Name: El uso sinérgico de las células precursoras neuronales y Péptidos de autoensamblaje en Experimental cervical Lesión de la Médula Espinal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Aprende un método para tratar lesiones cervicales de la médula espinal en ratas usando péptidos de autoensamblaje y células precursoras neuronales combinados con factores de crecimiento.

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Nos gustaría agradecer el apoyo financiero para este trabajo de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), la Fundación Krembil Familia, el Presidente Halbert en Neural Repair and Regeneration, Phillip y Peggy DeZwirek, y Gordon Yao por la contribución a la figura 2 . Klaus Zweckberger fue financiado por una beca de la &quot;Deutsche Forschungsgesellschaft&quot; (DFG).

NOTA: El siguiente protocolo experimental fue aprobado por el comité de cuidado de los animales de la Red de Salud de la Universidad (Toronto, Canadá) y está de acuerdo con las políticas establecidas en la guía para el cuidado y uso de animales de experimentación preparados por el Consejo Canadiense de cuidado de los animales . 1. Cervical Contusión Aneurisma Clip / Compresión Modelo <ol><li> Antes de instrumentos de autoclave de cirugía y mantener condiciones estériles durante todo el procedimiento surgcial poniendo los instrumentos en un baño de alcohol al 70%. </li><li> Anestesiar ratas Wistar (250-270 g) con una combinación de oxígeno (O 2), óxido nitroso (N 2 O) (1: 1), y 1.8 a 2.2% isoflurano y apoyar la respiración espontánea a través de una máscara de anestesia de gas. Para la inducción de la anestesia comenzar con 5% de isoflurano durante 1 minuto y reducir después. Antes de comenzar la cirugía, la profundidad de control de la anestesia dando un estímulo doloroso (por ejemplo. En las patas). Aplicar pomadas grasasen los ojos para evitar la sequedad y para prevenir las infecciones posteriores. </li><li> Poner las ratas en un cojín de calentamiento (37 ° C) y fijar la cabeza en un marco estereotáctico. </li><li> Afeitarse la región quirúrgica alrededor de la columna vertebral cervical y desinfectar con yodo povidona y 70% de alcohol. </li><li> Hacer una incisión en la línea media por encima de la columna vertebral de la vértebra cervical (C2) que llega hasta el processus prominente del cuerpo vertebral torácica 2 (T2). </li><li> Corte a través de la capa externa de los músculos vertebrales directamente en la línea media (para evitar el sangrado) en una dirección cráneo-caudal y más diseccionar las capas musculares más profundas sin rodeos hasta llegar a la spinosus processus y las láminas. Inserte retractores. </li><li> Orientar la spinosus processus prominente de la T2 cuerpo vértebra para observar los niveles previstos para laminectomía. Después de la identificación y preparación micro-quirúrgica de las láminas seleccionado, cortar a través de la flavae ligamenti para aflojar las láminas y la spinosus processus. Por último, cut a través de las láminas con un lateral de las podadoras de hueso a la médula espinal y eliminar aquellos suavemente, evitando cualquier compresión de la médula espinal en sí. NOTA: Los más comunes son los niveles C5 / 6, C6 / 7, o C7 / T1. La tasa de mortalidad perioperatoria aumenta cuanto más rostral del nivel de la lesión. Sangrado del seno venoso paravertebral es común y puede abordarse mediante la compresión cuidado con esponja. </li><li> Antes de insertar el clip para traumatizar el cable, identificar nuevas raíces nerviosas para librarlos de recorte (especialmente a nivel C5 / 6). </li><li> Con el fin de garantizar el buen inducción clip, aflojar la duramadre ventral de la cara dorsal de los cuerpos vertebrales con un gancho y preparar un corredor para el clip. </li><li> Por último, inserte el clip abierto y dejar que se cierran de golpe (cierre rápido) para lograr una lesión por contusión. Fuerza de cierre del clip y la duración de cierre de clip determinan la intensidad del trauma y el grado de compresión. Comúnmente utilizados son fuerzas de clip de entre 15 a 35 g y un clipping duración de, por ejemplo 1 min. (Figura 1). </li><li> Después de la retirada de la pinza, adaptar músculos de 2 capas y cerrar la herida. </li><li> Deje de anestesia y deja la estela de los animales bajo su observación continua hasta que se recupera la conciencia suficiente para decúbito esternal. Por último, poner la rata en una jaula individual y seguir las pautas de tratamiento post-operatorio. </li><li> Puesto que los animales luchan con la gravedad de este tipo de lesión, debe prestar especial atención a los tratamientos post-operatorios: <ol><li> Administrar analgésicos (buprenorfina y meloxicam durante 3 días y 5 días, respectivamente y según los síntomas clínicos). </li><li> Dé subcutánea solución salina adicional para 3 días (2 veces al día, 5-10 mililitro (ml)). </li><li> Proporcionar antibióticos en el agua de bebida 2 días antes y hasta 7 días después de la cirugía (por ejemplo Moxifloxacina) </li><li> Apriete la vejiga urinaria 2-3 veces al día hasta que la recuperación de la función de la vejiga es constanteLy aparente. </li><li> Observar los déficits neurológicos y estado fisiológico de los animales operados por lo menos una vez al día. </li></ol></li></ol> 2. La inyección de los PAE y NPCs (14 días después de la lesión) <ol><li> Inducir la anestesia como se describe en 1.1. a 1,3, fijar la cabeza de la rata en un marco estereotáxico, retire los puntos de sutura o grapas de la herida, y desinfectar la herida y el área quirúrgica con povidona yodada y el 70% de alcohol. </li><li> Diseccionar cuidadosamente los músculos paravertebrales, inserte retractores, eliminar el tejido cicatrizal microscópicamente de la duramadre, y volver a exponer el sitio de la lesión. </li><li> Preparar los PAE en una concentración de 1% (w / v) para realizar un gel de matriz extracelular. PAE QL6 tienen un pH fisiológicamente compatibles y no necesitan ser tamponada antes de la inyección. Para la visualización de los PAE en la médula espinal, utilizar un derivado fluorescente de QL6 (QL6-FITC). </li><li> Inyectar PAE (5 microlitros (l) en el centro de la lesión, distribuidos en 2 porciones, cada uno2,5 l bilateral de la línea media. Utilice una jeringa Hamilton conectado al marco estereotáctico con un micro capilar de vidrio (100 micrómetros (micras) de diámetro exterior (OD)). Abrir la duramadre cuidadosamente con la punta de una aguja afilada, e insertar el capilar de vidrio estereotácticamente 2 milímetros (mm) en la médula espinal traumatizada. </li><li> Después de la inyección de un tercio del volumen, retire la aguja de 1,5 mm de profundidad, y después de otros 1/3 a 1 mm. Después de la inyección de todo el volumen, y antes de la retirada de la jeringa, esperar 5 minutos para estabilizar la formación de gel. </li><li> Para generar NPCs, utilizar ratones adultos DsRed (o YFP ratones positivos, verde) y aislar y cultivar ellos desde la zona paraventrical 4,18,21. </li><li> Evaluar la viabilidad de NPC por tinción de azul de tripano que indican la presencia de ~ 90% de células vivas en la suspensión celular. Diluir las células en medio de crecimiento (50 x 103 células vivas / l) y luego usarlos para el trasplante de células. </li><li> Haga cuatro 2 l (8 l vo total delume, que contiene 4 x 10 5 NPCs) inyecciones intraespinales bilateralmente a los 2 mm rostral y caudal de la zona de la lesión. Después de la apertura de la duramadre, inserte el micro capilar de vidrio Hamilton 1,5 mm por debajo de la superficie dorsal de la médula espinal e inyectar 2 l de la suspensión celular. Elija una velocidad de inyección a aproximadamente 0,5 l / min (min). </li><li> Al final de cada inyección y antes de la retirada del capilar de la cuerda, espere por lo menos 1 min permitiendo que el tejido se extiende para acomodar el nuevo volumen de la celda. (Figura 2) </li></ol> 3. Implantación de subdural Bombas para el Factor de Crecimiento de aplicaciones <ol><li> Con el fin de enriquecer el fluido espinal cerebral (CSF) con factores de crecimiento apoyar la supervivencia celular, usar bombas de micro-dilución osmótica factores de crecimiento sub-durally largo de 7-14 días, con una tasa de dilución de 0,5 l / h, un diámetro de catéter de 0,04 cm OD, y un volumen de embalse de 100 l. </li><li> Elija factores de crecimiento preferidas(Por ejemplo, el factor de crecimiento derivado del cerebro (BDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)), llenar las bombas 6-10 hr implantación previa, y equilibre las bombas en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Inmediatamente después de las inyecciones de la APN, preparar una cavidad subcutánea para colocar la bomba. Lugares preferidos son los flancos laterales de toracolumbar región abdominal evitando importante malestar local causado por la propia bomba. </li><li> Para obtener la mayor concentración de factores de crecimiento, asegúrese de que la punta abierta del catéter termina cerca del lugar de la lesión. Por lo tanto, realice un salto-laminectomía del nivel superior o inferior adyacente. Por ejemplo, si el SCI es en C7 / T1, realizar una pequeña laminectomía de C5. </li><li> Ponga la bomba en el hueco subcutáneo, acortar el catéter a la longitud necesaria, y seguro que con varias suturas (6.0) en los músculos paravertebrales, evitando cualquier movimiento luxación asociada. </li><li> Después de abrir la duramadre (por ejemplo, en C5) con la punta afiladade una aguja, introducir el catéter en el espacio subdural y dejar que se deslice en una dirección caudal sin ninguna resistencia y sin dañar el cable. La lámina omitido de, por ejemplo C6 sirve punto de fijación y estabilización del catéter adicional. </li><li> Asegúrese de que el catéter se ejecuta sin problemas y no se pliega. </li><li> Cerrar músculos por capa, y la piel, con suturas o grapas. (Figura 3) </li><li> Deje de anestesia y deja la estela de los animales bajo su observación continua hasta que se recupera la conciencia suficiente para decúbito esternal. Por último, volver a ponerlos en una sola jaula y seguir las pautas de tratamiento post-operatorio. </li><li> Proporcionar tratamiento postoperatorio especial, a pesar de que, los animales podrían haber recuperado en parte en este punto del tiempo: <ol><li> Administrar analgésicos (Buprenorthine y meloxicam durante 3 días y 5 días, respectivamente y según los síntomas clínicos). </li><li> Proporcionar antibióticos en las botellas de agua 2 días antes hasta7 días después de la cirugía (por ejemplo Moxifloxacina). </li><li> Siga apretando la vejiga urinaria, si sigue siendo necesaria. </li><li> Déle líquidos subcutáneos adicionales, si las ratas parecen deshidratado. </li><li> Mantenga la observación de la función neurológica y la condición fisiológica de los animales operados al menos una vez al día. </li><li> Administrar tratamiento inmunosupresor 2 días antes de la inyección de la APN y hasta 7 días después transplanation (minociclina) y hasta el sacrificio (Sandimmune), respectivamente. </li></ol></li></ol> Evaluación 4. Tejido <ol><li> Sacrificar los animales en el final del tiempo de observación (por ejemplo. 4 semanas después de SCI) en anestesia profunda (5% de isoflurano durante 2-3 min) y perfundir ellos transcardially con 50 ml de frío (4 ° C) solución salina seguido por 150 ml de frío 4 % de paraformaldehído en 0,1 M de solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Retire la médula espinal y lo puso en el 4% de paraformaldehído en 0,1 M de buffer fosfato salino (PBS) durante 24 horas. </li><li&gt; Poner la médula espinal en solución de sacarosa al 25% para crioprotección durante 48 horas. </li><li> Proporcionar cryosections longitudinales con un espesor &lt;30 micras. </li><li> Para la tinción inmunohistoquímica de todos los celulares de los núcleos que proporcionan un uso del fondo DAPI (1: 1000). NPCs DsRed positivos aparecen rojos, QL-6 FITC aparece en verde, y ambos lo tanto no necesita ser manchado especialmente. (Figura 4). </li><li> Por microscopía electrónica de barrido (SEM) permiten muestras remojo en glutaraldehído a 4 ° C durante 2 horas, se deshidratan lentamente en pasos de 10% de incremento de etanol durante 5 minutos y los colocan en un líquido presurizado CO 2 sifón durante 1 hora. Andamios capa con oro utilizando un dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica. Tome imágenes con un microscopio electrónico de barrido Hitachi S-3400N. (Figura 5) </li></ol>

<ol><li>Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+demographics%2C+and+pathophysiology+of+acute+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury.</a> Spine (Phila Pa 1976). 26, S2-S12 (2001).</li>
<li>Fehlings, M. G., Tator, C. H., Linden, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationships+among+the+severity+of+spinal+cord+injury%2C+motor+and+somatosensory+evoked+potentials+and+spinal+cord+blood+flow%29%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The relationships among the severity of spinal cord injury, motor and somatosensory evoked potentials and spinal cord blood flow).</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 74, 241-259 (1989).</li>
<li>Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+interventions+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Therapeutic interventions after spinal cord injury.</a> Nat Rev Neurosci. 7, 628-643 (2006).</li>
<li>Iwasaki, M., Wilcox, J. T., Nishimura, Y., Zweckberger, K., Suzuki, H., Wang, J., Liu, Y., Karadimas, S. K., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effects+of+self-assembling+peptide+and+neural+stem%2Fprogenitor+cells+to+promote+tissue+repair+and+forelimb+functional+recovery+in+cervical+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synergistic effects of self-assembling peptide and neural stem/progenitor cells to promote tissue repair and forelimb functional recovery in cervical spinal cord injury.</a> Biomaterials. 35, 2617-2629 (2014).</li>
<li>Holmes, T. C., de Lacalle, S., Su, X., Liu, G., Rich, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+neurite+outgrowth+and+active+synapse+formation+on+self-assembling+peptide+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6728-6733 (2000).</li>
<li>Dong, H., Paramonov, S. E., Aulisa, L., Bakota, E. L., Hartgerink, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+multidomain+peptides%3A+balancing+molecular+frustration+controls+conformation+and+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of multidomain peptides: balancing molecular frustration controls conformation and nanostructure.</a> J Am Chem Soc. 129, 12468-12472 (2007).</li>
<li>Rivlin, A. S., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+duration+of+acute+spinal+cord+compression+in+a+new+acute+cord+injury+model+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acute cord injury model in the rat.</a> Surg Neurol. 10, 38-43 (1978).</li>
<li>Poon, P. C., Gupta, D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clip+compression+model+is+useful+for+thoracic+spinal+cord+injuries%3A+histologic+and+functional+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Clip compression model is useful for thoracic spinal cord injuries: histologic and functional correlates.</a> Spine (Phila Pa 1976). 32, 2853-2859 (2007).</li>
<li>Fehlings, M. G., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationships+among+the+severity+of+spinal+cord+injury%2C+residual+neurological+function%2C+axon+counts%2C+and+counts+of+retrogradely+labeled+neurons+after+experimental+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The relationships among the severity of spinal cord injury, residual neurological function, axon counts, and counts of retrogradely labeled neurons after experimental spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 132, 220-228 (1995).</li>
<li>Joshi, M., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+novel%2C+graded+model+of+clip+compressive+spinal+cord+injury+in+the+mouse%3A+Part+2.+Quantitative+neuroanatomical+assessment+and+analysis+of+the+relationships+between+axonal+tracts%2C+residual+tissue%2C+and+locomotor+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 2. Quantitative neuroanatomical assessment and analysis of the relationships between axonal tracts, residual tissue, and locomotor recovery.</a> J Neurotrauma. 19, 191-203 (2002).</li>
<li>Joshi, M., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+novel%2C+graded+model+of+clip+compressive+spinal+cord+injury+in+the+mouse%3A+Part+1.+Clip+design%2C+behavioral+outcomes%2C+and+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 1. Clip design, behavioral outcomes, and histopathology.</a> J Neurotrauma. 19, 175-190 (2002).</li>
<li>Cigognini, D., Satta, A., Colleoni, B., Silva, D., Donegà, M., Antonini, S., Gelain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+early+and+late+effects+into+the+acute+spinal+cord+injury+of+an+injectable+functionalized+self-assembling+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of early and late effects into the acute spinal cord injury of an injectable functionalized self-assembling scaffolds.</a> PLoS One. 6 (5), e19782(2011).</li>
<li>Hou, T., Wu, T., Wang, L., Liu, Y., Li, M., Long, Z., Chen, H., Li, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+prostheses+fabricated+with+motor+neurons+seeded+in+self-assembling+peptides+promotes+partial+functional+recovery+afters+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cellular prostheses fabricated with motor neurons seeded in self-assembling peptides promotes partial functional recovery afters spinal cord injury in rats.</a> Tissue eng Part A. 18 (9-10), (2012).</li>
<li>Gelain, F., Cigognini, D., Caprini, A., Silva, D., Colleoni, B., Donegà, M., Antonini, S., Cohen, B. E., Vescovi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+bioactive+motifs+and+their+use+in+functionalized+self-assembling+peptides+for+NPC+differentiation+and+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">New bioactive motifs and their use in functionalized self-assembling peptides for NPC differentiation and neural tissue engineering.</a> Nanoscale. 4 (9), 2946-2957 (2012).</li>
<li>Liu, Y., Ye, H., Satkunendrarajah, K., Yao, G. S., Bayon, Y., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-assembling+peptide+reduces+glial+scarring%2C+attenuates+post-traumatic+inflammation+and+promotes+neurological+recovery+following+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">A self-assembling peptide reduces glial scarring, attenuates post-traumatic inflammation and promotes neurological recovery following spinal cord injury.</a> Acta Biomater. 9, 8075-8088 (2013).</li>
<li>Rosner, J., Avalos, P., Axosta, F., Liu, J., Drazin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+cell+therapy+combined+with+growth+factors+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">The potential for cell therapy combined with growth factors in spinal cord injury.</a> Stem Cell Int. , 826754(2012).</li>
<li>Lu, P., Wang, Y., Graham, L., McHale, K., Gao, M., Wu, D., Brock, J., Blesch, A., Rosenzweig, E. S., Havton, L. A., Zheng, B., Conner, J. M., Marsala, M., Tuszynsky, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+distance+growth+and+connectivity+of+neural+stem+cells+after+severe+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury.</a> Cell. 150, 1265-1273 (2012).</li>
<li>Karimi-Abdolrezaee, S., Schut, D., Wang, J., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrioitinase+and+grwoth+factors+enhance+activation+and+oligodendrocyte+differentiation+of+endogenous+neural+precursor+cells+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chondrioitinase and grwoth factors enhance activation and oligodendrocyte differentiation of endogenous neural precursor cells after spinal cord injury.</a> PLoS One. 7 (5), e37589(2012).</li>
<li>Awad, B. I., Carmody, M. A., Steinmetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+growth+factors+in+the+management+of+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Potential role of growth factors in the management of spinal cord injury.</a> World Neurosurg. (13), 1875-8750 (2013).</li>
<li>Kojima, A., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+administration+of+epidermal+growth+factor+and+fibroblast+growth+factor+2+promotes+ependymal+proliferation+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Intrathecal administration of epidermal growth factor and fibroblast growth factor 2 promotes ependymal proliferation and functional recovery after spinal cord injury in adult rats.</a> J Neurotrauma. 19 (2), 223-238 (2002).</li>
<li>Karimi-Abdolrezaee, S., Eftekharpour, E., Wang, J., Cindi, M. M., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+trasplantation+of+adult+neural+presursor+cells+promotes+remyelination+and+functional+neurological+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed trasplantation of adult neural presursor cells promotes remyelination and functional neurological recovery after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 26 (13), 3377-3389 (2006).</li>
<li>Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+neurite+outgrowth+by+neurotrophins+delivered+from+degradable+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels.</a> Biomaterials. 27, 452-459 (2006).</li>
</ol>

Covidien suministró el QL6 SAP para este estudio.

Este protocolo ha sido desarrollado para permitir al lector a realizar un modelo de lesión cervical en ratas y de utilizar un enfoque de tratamiento combinado con programas de ajuste estructural y NPCs que promueven una mejor recuperación después de la lesión cervical. En particular, en comparación con otros modelos de trauma cervical, como la (hemi) -transection modelo o los modelos de caída de peso y de concusión, el modelo de clip contusión / compresión representa tanto principales mecani...

Más del 50% de las lesiones de la médula espinal están relacionadas con la columna cervical. En el contexto clínico dos principales mecanismos fisiopatológicos se describen: la contusión inicial de la médula espinal y posteriormente, la compresión en curso causada por fracturas de huesos, hemorragias o inflamación del tejido. El clip de aneurisma imita contusión modelo / compresión de ambos mecanismos fisiopatológicos: rompiendo el clip produce una contusión y la duración de recorte representa el componente de compresión, admitiendo que la compresión en entornos clínicos causados ​​por fracturas de huesos, hemorragias o hinchazón de los tejidos última significativa más tiempo. El clip de aneurisma utilizado es modificado por un resorte anillo garantizando la fuerza exacta y reproducible de recorte. Sobre todo en comparación con el hemi-transección o el modelo de contusión, este clip de aneurisma imita modelo mejores entornos clínicos. Mientras que los pacientes con lesiones torácicas sufren de paraplejía, la mayoría de los pacientes con inj cervicaluries son tetrapléjico y completamente dependiente. La estructura anatómica de la médula cervical, sin embargo, muestra diferencias significativas en comparación con el dorsal o lumbar, y por lo tanto, se trata en particular, en este protocolo. El desarrollo de cavidades intramedulares y cicatrices en los tejidos son obstáculos para la recuperación y regeneración. Para superar estas barreras el uso de material de soporte es un enfoque prometedor. Péptidos de autoensamblaje pueden inyectarse directamente en el epicentro de la lesión. Allí se ensamblan para formar andamios nano-fibra puente de la cavidad y mejorar el medio ambiente inhibitorio al reducir la inflamación y cicatrización de los tejidos. Mientras que los materiales rígidos causan un daño considerable de la médula espinal durante la implantación, los péptidos de fluidos pueden ser inyectados de forma segura y sin daño adicional grave. La mejora del entorno inhibitorio con péptidos auto-montaje antes del trasplante de células madre, por lo tanto, apoyar la celda iNTEGRACIÓN, la diferenciación y, finalmente, la recuperación funcional, después de la lesión de la médula espinal cervical.

<table><tbody><tr><td>Clip aneurismal</td><td>SharpTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio quirúrgico</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de inyección micro</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico para pequeños animales</td><td>David Kopf Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton</td><td>Hamilton company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bombas subdurales</td><td><a href="http://www.alzet.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Alzet osmotic micro pump 1007D</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumento quirúrgico</td><td>Fine Science tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano USP</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución inyectable de cloruro de sodio 0,9 % USP</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidona yodada al 7,5 %</td><td>Purdue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico al 70 % USP</td><td>GreenField Ethanol Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QL6 SAP</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripan al 0,4 %</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico (EGF)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el uso sinérgico de las células precursoras neuronales y péptidos de autoensamblaje en experimental cervical lesión de la médula espinal

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Lesiones de la médula espinal (SCI) causan deterioro neurológico grave y las consecuencias psicológicas, económicas y sociales para los pacientes y sus familias. Clínicamente, más de 50% de SCI afecta a la columna cervical 1. Como consecuencia de la lesión primaria, una cascada de mecanismos secundarios incluyendo la inflamación, apoptosis, y la desmielinización se producen finalmente conduce a la cicatrización de tejidos y el desarrollo de cavidades intramedulares 2,3. Ambos representan barreras físicas y químicas en el trasplante de células, la integración, y la regeneración. Por lo tanto, la configuración del entorno inhibitorio y la reducción de cavidades para crear un medio de apoyo para el trasplante de células y la regeneración es un objetivo terapéutico prometedor 4. Aquí, se describe un modelo de contusión / compresión del SCI cervical usando un clip de aneurisma. Este modelo es más clínicamente relevante que otros modelos experimentales, ya que la transección completa o rupturas del cable son raros. También en COMPARACIÓNn para el modelo de caída de peso, que, en particular, el daño de las columnas dorso, la compresión circunferencial de la médula espinal parece ventajoso. Fuerza de cierre de clip y la duración se puede ajustar para lograr gravedad de la lesión diferente. Un muelle de anillo facilita la calibración precisa y la constancia de la fuerza clip. En condiciones fisiológicas, los péptidos de autoensamblaje sintéticos (SAP) auto-ensamblarse en nanofibras y, por tanto, están haciendo un llamado para la aplicación en SCI 5. Ellos pueden ser inyectados directamente en la lesión minimizar daños en el cable. PAE son estructuras biocompatibles erigir andamios para colmar cavidades intramedulares y, por tanto, equipar el cable dañado por tratamientos regenerativos. K2 (QL) 6K2 (QL6) es una novela SAP introducido por Dong et a l. 6 En comparación con otros péptidos, QL6 auto-ensambla en β-hojas a pH neutro 6 0,14 días después de la lesión, después de la fase aguda, los PAE se inyectan en el centro de la lesión y las células precursoras neurales (NPC) son injected en columnas dorsales adyacentes. Con el fin de apoyar la supervivencia celular, el trasplante se combina con la administración subdural continua de factores de crecimiento por medio de bombas micro osmóticos para 7 días.

Al realizar el procedimiento anteriormente descrito, obtendrá un andamio SAP cerrar la cavidad y que ofrece una mejora del medio ambiente inhibitorio, menos cicatrización del tejido y un aumento en la supervivencia NPC. Figura 4 muestra una sección longitudinal de una médula espinal de rata obtenido en el sitio de la lesión 6 semanas después de SCI y 4 semanas después de la inyección QL6 SAP y NPC trasplante. Péptidos QL6 fueron inyectados con éxito en el cable, agregada en el epicentro y difunden rostr...

El tratamiento de la lesión de la médula espinal cervical con péptidos autoensamblables (SAP) y células precursoras neurales (NPC), junto con factores de crecimiento, es un enfoque prometedor para promover la regeneración y la recuperación. Se establece un modelo de clip de aneurisma de contusión/compresión en ratas de LM cervical y tratamiento combinado que incluye inyección de SAP y trasplante de NPC.

El uso sinérgico de las células precursoras neuronales y Péptidos de autoensamblaje en Experimental cervical Lesión de la Médula Espinal

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

El objetivo general de este procedimiento es introducir un modelo de clip de compresión por contusión de la LM cervical en ratas, y un protocolo para el tratamiento combinado que involucra inyección de SAP y trasplante de NPC. Primero, se coloca una pinza para aneurisma alrededor de la médula espinal y se mantiene en su lugar durante un minuto. Esto da como resultado una lesión por compresión por contusión bilateral.A continuación, los SAP se inyectan en el epicentro de la lesión, los NPC se inyectan inmediatamente después de la inyección de SAP. Se inserta una bomba osmótica con un catéter subdural para la administración sostenida de factores de crecimiento. Este procedimiento da como resultado la entrega de NPC a la médula espinal lesionada.La supervivencia e injerto de las NPCs se apoya en el tratamiento combinado con SAPs y factores de crecimiento. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una terapia para la lesión traumática de la médula espinal porque proporciona un modelo clínicamente relevante que se puede utilizar para estudiar las terapias COMBINATOR basadas en células que promueven la regeneración de la médula espinal. El siguiente protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado Animal de la Red Universitaria de Salud, Toronto, Canadá, y está de acuerdo con las políticas establecidas en la guía para el cuidado y uso de animales de experimentación elaborada por el Consejo Canadiense de Cuidado Animal.Todos los procedimientos quirúrgicos deben realizarse en condiciones estériles utilizando equipos y soluciones estériles, y de acuerdo con las pautas de la institución y el gobierno, este procedimiento utiliza ratas que pesan de 250 a 270 gramos antes de comenzar el procedimiento. Proporcione a los animales antibióticos en el agua potable durante dos días el día del procedimiento. Después de colocar a la rata en una cámara de anestesia e inducir la anestesia con 5% de flúor ISO en oxígeno uno a uno y óxido nitroso durante un minuto, reduzca el flúor ISO a 1.8 a 2.2%Aplique el ungüento lambic en los ojos y confirme la anestesia quirúrgica realizando un pellizco en la pata.A continuación, coloca la rata sobre un cojín térmico y fija la cabeza en un marco estereotáxico con un cono nasal. Después de afeitar el pelaje alrededor de la columna cervical, desinfecte la piel con un hisopo con povidona yodado, seguido de etanol al 70% después de hacer una incisión en la línea media desde la región de las vértebras cervicales C dos hasta el proceso prominente del cuerpo vertebral torácico T dos. Use tijeras quirúrgicas para cortar la capa externa de los músculos vertebrales directamente en la línea media en una dirección de mimo craneal, use tijeras quirúrgicas para diseccionar las capas musculares más profundas hasta llegar al proceso, la osis y el laminado.Inserte los transportadores y sujételos. Abra las capas musculares, luego oriente el proceso posis prominente del cuerpo de las dos vértebras T e identifique los niveles objetivo para la laminectomía. A continuación, utilice un bisturí número 15 para cortar el ligamento y aflojar la lámina y el processis posis.A continuación, use un cortahuesos para cortar las láminas laterales a la médula espinal y retire suavemente las láminas sin comprimir la médula espinal. Ahora tómese un momento para identificar las raíces nerviosas emergentes para evitar que se corten. A continuación, utilice un gancho para aflojar la duramadre ventral de la cara dorsal de los cuerpos vertebrales y prepare un pasillo para el clip.Asegúrese de que el resorte anular del clip esté configurado para entregar la fuerza deseada. La fuerza del clip determina el alcance del trauma y la compresión. Inserte el clip abierto alrededor de la médula espinal y deje que se cierre para inducir una lesión por contusión.A menudo se utilizan fuerzas de corte de entre 15 y 35 gramos con una duración de corte de un minuto después de que se haya realizado la lesión de la médula espinal. Retire el clip y cierre los músculos en dos capas, seguido del cierre de la piel. Una vez que la herida esté bien cerrada, detenga la anestesia y observe a la rata mientras se despierta.Después de que el animal haya recuperado la conciencia suficiente para estar recostado en eternón, coloque a la rata en una jaula limpia. Debido a la gravedad de este tipo de lesión, es imperativo que se sigan los siguientes tratamientos postoperatorios. En primer lugar, asegúrese de administrar analgésicos como buprenorfina y meloxicam durante tres a cinco días, dependiendo de los síntomas.También prevenir la deshidratación por vía subcutánea. Inyectar de cinco a 10 mililitros de solución salina dos veces al día durante tres días, y continuar proporcionando antibióticos en el agua potable durante cinco días. Postoperatorio. Apriete la vejiga urinaria dos o tres veces al día hasta que la recuperación constante de la función de la vejiga sea evidente, incluso después de que los animales parezcan recuperados.Asegúrese de observar a los animales operados para detectar déficits neurológicos y condiciones fisiológicas. La inyección se realiza 14 días después de la lesión de la médula espinal. Antes de comenzar la cirugía, prepare los SAP a una concentración del 1% en peso por volumen en agua estéril y llene un capilar de vidrio de 100 micrómetros conectado a una jeringa Hamilton.Con la solución, conecte la jeringa Hamilton al marco estereotáxico. Después de la anestesia, la rata coloca la cabeza en el marco estereotáxico y desinfecta el sitio de la cirugía con povidona yodada y alcohol al 70%. Como antes, una vez más, después de abrir la piel, diseccione cuidadosamente el par de músculos vertebrales e inserte retractores.Use un bisturí número 15 para eliminar el tejido cicatricial de la duramadre y volver a exponer el sitio de la lesión. A continuación, utilice la punta de una aguja afilada para abrir la duramadre con cuidado. Por último, estereotácticamente, insertar el capilar de vidrio a una profundidad de dos milímetros en la médula espinal traumatizada e inyectar las SAP.Después de inyectar los SAP, deje que el capilar permanezca en el lugar de la inyección durante un minuto antes de retirarlo para permitir que el tejido se estire y acomode la solución inyectada. A continuación, repita la inyección en el siguiente sitio. Aquí, los NPC se aislaron de la zona paraventricular de un ratón rojo DS adulto y se cultivaron de acuerdo con los procedimientos publicados anteriormente.Justo antes de la microinyección, diluya las NPC en el medio de crecimiento a una concentración de 50 veces 10 por la tercera célula viva por microlitro para el trasplante de células y cárguelas en un capilar de vidrio en una jeringa Hamilton. Los NPC se inyectan inmediatamente después de la inyección de SAP. Para ello, inserte el capilar de vidrio de la jeringa Hamilton a 0,2 milímetros rostral del sitio de la lesión y a 1,5 milímetros por debajo de la superficie dorsal de la médula espinal.Inyecte dos microlitros de la suspensión celular a una velocidad de aproximadamente 0,5 microlitros por minuto. Una vez completada la primera inyección, deje que el capilar permanezca en la médula espinal durante un minuto como antes, luego retraiga el capilar, muévalo a un sitio adyacente y repita el procedimiento de inyección. Después de esperar un minuto, como antes, retraiga el capilar y muévalo dos milímetros hasta el sitio de la lesión.Realice dos inyecciones de dos microlitros en este lugar. Esta imagen muestra todos los sitios de inyección en relación con la lesión de la médula espinal. La implantación de minibombas osmóticas subdurales para el soporte del factor de crecimiento se realiza inmediatamente después de las inyecciones de NPC.En primer lugar, elija un sitio de implantación. Los sitios preferidos son los flancos laterales de la región toracoabdominal para evitar las molestias causadas por la propia bomba. Después de desinfectar la región como antes, se prepara un receso subcutáneo para la bomba.A continuación, realice una laminectomía de las vértebras superiores o inferiores adyacentes a la lesión de la médula espinal. En este caso, la lesión medular se realizó en C siete T uno, por lo que la laminectomía se realiza en C cinco. Ahora coloque la bomba en el hueco subcutáneo, luego corte el catéter a la longitud necesaria y finalmente use suturas 6.0 para asegurarlo al par de músculos vertebrales.Evitando cualquier desplazamiento asociado. Use la punta de una aguja afilada para abrir la duramadre debajo de la laminectomía. A continuación, introduzca el catéter en el espacio subdural y deje que se deslice en dirección de mimo sin resistir y sin lesionar el cordón.Ahora, verifique que el catéter funcione sin problemas y no tenga torceduras ni pliegues como se muestra aquí. A continuación, cierre los músculos capa por capa con suturas o clips, y luego cierre la piel. Una vez que la herida esté bien cerrada, detenga la anestesia y observe al animal mientras despierta.Después de que el animal haya recuperado la conciencia suficiente para recostarse esternalmente, coloque a la rata en una jaula limpia. Asegúrese de seguir todos los procedimientos de tratamiento postoperatorio, incluido el seguimiento del animal y la analgesia postquirúrgica. Administrar el tratamiento inmunosupresor dos días antes de la inyección de NPC y hasta siete días después del trasplante y hasta el sacrificio, respectivamente.Esta imagen de microscopía de fluorescencia muestra una sección longitudinal de una médula espinal traumatizada de una rata. La tinción es SAP de fluorescencia DPI marcada con QL six. Los fitos aparecen de color verde y se han agregado en el epicentro de la lesión.Los NPC rojos positivos DS inyectados se han difundido en las direcciones rostral y mimo indicadas por la fluorescencia roja. La barra de escala representa cinco milímetros. Aquí, una imagen de microscopio electrónico de barrido muestra la formación de andamios de nanofibras de SAP ensamblados.La barra de escala representa un micrómetro. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de los procedimientos quirúrgicos implicados en la compresión de clips, la LME y cómo se puede estudiar en este modelo el prometedor enfoque del tratamiento combinado con SAP y NPC.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

La lesión traumática de la médula espinal interrumpe la comunicación con el cerebro. Para restaurar la pérdida de conectividad que utilizan un injerto de nervio periférico para proporcionar un sustrato para la regeneración de las fibras en combinación con factores neurotróficos y las enzimas de la matriz de modulación, para eliminar las moléculas inhibidoras para promover el crecimiento de larga distancia.

La combinación de injerto de nervio periférico y la matriz de modulación para la Reparación de médula espinal de ratas lesionados

El trasplante de precursores neuronales es una estrategia prometedora para la protección y / o reemplazar la pérdida / disfuncional neuronas cervical motor frénico en lesiones de médula espinal (LME) y el trastorno de la neurona motora, esclerosis amiotrófica laterales (ALS). Ofrecemos un protocolo para la entrega de celulares a cuerno ventral de la médula espinal cervical en modelos de roedores de la ELA y la médula espinal.

Intraespinal trasplante de células de Orientación asta ventral del cuello uterino en la esclerosis lateral amiotrófica y la lesión de la médula espinal

A continuación se describe el uso de un auto-montaje de andamios de 3 dimensiones para cultivo de células progenitoras neurales humanas. Se presenta un protocolo para liberar las células de los andamios para ser analizados posteriormente por ejemplo, mediante citometría de flujo. Este protocolo puede ser adaptado a otros tipos de células para llevar a cabo estudios detallados de manera mecánica.

Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

Fuente: Zweckberger, K., et al. Uso sinérgico de células precursoras neurales y péptidos autoensamblables en lesiones experimentales de la médula espinal cervical.  J. Vis. Exp. (2015).Este protocolo demuestra un enfoque de inyección dirigida para la reparación de lesiones de la médula espinal en un modelo de rata. Implica la administración de péptidos autoensamblables (SAP) en el núcleo de la lesión para crear un andamio de soporte, seguido de inyecciones de células precursoras neurales (NPC)...

Inyección de péptidos autoensamblables y células precursoras neurales para la reparación de la médula espinal en un modelo de rata

Matrices de fibrina que contienen factores de crecimiento se utilizaron para conservar las células madre neurales injertadas en los sitios de la transección completa de la médula espinal. Células injertadas llenaron completamente la cavidad de la lesión y diferenciarse en múltiples tipos de células neuronales, incluyendo las neuronas que se extendían axones en la médula espinal de acogida a través de largas distancias.

Promoción de la supervivencia y la diferenciación de células madre neurales con fibrina y factor de crecimiento cócteles después de la médula espinal severa lesión

Lesión de la médula espinal es una condición traumática que causa morbilidad severa y alta mortalidad. En este trabajo se describe en detalle un modelo contusión de lesión de la médula espinal en ratones seguido de un trasplante de células madre neurales.

Neural Trasplante de células madre en Experimental contuso Modelo de Lesión de la Médula Espinal

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Las estrategias experimentales para llenar los vacíos grandes de tejido de la médula espinal lesionada espinal después de la lesión aguda y crónica

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Anatomía Inspirada Tridimensional Micro-tejido Ingeniería de Redes Neuronales para la Reconstrucción del Sistema Nervioso, Modulación y Modelado

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Trasplante de Schwann las células dentro de conductos de PVDF-TrFE a puente tocones de médula espinal de rata seccionado para promover la regeneración del axón a través de la brecha

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El uso sinérgico de las células precursoras neuronales y Péptidos de autoensamblaje en Experimental cervical Lesión de la Médula Espinal (Video) | JoVE Journal

El uso sinérgico de las células precursoras neuronales y Péptidos de autoensamblaje en Experimental cervical Lesión de la Médula Espinal

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