Name: Microscopia de la fuerza de protrusión: Un método para cuantificar las fuerzas desarrolladas por salientes de celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Aprende a cuantificar fuerzas de protrusión celular mediante microscopía de fuerza atómica en podosomas de macrófagos. Este método permite analizar la deformación de películas flexibles y convertirla en valores de fuerza usando un modelo mecánico.

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Los autores agradecemos a Anna Labernadie, Guillaume Charrière y Patrick Delobelle por su contribución inicial a esta obra y a Matthieu Sanchez y Françoise Viala por su ayuda con video filmación y edición. Este trabajo ha sido apoyado por la Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan cáncer, Fundación Toulouse cáncer humano programa de ciencia de frontera (RGP0035/2016).

1. elaboración de rejillas de Formvar recubierto
<ol><li>Limpiar rejillas de microscopia electrónica con acetona pura y seca sobre papel filtro. Luego limpiar el portaobjetos de un microscopio con etanol puro, limpie con un papel de lente y quite el polvo con un soplador.</li>
	<li>Colocar un portaobjetos de vidrio limpieza de etanol verticalmente en el embudo de un dispositivo de colada de película que contiene una solución de Formvar en la parte inferior. Cubrir la parte superior del embudo.</li>
	<li>Bomba de 100 mL de solución de Formvar (0.5% en dicloruro de etileno) con el bulbo atomizador hasta que alcanza las dos terceras partes de la diapositiva.</li>
	<li>Mantener la corredera en la solución durante 1 minuto.</li>
	<li>Abra la válvula del dispositivo para drenar la solución de Formvar en un flujo constante. Un caudal de 10 a 15 mL/s producirá una película de Formvar de 30-80 nm. El espesor de la película se determina por la concentración de la solución de Formvar y por la tasa de drenaje. Nota: La tasa de drenaje puede controlarse por la presión a través de la válvula de salida de aire de ventilación abriendo lentamente la válvula. Más rápido el drenaje, cuanto más gruesa la película. En la práctica, porque es difícil predecir el espesor de la película de la tasa de flujo de Formvar, preparamos varios lotes de películas de Formvar y controlar su espesor por AFM (véase paso 2).</li>
	<li>Retire el portaobjetos de la cámara y secar delicadamente en papel de filtro para eliminar cualquier líquido Formvar.</li>
	<li>Cortar un rectángulo de 20 x 50 mm de la película de Formvar con una cuchilla de afeitar.</li>
	<li>Llene un vaso de precipitados con agua destilada y sumergirse lentamente el portaobjetos verticalmente en el agua para flotar fuera de la película: la película debe flotar sobre la superficie del agua.</li>
	<li>Lugar seco acetona limpia las rejillas en la película, brillante hacia arriba.</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos de vidrio redonda (Ø 12 mm) en algunas de las rejillas. Este cubreobjetos servirá para medir el espesor de la película (véase paso 2).</li>
	<li>Cubrir el portaobjetos de un microscopio con una pegatina blanca cambia el tamaño para colocarlo. Sumerja la diapositiva verticalmente en la frontera de la película de Formvar flotante hasta que toda la película se adhiera al portaobjetos. Quitar exceso de agua de lo portaobjetos con papel de filtro y dejar secar a temperatura ambiente durante la noche.</li>
</ol>2. medición del espesor de la película
<ol><li>Corte el Formvar alrededor el cubreobjetos con las pinzas para separar de la diapositiva.</li>
	<li>Marque la ubicación de la rejilla bajo el cubreobjetos con un lápiz.</li>
	<li>Corte el Formvar alrededor de la rejilla marcada para desprenderse del cubreobjetos. Por lo tanto habrá un agujero en la hoja restante de Formvar, que permitirá medir el espesor de la película. Cubrir el cubreobjetos con PBS y se coloca sobre un portaobjeto en el microscopio.</li>
	<li>Montar un voladizo de nitruro de silicio en el bloque de cristal AFM, asegurándose de que la raya de oro no está cubierta por la punta del muelle. Nota: La sensibilidad y la constante elástica del voladizo deben haberse previamente calibrados en PBS.</li>
	<li>Monte el bloque de vidrio en el módulo AFM y luego colocar el módulo en el microscopio.</li>
	<li>Colocar el cubreobjetos de Formvar recubierto en la cámara de observación y cubrirla con 500 μl de PBS.</li>
	<li>Explorar la frontera del agujero en la hoja de Formvar utilizando AFM en modo de contacto y un punto de ajuste de fuerza de 0.5 nN.</li>
	<li>Utilizar la superficie del cubreobjetos de vidrio como la referencia para la medición de la altura y evaluar el grosor de Formvar que la altura de la sección transversal (realizar al menos 10 mediciones por Formvar lote).</li>
</ol>3. siembra de células en redes
<ol><li>Bajo una campana de estéril, coloque una tira (12 mm x 3 mm) de cinta adhesiva de doble cara en un cubreobjetos.</li>
	<li>Corte una cuadrícula Formvar recubierto con pinzas y ponerlo boca abajo sobre la cinta adhesiva (sólo el borde de la red necesita ser atado a la cinta). La película de Formvar debe enfrentar el cubreobjetos.</li>
	<li>Poner este dispositivo en una cultura así.</li>
	<li>Coloque una gota de 10 μl de RPMI sin FCS que contiene 10 macrófagos4 distinguidos de monocitos humanos16. Nota: Asegúrese de no tocar la red con la punta de la pipeta para evitar dañar el revestimiento de Formvar.</li>
	<li>Incubar durante 30 min (37 ° C, 5% CO2) para dejar que las células se adhieren.</li>
	<li>Llenar el pozo con 2 mL de RPMI con 10% FCS.</li>
	<li>Incubar el dispositivo por 2 h a 37 ° C y 5% CO2 para dejar que las células se adhieren antes de observación AFM.</li>
</ol>4. topografía mediciones de deformaciones inducidas por Podosome
<ol><li>Pegar dos tiras de cinta adhesiva de doble cara en un fondo de cristal plato de Petri. Nota: La distancia entre las dos tiras debe ser más pequeña que el diámetro de la rejilla.</li>
	<li>Cuidadosamente separe la rejilla plateada con los macrófagos de la cinta adhesiva.</li>
	<li>Invierta la red para tener las células hacia el vidrio y la red entre las dos tiras de adhesivo se pega.</li>
	<li>Fijar la rejilla con dos nuevas tiras de adhesivo doble cara: la red así se se intercala entre dos tiras de adhesivo, dejando la zona central de la red de acceso a la punta AFM. Nota: Asegúrese de que la red es bien fija y no doblada; de lo contrario el voladizo AFM no podrían acercarse a la superficie de Formvar.</li>
	<li>Llene la caja Petri con 2 mL de medio de cultivo previamente calentadas 37 ° C (RPMI con 10% FCS) suplementado con 10 mM HEPES (pH 7.4).</li>
	<li>Coloque la placa de cultivo en un calentador de plato de 37 ° C.</li>
	<li>Instale el calentador de plato en el escenario de la AFM.</li>
	<li>Deje que el sistema se estabilice a 37 ° C.</li>
	<li>En modo de contacto con una fuerza de 0,5 nN, hacer una primera imagen global para localizar podosomes y después explorar la topografía de Formvar a 3 Hz con un pixel aproximadamente 20 nm-grande. Nota: Evitar analizar cerca de los bordes de la rejilla.</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Gilbert, P. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Adaptation+to+Biomechanical+Stress+across+Length+Scales+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Forces+Direct+Stem+Cell+Behaviour+in+Development+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Forces+in+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Forces in Cell Biology.</a> Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).</li>
<li>Labernadie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protrusion+Force+Microscopy+Reveals+Oscillatory+Force+Generation+and+Mechanosensing+Activity+of+Human+Macrophage+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343(2014).</li>
<li>Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+Together%3A+Spatial+Synchrony+in+the+Force+and+Actin+Dynamics+of+Podosome+First+Neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors.</a> ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).</li>
<li>Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Force+and+Spatial+Dynamics+of+Macrophage+Podosomes+by+Multi-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking.</a> Methods. 94, 75-84 (2016).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Migration+of+Macrophages+Requires+Hck+for+Podosome+Organization+and+Extracellular+Matrix+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis.</a> Blood. 115, 1444-1452 (2010).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Leukocytes+and+Macrophages+of+Various+Phenotypes+Have+Distinct+Abilities+to+Form+Podosomes+and+to+Migrate+in+3d+Environments%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments.</a> European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).</li>
<li>Guiet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Mesenchymal+Migration+Requires+Podosome+Stabilization+by+Filamin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).</li>
<li>Maridonneau-Parini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Macrophage+3d+Migration%3A+A+Therapeutic+Challenge+to+Limit+Tissue+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Review%22%5BJournal%5D)">Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration.</a> Immunology Review. 262, 216-231 (2014).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+Phosphorylation+of+Wiskott-Aldrich+Syndrome+Protein+%28Wasp%29+by+Hck+Regulates+Macrophage+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).</li>
<li>Van Goethem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Podosomes+Go+3d%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage Podosomes Go 3d.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).</li>
<li>Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Architecture+Dictates+Three-Dimensional+Migration+Modes+of+Human+Macrophages%3A+Differential+Involvement+of+Proteases+and+Podosome-Like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures.</a> Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).</li>
<li>Verollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiv-1+Reprograms+the+Migration+of+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages.</a> Blood. 125, 1611-1622 (2015).</li>
<li>Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podosome+Force+Generation+Machinery%3A+A+Local+Balance+between+Protrusion+at+the+Core+and+Traction+at+the+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring.</a> ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).</li>
<li>Lizarraga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphanous-Related+Formins+Are+Required+for+Invadopodia+Formation+and+Invasion+of+Breast+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells.</a> Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+Diapedesis+Is+Initiated+by+Invasive+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes.</a> Immunity. 26, 784-797 (2007).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Recognition+Is+Facilitated+by+Invadosome-Like+Protrusions+Formed+by+Memory%2FEffector+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells.</a> Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).</li>
<li>Sens, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Invasive+Podosome-Like+Structure+Promotes+Fusion+Pore+Formation+During+Myoblast+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).</li>
<li>Takito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transient+Appearance+of+Zipper-Like+Actin+Superstructures+During+the+Fusion+of+Osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).</li>
<li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
</ol>

No hay conflicto de interés declarado.

Propiedades de los materiales
La elección del material de la membrana deformable, en nuestro caso Formvar, debe cumplir con unos requisitos. El material debe ser transparente a la luz visible y exhiben fluorescencia auto limitada para permitir observaciones en campo brillante y microscopía de fluorescencia. La rugosidad de la capa fina debe estar muy por debajo de 10 nm para evitar efectos topográficos sobre la adhesión celular y para permitir la observación clara de las protu...

Las células animales interactúan físicamente con la matriz y las otras células que constituyen su medio ambiente1. Esto es necesario para que puedan migrar, internalizar cuerpos, adquirir información externa o distinguir. En tales procesos, la célula debe generar fuerzas mecánicas y, como han demostrado numerosos estudios en los últimos años, la capacidad de una célula para generar fuerzas y probe su entorno influye en su comportamiento biológico, dirigir por ejemplo proliferación o diferenciación de2,3. A su vez, la medición de fuerzas celulares es una ayuda importante para estudiar la regulación de la generación de fuerzas y comprender su implicación en la célula comportamiento y tejido destino4,5.
Años recientes han presenciado el desarrollo de numerosas técnicas para medir las fuerzas que una célula puede ejercer sobre su medio ambiente6. La mayoría de ellos ha sido instrumental en revelar que la tracción las fuerzas que las células ejercen como tiran en sondas móviles o un substrato deformable. Sin embargo, las fuerzas mecánicas involucradas en protrusión en el ambiente extracelular sufren de una falta de técnicas de medición y hasta la fecha no bien caracterizado.
Para superar esta limitación, se presenta un método para medir las fuerzas ejercidas ortogonalmente al sustrato. Consiste en las células vivas en una fina lámina elástica que pueden deformarse en la dirección ortogonal, lo que es posible medir la deformación del sustrato por las células y deducir las fuerzas implicadas de la galjanoplastia. Topografía del sustrato se mide con una resolución de nanoescala utilizando microscopía de fuerza atómica y la evaluación de las fuerzas de deformación se basa en el conocimiento de la geometría de las estructuras celulares protrusivo7,8, 9.
Aquí, describimos la configuración y su aplicación para medir las fuerzas generadas por podosomes, estructuras de protrusión de la adherencia, formadas por los macrófagos para su migración mesenquimal en entornos tridimensionales10,11, 12,13,14,15,16,17. Creemos que esta técnica será avanzar en el entendimiento de la generación de fuerzas y su regulación en los procesos celulares que implican protrusión.

<table><tbody><tr><td>Rejillas de níquel de malla 200</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>Pegatinas blancas 26 x 70 mm</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de fundición de película con válvula en su salida</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de afeitar</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>Formvar solución al 0,5% en dicloruro de etileno</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de 12 mm</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fuerza atómica</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>Portamuestras con control de temperatura&nbsp;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>Voladizo de nitruro de silicio con una constante de resorte nominal de 0,01 N/m</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de doble cara</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri con fondo de vidrio de 35 mm</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia de la fuerza de protrusión: un método para cuantificar las fuerzas desarrolladas por salientes de celular

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

En numerosos contextos biológicos, las células animales necesitan interactuar físicamente con su entorno mediante el desarrollo de las fuerzas mecánicas. Entre ellas, las fuerzas de tracción han sido bien caracterizadas, pero hay una falta de técnicas que permite la medición de las fuerzas de protrusión ejercida por células ortogonalmente a su substrato. Se diseñó un montaje experimental para medir las fuerzas de protrusión ejercidas por las células adherentes a su substrato. Células sobre una hoja de Formvar compatible con este sustrato deforman y la topografía resultante se asigna por microscopía de fuerza atómica (AFM) en la escala de nanómetros. Valores de fuerza se extraen luego de un análisis del perfil de deformación basado en la geometría de las estructuras celulares protrusivo. Por lo tanto, las fuerzas ejercidas por las unidades individuales que sobresale de una célula viva pueden medirse con el tiempo. Esta técnica permite el estudio de generación de fuerzas y su regulación en los procesos celulares que implican protrusión. Aquí, Describimos su aplicación para medir las fuerzas protrusivo generadas por podosomes formado por macrófagos humanos.

El protocolo de arriba describe cómo preparar la configuración experimental para cuantificar la fuerza saliente por macrófagos podosomes en un substrato de Formvar. Esto se consigue utilizando AFM y se ilustra en la figura 1.
Al analizar una imagen topográfica de protuberancias debajo de podosomes usando el software de procesamiento de datos JPK, un polinomio de tercer grado ajuste debe restarse de ...

Aquí detallamos las técnicas experimentales usadas para evaluar las fuerzas de la saliente que podosomes aplicar sobre una película compatible con, desde la preparación de la película para el análisis automatizado de imágenes topográficas.

Microscopia de la fuerza de protrusión: Un método para cuantificar las fuerzas desarrolladas por salientes de celular

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar las fuerzas de protrusión utilizando microscopía de fuerza atómica. Esto se logra preparando primero las rejillas recubiertas de fórmula y midiendo el grosor de esta película. El tercer paso de este proceso consiste en asentar las células en las rejillas y dejar que se adhieran.El paso final del procedimiento es obtener imágenes de la película de forma debajo de las células utilizando microscopía de fuerza atómica. Cuando se adhieren al sustrato, los micrófagos forman estructuras de adhesión submicrométricas llamadas podosomas. En última instancia, la deformación de la película utilizada por los podosomas se cuantificará y se convertirá en fuerzas mediante un modelo mecánico casero.Coloque una luz de vidrio limpia con etanol en el dispositivo de fundición de película del embudo y cubra la parte superior del embudo. Desplácese la solución de fomvar hacia arriba en el embudo hasta que el nivel alcance dos tercios del portaobjetos. Déjalo actuar durante un minuto y luego escurre la solución de formvar en un chorro constante.Tenga en cuenta que el espesor de la película depende tanto de la velocidad de flujo como de la concentrac

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Imágenes microscópicas de vida las células endoteliales que expresan GFP-actina permite la caracterización de los cambios dinámicos en las estructuras del citoesqueleto. A diferencia de las técnicas que utilizan las muestras fijadas, este método proporciona una evaluación detallada de los cambios temporales en el citoesqueleto de actina en las células del mismo, antes, durante y después de diversos estímulos físicos, farmacológicos o inflamatorios.

Estudio del citoesqueleto de actina en vivo las células endoteliales que expresan GFP-actina

Este documento demuestra un protocolo para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas por medio de microindentación utilizando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

En este protocolo, se describe un método de la micropipeta para aplicar directamente una fuerza controlada al núcleo en una célula viva. Este ensayo permite interrogatorio de nucleares propiedades mecánicas en la célula viva, adherente.

Un sondeo de la fuerza directa para medir la integración mecánica entre el núcleo y el citoesqueleto

Aquí, presentamos un protocolo basado en la mecánica para interrumpir la conexión de separación de la conexión 43 y medir el impacto posterior que esto tiene en la biomecánica endotelial a través de la observación de tracciones y tensiones intercelulares.

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Este protocolo proporciona instrucciones para implementar litografía multifotópica para fabricar matrices tridimensionales de marcadores fiduciarios fluorescentes incrustados en hidrogeles basados en poli(etilenglicol) para su uso como microscopía de fuerza de tracción libre de referencia y de tracción para su uso como microscopía de fuerza de tracción libre de referencia Plataformas. Usando estas instrucciones, la medición de la tensión de material 3D y el cálculo de las tracciones celulares...

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Aquí, presentamos un protocolo para investigar las propiedades mecánicas intracelulares de células embrionarias aisladas de pez cebra en confinamiento tridimensional con medición directa de la fuerza mediante una trampa óptica.

Mediciones directas de la fuerza de la mecánica subcelular en confinamiento utilizando pinzas ópticas

La plataforma Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) automatiza el proceso de medición simultánea de una amplia variedad de señales químicas y mecánicas en células adherentes. iTACS está diseñado para facilitar el desarrollo impulsado por la comunidad y permitir a los investigadores utilizar todas las características de la plataforma, independientemente de su formación académica.

Kit de herramientas integradoras para analizar señales celulares: fuerzas, movimiento, morfología y fluorescencia

Este protocolo tiene como objetivo medir los parámetros dinámicos (protuberancias, retracciones, volantes) de las protuberancias en el borde de las células que se propagan.

Medición de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación mediante microscopía de células vivas

Para avanzar, los conos de crecimiento deben ejercer fuerzas de tracción contra el entorno externo. La generación de fuerzas de tracción depende de la dinámica de la actina y el acoplamiento del embrague. El presente estudio describe métodos para analizar la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y las fuerzas de tracción para el avance del cono de crecimiento.

Análisis de la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y la fuerza de tracción para el avance del cono de crecimiento

Describimos mejoras en un método estándar para medir las fuerzas de tracción celular, basado en la impresión de microcontacto con un solo paso de patrón sustractivo de matrices de puntos de proteínas de matriz extracelular en hidrogeles blandos. Este método permite una fabricación más simple y consistente de patrones de islas, esencial para controlar la forma del grupo celular.

Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

Aprende a cuantificar fuerzas de protrusión celular mediante microscopía de fuerza atómica en podosomas de macrófagos. Este método permite analizar la deformación de películas flexibles y convertirla en valores de fuerza usando un modelo mecánico.

Microscopia de la fuerza de protrusión: Un método para cuantificar las fuerzas desarrolladas por salientes de celular

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