Microscopia de la fuerza de protrusión: Un método para cuantificar las fuerzas desarrolladas por salientes de celular

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar las fuerzas de protrusión utilizando microscopía de fuerza atómica. Esto se logra preparando primero las rejillas recubiertas de fórmula y midiendo el grosor de esta película. El tercer paso de este proceso consiste en asentar las células en las rejillas y dejar que se adhieran.

El paso final del procedimiento es obtener imágenes de la película de forma debajo de las células utilizando microscopía de fuerza atómica. Cuando se adhieren al sustrato, los micrófagos forman estructuras de adhesión submicrométricas llamadas podosomas. En última instancia, la deformación de la película utilizada por los podosomas se cuantificará y se convertirá en fuerzas mediante un modelo mecánico casero.

Coloque una luz de vidrio limpia con etanol en el dispositivo de fundición de película del embudo y cubra la parte superior del embudo. Desplácese la solución de fomvar hacia arriba en el embudo hasta que el nivel alcance dos tercios del portaobjetos. Déjalo actuar durante un minuto y luego escurre la solución de formvar en un chorro constante.

Tenga en cuenta que el espesor de la película depende tanto de la velocidad de flujo como de la concentración de la solución de formvar. Sécalo con palmaditas oscuras y corta los rectángulos con una cuchilla de afeitar afilada. Sumerja el portaobjetos en su vaso de precipitados lleno de agua destilada para que la película de fomvar flote sobre la superficie del agua.

Coloque con cuidado rejillas limpias de acetona sobre las películas, brillantes hacia arriba con un cubreobjetos de 12 milímetros de diámetro encima de algunas de ellas. Se utilizarán para el experimento de evaluación de espesores. Finalmente, sumerja una diapositiva cubierta con pegatinas para recuperar toda la película y las rejillas.

Delinea el engobe cubierto de vidrio con unas pinzas para cortar el molde y separarlo del portaobjetos. Monta la ubicación de la rejilla debajo del engobe cubierto y luego delinea la rejilla con pinzas para sacarla. Se tomarán imágenes del agujero en la película de fomvar así creado para medir su grosor.

Monte una botella de nitrato de silicio en el bloque de vidrio AFM, asegurándose de que la franja dorada no esté debajo de la punta del resorte. Monte el bloque de vidrio en el módulo AFM y luego colóquelo en la platina del microscopio. Coloque el cubreobjetos recubierto de fomvar en la cámara de observación con PBS en la parte superior.

Escanee el borde entre el fomvar y el vidrio en modo de contacto y con un punto de 0,5 nano newton. En el software de procesamiento de datos, utilice la superficie del vidrio como referencia de altura y mida el espesor del fomvar en la sección transversal. Debajo de una capucha estéril, tome un cubreobjetos de 12 milímetros y pegue una tira de la cinta adhesiva del lado del orificio.

Delinee la rejilla recubierta de fomavr con pinzas y colóquela brillante boca arriba para que solo se adhiera a los lados del adhesivo. Esto es para evitar que el fomvar se rompa al quitar la rejilla de la cinta. Coloque la tira de cubierta en una placa estéril de seis pocillos y colóquela en una gota de 10 milímetros de medio de cultivo libre de suero.

Debe contener aproximadamente 10 mil células y en este caso, se trata de micrófagos diferenciados de los monocitos humanos. Asegúrese de no tocar la rejilla con la punta del gaitero en el proceso, para no dañar el recubrimiento de fomvar. Incubar durante media hora para que las células se adhieran, luego llenar el pocillo con medio suplementado con suero y volver a incubar durante dos horas, antes de la observación de la MFA.

Coloque dos tiras paralelas de cinta adhesiva de doble cara en una placa de Petri con fondo de vidrio, asegurándose de que el ancho entre ellas sea ligeramente menor, en comparación con el diámetro de la rejilla. A continuación, separe la rejilla previamente sembrada con células y colóquela encima de las dos tiras de cinta con las células hacia abajo. Fije la rejilla colocando otras dos tiras encima de las anteriores.

Llene el plato con medio de cultivo precalentado complementado con hepe's. Coloque el plato en el calentador de platos previamente configurado a 37 grados centígrados. Instale el conjunto en el escenario AFM.

Cuando la temperatura del sistema es estable a 37 grados centígrados, se procede al escaneo de la superficie de fomvar, que debe realizarse en el modo de contacto, con un punto de ajuste de 0,95 nano newton y visualizar las deformaciones asociadas a los protozoos en la ventana de vista de datos de deflexión. Estos son los resultados representativos y los pasos de procesamiento para producir formaciones con AFM a las mediciones gráficas. Como se puede ver en esta imagen, se detectan protuberancias en la superficie del fomvar.

Para convertir esta información fotográfica en valores de fuerza, es necesario tener acceso primero a la diferencia alta local. Para ello, se debe restar un ajuste polinómico de tercer grado a su línea de exploración de forma independiente. Luego, el uso de un algoritmo de imágenes dedicado casero permite evaluar los valores de fuerza de protuberancia a partir del mapa de altura de AFM y el modelo mecánico de protrusión mediada por protozoos.

Gracias a este procedimiento, podemos investigar los mecanismos implicados en la generación de fuerza de protrusión en los protozoos. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.