Un sondeo de la fuerza directa para medir la integración mecánica entre el núcleo y el citoesqueleto

En este protocolo, se describe un método de la micropipeta para aplicar directamente una fuerza controlada al núcleo en una célula viva. Este ensayo permite interrogatorio de nucleares propiedades mecánicas en la célula viva, adherente.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la mecánica nuclear. Por ejemplo, ¿cuál es la fuerza necesaria para deformar el núcleo de una célula? ¿Cuáles son las contribuciones de los componentes celulares y nucleares a la resistencia nuclear a la deformación?

¿O el acoplamiento nuclear con las estructuras celulares varía según el tipo de célula? La principal ventaja de esta técnica es que nos permite aplicar fuerza de sondeo para deformar el nucleo-citoesqueleto integrador en una célula adherente viva. Aunque este método se ha utilizado para proporcionar información sobre las propiedades mecánicas nucleares en las células NIH-3T3, también se puede aplicar a cualquier tipo de célula adherente, como el sondeo de las propiedades mecánicas nucleares en las células progeriales de Hutchinson-Gilford.

Para comenzar este procedimiento, cubra un plato con fondo de vidrio de 35 milímetros con 5 microgramos por mililitro de fibronectina. A continuación, cultive las células de fibroblastos NIH 3T3 en DMEM suplementado con un 10 % de suero bovino donante y un 1 % de penicilina-estreptomicina en la placa recubierta a 37 grados centígrados hasta la confluencia deseada. Inmediatamente antes del experimento, lave las células dos veces con PBS, seguido de un solo lavado con medio de crecimiento completo.

Luego, agregue tres mililitros de medio de crecimiento completo a un plato con fondo de vidrio. En este procedimiento, encienda el microinyector. Con un gotero de aceite de inmersión, aplique una gota de aceite de inmersión en la lente del objetivo.

Luego, sujete el plato firmemente al soporte del plato y cargue el soporte del plato en el escenario. Tenga en cuenta que las células deben mantenerse a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante todo el experimento. A continuación, ajuste la altura del objetivo para enfocar las celdas.

Mueva la platina del microscopio para encontrar una celda de interés. Con el micromanipulador, mueva el soporte de pipetas a la posición más alta. A continuación, cargue la micropipeta con una punta de 0,5 micrómetros de diámetro en el soporte de pipetas.

A continuación, eleve el plano focal del objetivo por encima del plano A y la parte superior de la celda hasta el plano B ajustando el control fino. A continuación, coloque el micromanipulador en la posición de control grueso. Baje lentamente la micropipeta hasta el plano B observando la silueta de la micropipeta hasta que la micropipeta esté completamente enfocada.

Una vez que la punta de la micropipeta esté enfocada, ajuste el micromanipulador al control fino. A continuación, baje el objetivo hasta el plano ecuatorial de la célula y baje la micropipeta a unos 15 micrómetros por encima de él. Ajuste la presión de compensación en el microinyector a la presión deseada.

Espere varios segundos para que la presión se estabilice. Es importante comprobar si la punta de la pipeta está rota u obstruida, de lo contrario, la medición de la fuerza sería inexacta. Asegúrese de que la micropipeta no se obstruya utilizando el ajuste de limpieza en el panel del micromanipulador y asegúrese de que las burbujas de aire salgan de la punta de la micropipeta.

A continuación, inserte la punta de la micropipeta en la célula hasta que toque ligeramente la superficie nuclear. Cree un sello entre la punta de la micropipeta y la membrana nuclear desconectando el tubo de suministro de presión del sistema de microinyección, abriendo así el extremo de la micropipeta a la atmósfera. Este paso crea una presión negativa igual a la presión de compensación en la superficie nuclear.

A continuación, abra el software de recopilación de imágenes. Configure una adquisición AVI para vídeo o una adquisición ND para imágenes en el software de recopilación de imágenes. A continuación, cambie al canal de imágenes fluorescentes correspondiente y comience a tomar imágenes.

Aleje la punta de la micropipeta del cuerpo de la célula hasta que el núcleo se desprenda de la micropipeta. Esta figura muestra el forzamiento del núcleo de un fibroblasto de ratón NIH 3T3. A medida que la punta de la micropipeta se mueve hacia la derecha, el núcleo se deforma y finalmente se separa de la punta de la micropipeta.

Se observa que la tensión de la longitud del núcleo aumenta con el aumento de la fuerza de succión. El borde frontal del núcleo forma una protuberancia nuclear y el borde posterior se desplaza de su posición original. La longitud de la protuberancia es mucho mayor que el desplazamiento del borde de fuga, lo que sugiere una estrecha integración entre el núcleo y el citoplasma circundante.

Las escalas de tiempo son cortas para la relajación del borde frontal nuclear y el borde posterior nuclear. Se utilizó una sonda de fuerza directa para determinar la contribución de las estructuras intranucleares y citoesqueléticas a la resistencia del núcleo a la deformación. Las imágenes fluorescentes mostraron la superposición del núcleo antes y después en la condición indicada.

Si bien no se encontraron diferencias significativas en la deformación o traducción nuclear después de la interrupción de la actina F o la interrupción de los microtúbulos, la reducción de la expresión de menten a través de la deformación basada en siRNA resultó en una traducción y deformación nuclear significativamente mayores. Esto sugiere que los filamentos intermedios de los fibroblastos son el principal elemento citoesquelético que ayudó al núcleo a resistir la fuerza local. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar una fuerza controlada y conocida al núcleo de una célula adherente viva.