elija un sitio de implantación. Los sitios preferidos son los flancos laterales de la región toracoabdominal para evitar las molestias causadas por la propia bomba. Después de desinfectar la región como antes, se prepara un receso subcutáneo para la bomba.

A continuación, realice una laminectomía de las vértebras superiores o inferiores adyacentes a la lesión de la médula espinal. En este caso, la lesión medular se realizó en C siete T uno, por lo que la laminectomía se realiza en C cinco. Ahora coloque la bomba en el hueco subcutáneo, luego corte el catéter a la longitud necesaria y finalmente use suturas 6.0 para asegurarlo al par de músculos vertebrales.

Evitando cualquier desplazamiento asociado. Use la punta de una aguja afilada para abrir la duramadre debajo de la laminectomía. A continuación, introduzca el catéter en el espacio subdural y deje que se deslice en dirección de mimo sin resistir y sin lesionar el cordón.

Ahora, verifique que el catéter funcione sin problemas y no tenga torceduras ni pliegues como se muestra aquí. A continuación, cierre los músculos capa por capa con suturas o clips, y luego cierre la piel. Una vez que la herida esté bien cerrada, detenga la anestesia y observe al animal mientras despierta.

Después de que el animal haya recuperado la conciencia suficiente para recostarse esternalmente, coloque a la rata en una jaula limpia. Asegúrese de seguir todos los procedimientos de tratamiento postoperatorio, incluido el seguimiento del animal y la analgesia postquirúrgica. Administrar el tratamiento inmunosupresor dos días antes de la inyección de NPC y hasta siete días después del trasplante y hasta el sacrificio, respectivamente.

Esta imagen de microscopía de fluorescencia muestra una sección longitudinal de una médula espinal traumatizada de una rata. La tinción es SAP de fluorescencia DPI marcada con QL six. Los fitos aparecen de color verde y se han agregado en el epicentro de la lesión.

Los NPC rojos positivos DS inyectados se han difundido en las direcciones rostral y mimo indicadas por la fluorescencia roja. La barra de escala representa cinco milímetros. Aquí, una imagen de microscopio electrónico de barrido muestra la formación de andamios de nanofibras de SAP ensamblados.

La barra de escala representa un micrómetro. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de los procedimientos quirúrgicos implicados en la compresión de clips, la LME y cómo se puede estudiar en este modelo el prometedor enfoque del tratamiento combinado con SAP y NPC.