Cultura Organotypic método para estudiar el desarrollo de tejidos de embrión de pollo

El objetivo general de este protocolo es proporcionar acceso a los ojos de pollo embrionarios en un entorno in vitro para permitir el estudio en profundidad de vías de desarrollo complejas en el embrión. En el pollo embrionario, el estudio del ojo suele ser difícil, debido al desarrollo de los párpados, el movimiento del embrión y el crecimiento de tejidos embrionarios adicionales. Los compuestos, como los fármacos y los inhibidores, también pueden tener efectos letales en el embrión, lo que dificulta el uso de estos compuestos para modular las vías genéticas.

Los avances en el cultivo de tejidos in vitro han permitido a los científicos aislar estos tejidos y eliminar muchas de las barreras antes mencionadas. Nuestro protocolo es ventajoso porque nos permite estudiar el ojo como un todo, incluyendo todos los tejidos que tienen el potencial de interactuar durante el desarrollo, como la retina neural y el epitelio pigmentado de la retina. Comience por esterilizar los materiales en autoclave para asegurarse de que todas las soluciones y el equipo estén estériles antes del procedimiento.

Para ello, autoclave dos litros de agua destilada y un litro de solución salina para pollitos, junto con una caja de pañuelos desechables, papel de filtro semiporoso, malla de alambre, recipientes de agua y pipetas de vidrio desechables. Esterilice completamente los estantes y la puerta de la incubadora con etanol al 70%, luego llene los recipientes con agua destilada esterilizada en autoclave y precaliente la incubadora a 37 grados centígrados. Precaliente el medio nutritivo, junto con un tubo del antibiótico penicilina estreptomicina en la incubadora.

Coloque una toalla de papel en el espacio de trabajo y esterilice con etanol al 70%. Esteriliza todas las pinzas y tijeras. Con la cabeza de pollo en solución salina de pollito esterilizada en autoclave, corte la cabeza del pollito en la línea media, dejando un poco de tejido intacto alrededor de cada ojo.

El tejido adicional ayudará al ojo a mantener cierta tensión en el cultivo, además de ayudar con la absorción de nutrientes en todo el ojo y evitar que el ojo se deslice fuera del papel de filtro. Estos tejidos también sirven como puntos de referencia a la hora de orientar el ojo en análisis posteriores. Deje el tejido diseccionado en solución salina para pollitos a temperatura ambiente mientras prepara el cultivo.

Prepara el plato de cultivo. Coloque dos placas de Petri de 35 milímetros dentro de una placa de Petri de 100 milímetros. Coloque una etapa de malla de alambre en cada plato pequeño.

Coloque la mitad de la cabeza con el ojo sobre un trozo de papel de filtro, inclinándolo ligeramente para asegurarse de que el ojo no se deslice del papel. Transfiera el pañuelo y el papel de filtro a la pequeña placa de Petri en la parte superior de la etapa de malla de alambre. Repita con la otra mitad de la cabeza del mismo embrión.

Agregue medio de cultivo a cada una de las dos placas de Petri pequeñas. Lleva el medio hasta el nivel del papel de seda. No sumerja el pañuelo en el medio.

Agregue 50 microlitros de la solución madre de estreptomicina antibiótica penicilina al medio nutritivo en cada plato para prevenir la infección bacteriana. Coloque un trozo doblado de tejido delgado en el borde interior de la placa de Petri más grande y humedézcalo con agua destilada. Incube el cultivo en la incubadora oscura a 37 grados centígrados durante un máximo de cuatro días.

Después del cultivo, retire el pañuelo del papel de filtro y fíjelo en un 4% de paraformaldehído. La primera columna muestra un ojo HH34, que representa el ojo del polluelo embrionario al comienzo del cultivo. La segunda columna muestra un ojo de pollo embrionario cultivado durante cuatro días, comenzando en HH34.

La tercera columna muestra un ojo HH38, que corresponde a cuatro días de desarrollo in ovo más allá de HH34. Los paneles de la A a la F no están teñidos, mientras que los paneles G a I están teñidos para la enzima fosfatasa alcalina. La fila superior, paneles de la A a la C, muestra que el ojo continúa desarrollándose a lo largo de la cultura, evidenciado por la aparición de yemas de plumas y el crecimiento de los párpados, indicados por flechas en cada panel.

La fila del medio, paneles D a F, muestra que las papilas conjuntivales comienzan a degenerar en cultivo. La fila inferior, paneles G a I, muestra que el patrón espacio-temporal de la inducción del huesecillo escleral se mantiene en cultivo, sirviendo como ejemplo de una vía de desarrollo que puede estudiarse utilizando este método. Este protocolo permite que los tejidos mantengan los aspectos espaciales y temporales clave del desarrollo a lo largo de todo el cultivo.

Este protocolo representa un avance clave en el cultivo de órganos sensoriales completos, proporcionando una metodología alternativa para estudiar las intrincadas vías de desarrollo involucradas.