Name: Microscopia de la fuerza de protrusión: Un método para cuantificar las fuerzas desarrolladas por salientes de celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Aprende a cuantificar fuerzas de protrusión celular mediante microscopía de fuerza atómica en podosomas de macrófagos. Este método permite analizar la deformación de películas flexibles y convertirla en valores de fuerza usando un modelo mecánico.

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Los autores agradecemos a Anna Labernadie, Guillaume Charrière y Patrick Delobelle por su contribución inicial a esta obra y a Matthieu Sanchez y Françoise Viala por su ayuda con video filmación y edición. Este trabajo ha sido apoyado por la Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan cáncer, Fundación Toulouse cáncer humano programa de ciencia de frontera (RGP0035/2016).

1. elaboración de rejillas de Formvar recubierto
<ol><li>Limpiar rejillas de microscopia electrónica con acetona pura y seca sobre papel filtro. Luego limpiar el portaobjetos de un microscopio con etanol puro, limpie con un papel de lente y quite el polvo con un soplador.</li>
	<li>Colocar un portaobjetos de vidrio limpieza de etanol verticalmente en el embudo de un dispositivo de colada de película que contiene una solución de Formvar en la parte inferior. Cubrir la parte superior del embudo.</li>
	<li>Bomba de 100 mL de solución de Formvar (0.5% en dicloruro de etileno) con el bulbo atomizador hasta que alcanza las dos terceras partes de la diapositiva.</li>
	<li>Mantener la corredera en la solución durante 1 minuto.</li>
	<li>Abra la válvula del dispositivo para drenar la solución de Formvar en un flujo constante. Un caudal de 10 a 15 mL/s producirá una película de Formvar de 30-80 nm. El espesor de la película se determina por la concentración de la solución de Formvar y por la tasa de drenaje. Nota: La tasa de drenaje puede controlarse por la presión a través de la válvula de salida de aire de ventilación abriendo lentamente la válvula. Más rápido el drenaje, cuanto más gruesa la película. En la práctica, porque es difícil predecir el espesor de la película de la tasa de flujo de Formvar, preparamos varios lotes de películas de Formvar y controlar su espesor por AFM (véase paso 2).</li>
	<li>Retire el portaobjetos de la cámara y secar delicadamente en papel de filtro para eliminar cualquier líquido Formvar.</li>
	<li>Cortar un rectángulo de 20 x 50 mm de la película de Formvar con una cuchilla de afeitar.</li>
	<li>Llene un vaso de precipitados con agua destilada y sumergirse lentamente el portaobjetos verticalmente en el agua para flotar fuera de la película: la película debe flotar sobre la superficie del agua.</li>
	<li>Lugar seco acetona limpia las rejillas en la película, brillante hacia arriba.</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos de vidrio redonda (Ø 12 mm) en algunas de las rejillas. Este cubreobjetos servirá para medir el espesor de la película (véase paso 2).</li>
	<li>Cubrir el portaobjetos de un microscopio con una pegatina blanca cambia el tamaño para colocarlo. Sumerja la diapositiva verticalmente en la frontera de la película de Formvar flotante hasta que toda la película se adhiera al portaobjetos. Quitar exceso de agua de lo portaobjetos con papel de filtro y dejar secar a temperatura ambiente durante la noche.</li>
</ol>2. medición del espesor de la película
<ol><li>Corte el Formvar alrededor el cubreobjetos con las pinzas para separar de la diapositiva.</li>
	<li>Marque la ubicación de la rejilla bajo el cubreobjetos con un lápiz.</li>
	<li>Corte el Formvar alrededor de la rejilla marcada para desprenderse del cubreobjetos. Por lo tanto habrá un agujero en la hoja restante de Formvar, que permitirá medir el espesor de la película. Cubrir el cubreobjetos con PBS y se coloca sobre un portaobjeto en el microscopio.</li>
	<li>Montar un voladizo de nitruro de silicio en el bloque de cristal AFM, asegurándose de que la raya de oro no está cubierta por la punta del muelle. Nota: La sensibilidad y la constante elástica del voladizo deben haberse previamente calibrados en PBS.</li>
	<li>Monte el bloque de vidrio en el módulo AFM y luego colocar el módulo en el microscopio.</li>
	<li>Colocar el cubreobjetos de Formvar recubierto en la cámara de observación y cubrirla con 500 μl de PBS.</li>
	<li>Explorar la frontera del agujero en la hoja de Formvar utilizando AFM en modo de contacto y un punto de ajuste de fuerza de 0.5 nN.</li>
	<li>Utilizar la superficie del cubreobjetos de vidrio como la referencia para la medición de la altura y evaluar el grosor de Formvar que la altura de la sección transversal (realizar al menos 10 mediciones por Formvar lote).</li>
</ol>3. siembra de células en redes
<ol><li>Bajo una campana de estéril, coloque una tira (12 mm x 3 mm) de cinta adhesiva de doble cara en un cubreobjetos.</li>
	<li>Corte una cuadrícula Formvar recubierto con pinzas y ponerlo boca abajo sobre la cinta adhesiva (sólo el borde de la red necesita ser atado a la cinta). La película de Formvar debe enfrentar el cubreobjetos.</li>
	<li>Poner este dispositivo en una cultura así.</li>
	<li>Coloque una gota de 10 μl de RPMI sin FCS que contiene 10 macrófagos4 distinguidos de monocitos humanos16. Nota: Asegúrese de no tocar la red con la punta de la pipeta para evitar dañar el revestimiento de Formvar.</li>
	<li>Incubar durante 30 min (37 ° C, 5% CO2) para dejar que las células se adhieren.</li>
	<li>Llenar el pozo con 2 mL de RPMI con 10% FCS.</li>
	<li>Incubar el dispositivo por 2 h a 37 ° C y 5% CO2 para dejar que las células se adhieren antes de observación AFM.</li>
</ol>4. topografía mediciones de deformaciones inducidas por Podosome
<ol><li>Pegar dos tiras de cinta adhesiva de doble cara en un fondo de cristal plato de Petri. Nota: La distancia entre las dos tiras debe ser más pequeña que el diámetro de la rejilla.</li>
	<li>Cuidadosamente separe la rejilla plateada con los macrófagos de la cinta adhesiva.</li>
	<li>Invierta la red para tener las células hacia el vidrio y la red entre las dos tiras de adhesivo se pega.</li>
	<li>Fijar la rejilla con dos nuevas tiras de adhesivo doble cara: la red así se se intercala entre dos tiras de adhesivo, dejando la zona central de la red de acceso a la punta AFM. Nota: Asegúrese de que la red es bien fija y no doblada; de lo contrario el voladizo AFM no podrían acercarse a la superficie de Formvar.</li>
	<li>Llene la caja Petri con 2 mL de medio de cultivo previamente calentadas 37 ° C (RPMI con 10% FCS) suplementado con 10 mM HEPES (pH 7.4).</li>
	<li>Coloque la placa de cultivo en un calentador de plato de 37 ° C.</li>
	<li>Instale el calentador de plato en el escenario de la AFM.</li>
	<li>Deje que el sistema se estabilice a 37 ° C.</li>
	<li>En modo de contacto con una fuerza de 0,5 nN, hacer una primera imagen global para localizar podosomes y después explorar la topografía de Formvar a 3 Hz con un pixel aproximadamente 20 nm-grande. Nota: Evitar analizar cerca de los bordes de la rejilla.</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
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<li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
</ol>

No hay conflicto de interés declarado.

Propiedades de los materiales
La elección del material de la membrana deformable, en nuestro caso Formvar, debe cumplir con unos requisitos. El material debe ser transparente a la luz visible y exhiben fluorescencia auto limitada para permitir observaciones en campo brillante y microscopía de fluorescencia. La rugosidad de la capa fina debe estar muy por debajo de 10 nm para evitar efectos topográficos sobre la adhesión celular y para permitir la observación clara de las protu...

Las células animales interactúan físicamente con la matriz y las otras células que constituyen su medio ambiente1. Esto es necesario para que puedan migrar, internalizar cuerpos, adquirir información externa o distinguir. En tales procesos, la célula debe generar fuerzas mecánicas y, como han demostrado numerosos estudios en los últimos años, la capacidad de una célula para generar fuerzas y probe su entorno influye en su comportamiento biológico, dirigir por ejemplo proliferación o diferenciación de2,3. A su vez, la medición de fuerzas celulares es una ayuda importante para estudiar la regulación de la generación de fuerzas y comprender su implicación en la célula comportamiento y tejido destino4,5.
Años recientes han presenciado el desarrollo de numerosas técnicas para medir las fuerzas que una célula puede ejercer sobre su medio ambiente6. La mayoría de ellos ha sido instrumental en revelar que la tracción las fuerzas que las células ejercen como tiran en sondas móviles o un substrato deformable. Sin embargo, las fuerzas mecánicas involucradas en protrusión en el ambiente extracelular sufren de una falta de técnicas de medición y hasta la fecha no bien caracterizado.
Para superar esta limitación, se presenta un método para medir las fuerzas ejercidas ortogonalmente al sustrato. Consiste en las células vivas en una fina lámina elástica que pueden deformarse en la dirección ortogonal, lo que es posible medir la deformación del sustrato por las células y deducir las fuerzas implicadas de la galjanoplastia. Topografía del sustrato se mide con una resolución de nanoescala utilizando microscopía de fuerza atómica y la evaluación de las fuerzas de deformación se basa en el conocimiento de la geometría de las estructuras celulares protrusivo7,8, 9.
Aquí, describimos la configuración y su aplicación para medir las fuerzas generadas por podosomes, estructuras de protrusión de la adherencia, formadas por los macrófagos para su migración mesenquimal en entornos tridimensionales10,11, 12,13,14,15,16,17. Creemos que esta técnica será avanzar en el entendimiento de la generación de fuerzas y su regulación en los procesos celulares que implican protrusión.

<table><tbody><tr><td>Rejillas de níquel de malla 200</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>Pegatinas blancas 26 x 70 mm</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de fundición de película con válvula en su salida</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de afeitar</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>Formvar solución al 0,5% en dicloruro de etileno</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de 12 mm</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fuerza atómica</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>Portamuestras con control de temperatura&nbsp;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>Voladizo de nitruro de silicio con una constante de resorte nominal de 0,01 N/m</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de doble cara</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri con fondo de vidrio de 35 mm</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia de la fuerza de protrusión: un método para cuantificar las fuerzas desarrolladas por salientes de celular

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

En numerosos contextos biológicos, las células animales necesitan interactuar físicamente con su entorno mediante el desarrollo de las fuerzas mecánicas. Entre ellas, las fuerzas de tracción han sido bien caracterizadas, pero hay una falta de técnicas que permite la medición de las fuerzas de protrusión ejercida por células ortogonalmente a su substrato. Se diseñó un montaje experimental para medir las fuerzas de protrusión ejercidas por las células adherentes a su substrato. Células sobre una hoja de Formvar compatible con este sustrato deforman y la topografía resultante se asigna por microscopía de fuerza atómica (AFM) en la escala de nanómetros. Valores de fuerza se extraen luego de un análisis del perfil de deformación basado en la geometría de las estructuras celulares protrusivo. Por lo tanto, las fuerzas ejercidas por las unidades individuales que sobresale de una célula viva pueden medirse con el tiempo. Esta técnica permite el estudio de generación de fuerzas y su regulación en los procesos celulares que implican protrusión. Aquí, Describimos su aplicación para medir las fuerzas protrusivo generadas por podosomes formado por macrófagos humanos.

El protocolo de arriba describe cómo preparar la configuración experimental para cuantificar la fuerza saliente por macrófagos podosomes en un substrato de Formvar. Esto se consigue utilizando AFM y se ilustra en la figura 1.
Al analizar una imagen topográfica de protuberancias debajo de podosomes usando el software de procesamiento de datos JPK, un polinomio de tercer grado ajuste debe restarse de ...

Aquí detallamos las técnicas experimentales usadas para evaluar las fuerzas de la saliente que podosomes aplicar sobre una película compatible con, desde la preparación de la película para el análisis automatizado de imágenes topográficas.

Microscopia de la fuerza de protrusión: Un método para cuantificar las fuerzas desarrolladas por salientes de celular

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar las fuerzas de protrusión utilizando microscopía de fuerza atómica. Esto se logra preparando primero las rejillas recubiertas de fórmula y midiendo el grosor de esta película. El tercer paso de este proceso consiste en asentar las células en las rejillas y dejar que se adhieran.El paso final del procedimiento es obtener imágenes de la película de forma debajo de las células utilizando microscopía de fuerza atómica. Cuando se adhieren al sustrato, los micrófagos forman estructuras de adhesión submicrométricas llamadas podosomas. En última instancia, la deformación de la película utilizada por los podosomas se cuantificará y se convertirá en fuerzas mediante un modelo mecánico casero.Coloque una luz de vidrio limpia con etanol en el dispositivo de fundición de película del embudo y cubra la parte superior del embudo. Desplácese la solución de fomvar hacia arriba en el embudo hasta que el nivel alcance dos tercios del portaobjetos. Déjalo actuar durante un minuto y luego escurre la solución de formvar en un chorro constante.Tenga en cuenta que el espesor de la película depende tanto de la velocidad de flujo como de la concentración de la solución de formvar. Sécalo con palmaditas oscuras y corta los rectángulos con una cuchilla de afeitar afilada. Sumerja el portaobjetos en su vaso de precipitados lleno de agua destilada para que la película de fomvar flote sobre la superficie del agua.Coloque con cuidado rejillas limpias de acetona sobre las películas, brillantes hacia arriba con un cubreobjetos de 12 milímetros de diámetro encima de algunas de ellas. Se utilizarán para el experimento de evaluación de espesores. Finalmente, sumerja una diapositiva cubierta con pegatinas para recuperar toda la película y las rejillas.Delinea el engobe cubierto de vidrio con unas pinzas para cortar el molde y separarlo del portaobjetos. Monta la ubicación de la rejilla debajo del engobe cubierto y luego delinea la rejilla con pinzas para sacarla. Se tomarán imágenes del agujero en la película de fomvar así creado para medir su grosor.Monte una botella de nitrato de silicio en el bloque de vidrio AFM, asegurándose de que la franja dorada no esté debajo de la punta del resorte. Monte el bloque de vidrio en el módulo AFM y luego colóquelo en la platina del microscopio. Coloque el cubreobjetos recubierto de fomvar en la cámara de observación con PBS en la parte superior.Escanee el borde entre el fomvar y el vidrio en modo de contacto y con un punto de 0,5 nano newton. En el software de procesamiento de datos, utilice la superficie del vidrio como referencia de altura y mida el espesor del fomvar en la sección transversal. Debajo de una capucha estéril, tome un cubreobjetos de 12 milímetros y pegue una tira de la cinta adhesiva del lado del orificio.Delinee la rejilla recubierta de fomavr con pinzas y colóquela brillante boca arriba para que solo se adhiera a los lados del adhesivo. Esto es para evitar que el fomvar se rompa al quitar la rejilla de la cinta. Coloque la tira de cubierta en una placa estéril de seis pocillos y colóquela en una gota de 10 milímetros de medio de cultivo libre de suero.Debe contener aproximadamente 10 mil células y en este caso, se trata de micrófagos diferenciados de los monocitos humanos. Asegúrese de no tocar la rejilla con la punta del gaitero en el proceso, para no dañar el recubrimiento de fomvar. Incubar durante media hora para que las células se adhieran, luego llenar el pocillo con medio suplementado con suero y volver a incubar durante dos horas, antes de la observación de la MFA.Coloque dos tiras paralelas de cinta adhesiva de doble cara en una placa de Petri con fondo de vidrio, asegurándose de que el ancho entre ellas sea ligeramente menor, en comparación con el diámetro de la rejilla. A continuación, separe la rejilla previamente sembrada con células y colóquela encima de las dos tiras de cinta con las células hacia abajo. Fije la rejilla colocando otras dos tiras encima de las anteriores.Llene el plato con medio de cultivo precalentado complementado con hepe's. Coloque el plato en el calentador de platos previamente configurado a 37 grados centígrados. Instale el conjunto en el escenario AFM.Cuando la temperatura del sistema es estable a 37 grados centígrados, se procede al escaneo de la superficie de fomvar, que debe realizarse en el modo de contacto, con un punto de ajuste de 0,95 nano newton y visualizar las deformaciones asociadas a los protozoos en la ventana de vista de datos de deflexión. Estos son los resultados representativos y los pasos de procesamiento para producir formaciones con AFM a las mediciones gráficas. Como se puede ver en esta imagen, se detectan protuberancias en la superficie del fomvar.Para convertir esta información fotográfica en valores de fuerza, es necesario tener acceso primero a la diferencia alta local. Para ello, se debe restar un ajuste polinómico de tercer grado a su línea de exploración de forma independiente. Luego, el uso de un algoritmo de imágenes dedicado casero permite evaluar los valores de fuerza de protuberancia a partir del mapa de altura de AFM y el modelo mecánico de protrusión mediada por protozoos.Gracias a este procedimiento, podemos investigar los mecanismos implicados en la generación de fuerza de protrusión en los protozoos. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

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