Name: Calorespirometry: Es un enfoque potente y no invasivo para investigar el metabolismo energético celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprende calorespirometría para analizar el metabolismo energético celular mediante la medición simultánea de consumo de oxígeno y producción de calor. Este método no invasivo evalúa vías aeróbicas y anaeróbicas en muestras biológicas.

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Este trabajo fue financiado en parte por la subvención de la National Science Foundation 160944 Mary E. Konkle y Michael A. Menze.

1. cultivo celular
<ol><li>Mantener las células del carcinoma (HepG2) hepatocelular humano en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y sustratos adicionales (10 mM de glucosa, glutamina 2 mM y 1 mM piruvato) a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular (5% CO2 , 95% aire, 100% de humedad). Nota: Utilice la anterior formulación de DMEM al DMEM se hace referencia en pasos posteriores para la respirometría y calorimetría.</li>
	<li>La placa de las celdas de 1 x 106 células por placa de 100 mm cultura y subcultura cada 7 días o antes de llegar a 90% de confluencia y renovar el medio cada 3-4 días.</li>
	<li>Realizar los experimentos cuando las células son confluentes de 60-80%.</li>
</ol>2. preparación del respirómetro y calorímetro
<ol><li>Pipeta, 2,2 mL de DMEM en la cámara del respirómetro, inserte el tapón y ajustar con la herramienta de espaciador tapón para permitir la difusión óptima del oxígeno del aire al medio.</li>
	<li>Revolver continuamente a 37 ° C hasta que la concentración de oxígeno (trazo azul) y el flujo de oxígeno (trazo rojo) son estables. Asegúrese de que software del respirómetro está programado para tener en cuenta la solubilidad de oxígeno de los medios utilizados en el experimento. Nota: Los diferentes medios de comunicación tienen coeficientes de solubilidad de oxígeno diferentes (por ejemplo, DMEM = 0,92).</li>
	<li>Después de la estabilización de la concentración de oxígeno en DMEM con la cámara abierta, seleccionar una parte estable de la traza de la concentración de oxígeno y calibre para la saturación del aire del 100%.</li>
	<li>Calibrar el 0% de oxígeno seleccionando una porción estable de la traza de la concentración de oxígeno cuando no hay oxígeno presente en la cámara. Realizar este paso después de 20 valoración de μl de Ditionito de sodio 230 mM o después de que todo el oxígeno es consumido por la muestra biológica al final de un experimento.</li>
	<li>Después de la calibración de aire del 100% del respirómetro, cerrar el tapón y asegúrese de que no hay burbujas están presentes en la cámara. Nota: un ligero aumento en el flujo de oxígeno será detectado en la cámara cerrada como el sensor de oxígeno polarográfico (POS) consume oxígeno para medir la presión parcial de oxígeno.</li>
	<li>Después de ~ 10 minutos del obturador se cierra, confirman que el respirómetro está listo para las células HepG2 mediante la observación de un flujo de oxígeno estable. Nota: El calorímetro utilizado aquí utiliza ampollas de acero inoxidable y requiere una ampolla que se utilizará como referencia.</li>
	<li>Añadir 2,5 mL de H2O (dH2O) [volumen igual que las muestras (paso 4)] a la ampolla de la referencia del calorímetro y apriete la tapa, usando alicates de ser necesario. Limpiar la ampolla sellada con flujo de aire y baje lentamente la ampolla hasta la posición 1 en el canal de referencia del calorímetro. Permanecen en la posición 1 hasta que se prepara la muestra biológica.</li>
</ol>3. preparación de células HepG2 de respirometría y calorimetría
<ol><li>Confirmar que el respirómetro calorímetro preparado y calibrado. DMEM y tripsina a 37 ° C en un baño de agua.</li>
	<li>Agregar DMEM fresca placa de 100 mm y de lugar en la incubadora para permitir el equilibrio del medio de CO2 y temperatura. Nota: Este medio se usará para el experimento de calorimetría, así que el volumen adecuado depende de la cantidad de ampollas que se utilizará.</li>
	<li>Confirmar con un microscopio invertido de luz que las células en el confluente de 60-80%, luego lavar el 100 mm placa de 2 x con 10 mL de temperatura ambiente con tampón fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Añadir 3 mL de la tripsina de 37 ° C en la placa de 100 mm de las células y les incube durante 7-10 min a 37 ° C en la incubadora de la cultura de célula. Neutralizar la tripsina con 3 mL de DMEM de 37 ° C y suspender por suavemente pipeteo ~ 20 veces con una pipeta de 5 mL.</li>
	<li>Transferir los 6 mL de células resuspendidos en DMEM y tripsina en un tubo cónico de 15 mL estéril y centrifugar por 5 min a 175 x g. quitar el líquido sin perturbar el sedimento celulares.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en ~ 5 mL de DMEM y pipetee cuidadosamente para asegurar las células son suficientemente disociados uno del otro.</li>
	<li>Quitar el ~ 100 μl de la muestra bien mezclada y realizar un conteo minucioso utilizando todos los campos de 8 en un hemocitómetro para determinar el número total de células. Luego calcular el volumen de resuspensión de las células para generar ~ 2 x 106 células por μl 50. Nota: Esto asegurará que el 2 x 106 células se añaden a cada cámara del respirómetro con mínimo desplazamiento medio.</li>
	<li>Centrifugar las células durante 5 min a 175 x g. Resuspender el pellet en el volumen calculado de DMEM de paso 3.7.</li>
	<li>Realizar un conteo para determinar el volumen requerido para inyectar 2 x 106 células por cámara en el respirómetro (esto debe ser ~ 50 μL). Almacenar las células para la medición respirométricos en hielo hasta que esté listo.</li>
	<li>Mientras que la muestra concentrada de células es en el hielo, determinar la dilución requerida para producir una concentración de 1 x 105 células/mL para la calorimetría.</li>
	<li>Mezclar bien la muestra y preparar 3 mL de las células 1 x 105 células/ml de DMEM cada ampolla. Nota: El DMEM utilizado para la dilución de la muestra debe ser el medio equilibrado preparado en el paso 3.3.</li>
</ol>4. calorimetría
<ol><li>Asegúrese de que calorímetro está conectado a la computadora y la señal calorimétrica en μW es observable y estable.</li>
	<li>Añadir 2,5 mL de células 1 x 105 células/ml (~2.5 x 105 células) para cada ampolla, asegurando suficiente aire entre la tapa de la ampolla y el medio para permitir la difusión del gas.</li>
	<li>Inmediatamente apriete el tapón, usando alicates de ser necesario. Limpiar la ampolla sellada, con flujo de aire para remover cualquier suciedad externa y baje lentamente la ampolla hasta la posición 1 del calorímetro. Registrar el tiempo de que la ampolla se baja hasta la posición 1.</li>
	<li>Permiten la ampolla a sentarse en la posición 1 durante 15 minutos. Nota: Durante este período de 15 minutos, las células son para ser inyectada en el respirómetro (paso 5). Esto asegura que el mismo intervalo de tiempo se utiliza para la producción de calor y consumo de oxígeno cuando se determina la proporción de CR.</li>
	<li>Después de 15 minutos en posición 1, baje lentamente la referencia y la muestra ampollas en la posición 2. Registrar el tiempo que las ampollas fueron bajados y medida para por lo menos 30 minutos.</li>
</ol>5. respirometría
<ol><li>Durante el intervalo de 15 minutos en el que la ampolla está en la posición 1 en el calorímetro, comienzan los estudios respirométricos.</li>
	<li>Mezclar bien la muestra de células mediante pipeteo para asegurar una solución homogénea e inyectar < 50 μl de la muestra de células en cada compartimiento del respirómetro para una concentración final de 2 x 106 células/cámara. Registrar el tiempo que las células se inyectan en el respirómetro.</li>
	<li>Después de la inyección, las células HepG2 se revuelven continuamente a 37 ° C. Espere por lo menos 20-30 min para ambos una estabilización del flujo de oxígeno y una constante disminución en la concentración de oxígeno.</li>
	<li>Seleccione la ficha de flujo de O2 por la V a la derecha de la pantalla, resalte una parte estable del flujo de oxígeno. Seleccione marcas, entonces las estadísticas y datos de registro para el flujo de O2 por V. Esta grabación se utilizará en el cálculo de la proporción de CR. Nota: Los pasos 5.5 y 5.6 son opcionales. Respiración de fuga y máxima respiración desacoplada se revelará por titulaciones de oligomycin y FCCP.</li>
	<li>Inyectar 1 μl de oligomycin 4mg/mL en cada cámara y permiten ~ 10 minutos para la estabilización del flujo de oxígeno. Tasa de respiración de fuga estable registro siguiendo los pasos realizados en 5.4 poniendo una porción estable de la traza de flujo de oxígeno después de la adición de oligomycin.</li>
	<li>Valorar las inyecciones de 2 μl de 0,2 mM FCCP en cada cámara, permitiendo para la estabilización del flujo de oxígeno después de cada inyección. Continuar con las valoraciones hasta que se alcanza el flujo máximo, según lo indicado por un ligero descenso en la valoración posterior del FCCP. Registrar la frecuencia de respiración estable durante el flujo máximo.</li>
</ol>6. cálculo del coeficiente de Calorespirometric de
<ol><li>Realizar un conteo final de las muestras preparadas en ~ 1 x 105 células/mL, utilizando todos los campos de un hemocitómetro para determinar el número total de células a la ampolla (2,5 mL) 8.</li>
	<li>Determinar un tiempo récords medidas del calorímetro y respirómetro que estable las señales están presentes en momentos idénticos. Referencia el tiempo registrado cuando la ampolla fue bajada a la posición 2 y el tiempo de la inyección de células en el respirómetro.</li>
	<li>Grabar la producción de calor colocando el cursor sobre la traza muestra salida de calor para la ampolla respetada en el momento determinado en el paso y expresa como μW/millón de células. Recoger datos de consumo de oxígeno y garantizar que se expresa como pmol O2 x s-1 x millones de células.</li>
	<li>Para calcular la proporción de CR, primero convertir MW a kJ/s y luego dividir kJ/s sobre mol de O2/s para obtener la relación CR expresada en kJ/mol O2. Nota: La proporción de CR se presenta en kJ/mol O2. (véase la <a href="/files/ftp_upload/57724/JoVE_Supplemental_File.docx" target="_blank">archivo adicional 1</a>)</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El objetivo de calorespirometry es evaluar cuantitativamente la contribución de las vías aeróbicas y anaeróbicas a actividad metabólica y obtener una vista compuesta de flujo de la energía celular. Esto se logra mediante una medición simultánea de la disipación de calor y flujo de oxígeno, seguido por una comparación de la proporción de CR calculada con la oxycaloric teórica equivalente. Deben considerarse varios pasos críticos para datos reproducibles y confiables. El mantenimiento de un cultivo celular estéril y saluda...

En los sistemas biológicos, el cambio de la liberación de calor o entalpia durante el metabolismo suele ser supervisado ya sea directamente (vía directa calorimetría) o indirectamente por el consumo de O2 y CO2 producción (mediante respirometría). Desafortunadamente, cuando estas técnicas se utilizan en el aislamiento, información crítica se pierde, como la contribución de las vías anaerobias al metabolismo celular. Calorespirometry es una técnica poderosa que se basa en la medición simultánea de la disipación de calor y respiración. Calorespirometric labor pionera investigó el metabolismo anaerobio en células de mamífero totalmente oxigenadas y demostrado aportes simultáneos de las vías aeróbicas y anaeróbicas a la homeostasis de la energía a pesar de las células transformadas en un ambiente completamente oxigenada1. Calorespirometry desde entonces se ha aplicado a una amplia variedad de cuestiones biológicas. Algunos ejemplos incluyen el estudio de la energía animal en niveles bajos de oxígeno, los efectos del herbicida y estrógeno en las branquias de bivalvos, el metabolismo de organismos terrestres y la descomposición microbiana del suelo orgánico materia2, 3 , 4 , 5 , 6. Además, calorespirometry ha reveló cómo metabólica preacondicionamiento antes de congelación mejora la crioconservación de mamíferos las células7. Cada enfoque, calorimetría y respirometría, independientemente se ha incrementado nuestro conocimiento de la bioenergía celular y organismo. Sin embargo, cuestiones biológicas fundamentales que pueden ser contestadas mediante el uso de calorespirometry permanecen relativamente inexploradas.
Ley de Hess establece que el cambio total de entalpía de una reacción es independiente de la vía entre los Estados iniciales y finales. Por ejemplo, el cambio de entalpía total de un camino bioquímico es la suma del cambio en entalpías de todas las reacciones dentro de la vía. Calorimetría ofrece un enfoque en tiempo real para medir la producción de calor celular, que detecta indiscriminadamente las vías aeróbicas y anaeróbicas. Esto se basa en la Fundación que ninguna energía se intercambia en el sistema excepto a través de las paredes de la ampolla experimental8. Un cambio en la disipación de calor es igual al cambio en entalpía liberada de todas las reacciones metabólicas en la ampolla. Así, una entalpía negativa se corresponde con una pérdida de calor del sistema. Investigación exhaustiva sobre las últimas cuatro décadas ha caracterizado el paisaje termodinámico de catabolismo y anabolismo. Esto está representado por un aumento sostenido en los artículos de investigación en los términos de búsqueda "biológicos" y "calorimetría" como indexadas por los Estados Unidos Biblioteca Nacional de medicina (NLM) en los institutos nacionales de salud (PubMed). La búsqueda revela antes de 1970, un total de 27 publicaciones referencia calorimetría biológica; mientras tanto, en el 2016 solo, 546 publicaciones utilizan la técnica.
Calorimétricas métodos están bien establecidos para determinar la producción de calor. Sin embargo, se otorga mayor flexibilidad para resolver el valor respirométricos. La medición respirométricos puede consistir en O2, CO2, o ambos O2 y CO2. Además, la medición de O2 o CO2 puede lograrse mediante varias técnicas, incluyendo optrodes, electrodos tipo Clark y absorción de láser de diodo sintonizable espectroscopia de9,de7,10 ,11. Mientras que la producción de CO2 es una medida valiosa en muchos estudios respirométricos, el medio para las células cultivadas a menudo utiliza un sistema bicarbonic para control de pH12,13. Para evitar las complicaciones de la medición de CO2 en el sistema del bicarbonato, el siguiente protocolo para la calorespirometry de las células en cultivo utiliza O2 como único parámetro respirométricos.
Concurrente con la medición de flujo de oxígeno, ciertos respirometers (véase Tabla de materiales) están diseñados para evaluaciones detalladas de la función mitocondrial. Protocolos (traje) de sustrato-uncoupler-inhibidor-titulaciones están bien establecidos y son compatibles con experimentos diseñados para medir la membrana potencial o reactivas de oxígeno (ROS) las especies formación14. El protocolo presentado para calorespirometry de las células intactas es compatible con la introducción de uncouplers químicos como cianuro de carbonilo-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) y el F0F1-ATP sintasa inhibidor oligomycin. Mediante la adición de FCCP, consumo de oxígeno puede ser desacoplado de la producción de ATP, que es útil para evaluar el impacto de la terapéutica potencial en el funcionamiento mitocondrial15. Además, la adición de oligomycin ilumina el grado de respiración de escape. Así, las mediciones respirométricos realizadas durante calorespirometry son compatibles con protocolos extenso diseñados para aclarar más lejos la fisiología mitocondrial.
La medida simultánea de la disipación de calor y flujo de oxígeno permite el cálculo de la relación calorespirometric (CR). Este cociente se compara constante de Thornton o la oxycaloric teórica equivalente, que oscila entre-430 a-480 kJ mol-1 dependiendo de la línea de células o tejidos de interés y el carbón suplido sustratos1, 16. por lo tanto, una relación más negativa de CR revela aumento de las contribuciones de vías anaeróbicas a la actividad metabólica general. Por ejemplo, la proporción de CR para la respiración de los tejidos musculares rutina sin el desempeño activo de trabajo oscila entre-448 y-468 kJ mol-1, que es dentro de la gama del oxycaloric teórico equivalente17,18. Mientras tanto, las células del cáncer mamíferos cultivadas en medio alto en glucosa Mostrar mayor ácido láctico fermentación después de glicolisis y relativamente baja participación mitocondrial19. Este resultados de fenotipo en las tasas de CR en la gama de-490 a-800 kJ mol-1, demostrando una mayor implicación de las vías anaerobias en el metabolismo celular como indica más negativas CR ratios1,7, 16,20.
Distribuidores de células y tejidos tanto comerciales como sin fines de lucro actualmente oferta de líneas de celulares de más de 150 especies, con casi 4.000 líneas celulares derivan de los seres humanos. Líneas celulares inmortalizadas son herramientas convenientes para la evaluación rápida de la toxicidad de la terapéutica potencial, muchos de los cuales pueden interferir directa o indirectamente con las funciones mitocondriales. Usando las células transformadas durante la detección de drogas puede ser un valor predictivo limitado en parte debido al efecto de Warburg, un rasgo distintivo de muchos cánceres. A menudo, los cánceres generan ATP fosforilación a nivel de sustrato y equilibrio redox a través de la producción de lactato sin comprometer completamente la mitocondria bajo condiciones aerobias19. Desarrollo farmacéutico es muy costoso e ineficiente, con 8 de los 9 compuestos probados en ensayos clínicos en humanos no lograr la aprobación de mercado21. Mientras que la terapéutica potencial puede pasar revisión inicial debido a la baja citotoxicidad en líneas celulares, es posible que algunos de estos compuestos son mitotoxic. Sin un método adecuado para detectar cómo estas toxinas pueden afectar el balance de energía en las células primarias que no muestran el efecto de Warburg, información crítica suele ser alto, cuellos de botella desarrollo terapéutico en fases tempranas.
Calorespirometry es un enfoque práctico, no invasivo para analizar la actividad metabólica en una variedad de muestras biológicas, incluidas las células y los tejidos. El núcleo del protocolo presentado es compatible con una gama de aplicaciones. Una complicación, sin embargo, ha sido identificada. Las células inmortalizadas a menudo se cultivan en un medio libre de glucosa con la galactosa para aumentar la contribución de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) para la producción de energía, con el fin de sensibilizar las células a potenciales mitotoxins22, 23. Esta reprogramación metabólica parece oscurecer el análisis cuando las muestras se colocan en las ampollas de acero inoxidable utilizados por el calorímetro15. Las células cultivadas en un medio de glucosa seguirán en alta actividad metabólica durante varias horas. Mientras tanto, las células cultivadas en medio de galactosa disminuyen la producción de calor dentro de 30 minutos de su colocación en la ampolla, de realizar medidas de restringido a puntos del tiempo experimental temprana. Este comportamiento, desafortunadamente, impide la oportunidad de evaluar su proliferación celular. A pesar de esta limitación específica, mayoría de las aplicaciones es compatible con el análisis de calorespirometric y toda la información metabólica puede obtenerse a través de este enfoque.

<table><tbody><tr><td>Células HepG2 Colección</td> de <td>cultivos tipo americano</td><td>HB-8065</td><td>Células utilizadas para calorespirometría</td></tr><tr><td>O2k-Respirómetro</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10022-02</td><td>Respirómetro</td></tr><tr><td>LKB 2277 monitor de actividad térmica (TAM)</td><td>Termométrico AB</td><td></td><td>Thermometric fue adquirida por TA Instruments</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio (100 mM)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11360070</td><td>Solución 100x añadida al medio DMEM</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino - Premiuim Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Añadido al 10% en medio DMEM</td></tr><tr><td>Trypsn-EDTA (0,25%)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td>Reactivo de disociación celular</td></tr><tr><td>Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>O4876</td><td>Inhibidor mitocondrial</td></tr><tr><td>Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona</td><td>Sigma</td><td>Aldrich C2920</td><td>Desacoplador mitocondrial</td></tr><tr><td>Corning 100 mm Placa de cultivo tratada con TC</td><td>Corning Corporation 430167</td><td></td><td>Placa de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Glucosa, polvo</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15023021</td><td>Glucosa para medio DMEM</td></tr><tr><td>Galactosa, en polvo</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP656500</td><td>Galactosa para medio DMEM</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Glutamina para medio</td></tr><tr><td>DMEM DMEM, sin glucosa</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td>11966025 Medio de cultivo celular</td></tr></tbody></table>

calorespirometry: es un enfoque potente y no invasivo para investigar el metabolismo energético celular

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Muchas líneas celulares utilizadas en la investigación biológica y biomédica básica mantienen la homeostasis de la energía a través de una combinación de respiración aerobia y anaerobia. Sin embargo, la medida en que ambas vías contribuyan al paisaje de la producción de energía celular es constantemente pasado por alto. Las células transformadas se cultivan en los niveles de glucosa se satura a menudo muestran una dependencia disminuida en la fosforilación oxidativa para la producción de ATP, que es compensada por un aumento en la fosforilación a nivel de sustrato. Este cambio en el equilibrio metabólico permite a las células de proliferar a pesar de la presencia de las toxinas mitocondriales. En descuidar el equilibrio metabólico alterado de las células transformadas, los resultados de una investigación farmacéutica puedan ser mal interpretados desde el potencialmente efectos mitotoxic no pueden ser detectadas utilizando modelo de líneas de celulares cultivado en presencia de glucosa alta concentraciones. Este protocolo describe el apareamiento de dos poderosas técnicas, respirometría y calorimetría, que permite la evaluación cuantitativa y no invasiva de contribuciones aeróbicas y anaeróbicas a la producción de ATP celular. Respiración aerobia y anaerobia genera calor, que puede ser monitoreados mediante calorimetría. Mientras tanto, medir la tasa de consumo de oxígeno puede evaluar el grado de respiración aeróbica. Disipación de calor y consumo de oxígeno se miden al mismo tiempo, se puede determinar la relación calorespirometric. Puede entonces compararse con el valor experimentalmente obtenido el oxycaloric teórico equivalente y la amplitud de la respiración anaerobia puede ser juzgada. Así, calorespirometry ofrece un método único para analizar una amplia gama de cuestiones biológicas, incluyendo el desarrollo de medicamentos, crecimiento microbiano y bioenergéticas fundamentales bajo condiciones hipóxicas y normoxic.

La reproducibilidad de las mediciones de calorespirometric depende de una preparación adecuada y constante. Muestras preparadas a partir de cultivos celulares deben no utilizarse si las placas son muy crecidas, como recuentos de células pueden ser inexactos debido a la aglutinación. Además, flujos de calor reducida debido a la difusión limitada de sustrato en las células agrupadas pueden ocurrir. Por lo tanto, al utilizar células adherentes, es fundamental seleccionar una placa con la confluencia entre 60-80% y cambiar e...

Este protocolo describe calorespirometry, la medición directa y simultánea de disipación de calor y la respiración, lo que proporciona un enfoque no invasivo para evaluar el metabolismo energético. Esta técnica se utiliza para evaluar la contribución de las vías aeróbicas y anaeróbicas para utilización de la energía mediante el control del flujo total de energía celular.

Calorespirometry: Es un enfoque potente y no invasivo para investigar el metabolismo energético celular

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Los objetivos generales de este procedimiento son analizar la actividad metabólica de una muestra biológica y determinar en qué medida las vías anaeróbicas contribuyen a la producción de energía celular dentro de la muestra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo farmacéutico sobre el alcance de la toxicidad mitocondrial durante el desarrollo de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que facilita la medición simultánea del consumo de oxígeno y la producción de calor en una muestra celular de interés.Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la planificación del tratamiento durante el desarrollo farmacéutico. También se puede aplicar a otros campos, como la cirobiología, en los que se pueden evaluar los efectos del precondicionamiento metabólico en la criopreservación. Para preparar el respirómetro, primero agregue dos mililitros de DMEM a cada cámara del respirómetro e inserte completamente los tapones.Ajuste los tapones con una herramienta espaciadora de tapones para permitir una difusión óptima del oxígeno al medio, y configure las cámaras para agitar continuamente las muestras a 750 rpm a 37 grados Celsius hasta que la co

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Una descripción de un método para crear perfiles de la función mitocondrial en las células se proporciona. El perfil de las mitocondrias generan proporciona cuatro parámetros de la función mitocondrial que se puede medir en un experimento: la tasa de respiración basal, la respiración ATP-linked, fuga de protones, y la capacidad de reserva.

Experimento perfil bioenergético utilizando células C2C12 mioblastos

Los métodos presentados proporcionan instrucciones paso a paso para la realización de una colección de ensayos respirométricos basados en microplacas utilizando mitocondrias aisladas de cantidades mínimas de músculo esquelético de ratón. Estos ensayos son capaces de medir los cambios/adaptaciones mecanicistas en el consumo de oxígeno mitocondrial en un modelo animal comúnmente utilizado.

Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias

De alta resolución de respirometría se utiliza para determinar el consumo de oxígeno mitocondrial. Se trata de una técnica sencilla para determinar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial '(I-IV) la frecuencia respiratoria, la capacidad del sistema de transporte de electrones mitocondrial máxima, y ​​la integridad de la membrana mitocondrial externa.

-Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

El objetivo de este protocolo es medir el efecto de la glucosa mediada por cambios en la respiración mitocondrial en presencia de compuestos naturales en las células beta de la intacta 832/13 mediante respirometría de alta resolución.

Respirometría de alta resolución para medir la función mitocondrial de las células intactas de Beta en presencia de compuestos naturales

La evaluación de la fosforilación oxidativa utilizando respirómetros de alta resolución se ha convertido en una parte integral del análisis funcional de las mitocondrias y el metabolismo energético celular. Aquí, presentamos protocolos para el análisis del metabolismo energético celular utilizando respirómetros de alta resolución basados en cámaras y microplacas y discutimos los beneficios clave de cada dispositivo.

Respirometría de alta resolución para evaluar la bioenergética en células y tejidos utilizando respirómetros basados en cámaras y placas

El estado metabólico de las células epiteliales pigmentarias de la retina humana (H-RPE) refleja su salud y función. Aquí se presenta un protocolo optimizado para examinar el flujo metabólico en tiempo real de H-RPE utilizando respirometría de alta resolución.

Análisis en tiempo real de la bioenergética en células epiteliales pigmentarias de la retina humana primaria mediante respirometría de alta resolución

Aquí, describimos un método integral para medir la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras de músculo esquelético permeabilizadas frescas a partir de músculo humano o de ratón. Este método permite la cuantificación en tiempo real de la respiración mitocondrial y la evaluación de la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica, al tiempo que preserva las redes mitocondriales existentes y la integridad de la membrana.

Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución

El abuso del alcohol perjudica la inmunidad de los macrófagos alveolares (AM) debido a la supresión de la respiración mitocondrial y la bioenergética. Recientemente demostramos que la exposición al etanol (EtOH) aumenta la dependencia de la glutamina para la respiración mitocondrial en los AM. En este artículo, se proporcionan métodos para determinar el uso de glutamina para la respiración mitocondrial en AM tratados con EtOH utilizando un bioanalizador de flujo extracelular.

Evaluación de la glutamina como fuente de combustible para macrófagos alveolares expuestos a etanol crónico utilizando un bioanalizador de flujo extracelular

Presentamos un método no invasivo y en tiempo real para monitorizar la salud mitocondrial utilizando la espectroscopía Raman por resonancia (RRS). Utilizamos RRS para cuantificar los estados redox mitocondriales y desarrollamos una métrica para la salud mitocondrial, la Resonancia Raman reduce la relación mitocondrial (3RMR), que muestra una respuesta más rápida a los cambios en la oxigenación que los analitos hemato-gases tradicionales.

Evaluación en tiempo real y no invasiva de la función mitocondrial mediante espectroscopía Raman por resonancia

En este informe se describe la piel en tres dimensiones reconstruir el modelo que imita la piel humana en la arquitectura y la composición. Fisiología de los melanocitos, la progresión del melanoma y el destino de las células madre dérmicas han sido investigados con la piel reconstruir el modelo. El modelo es también útil como una herramienta para la evaluación preclínica de medicamentos.

La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo: una herramienta para estudiar la piel normal y la progresión del melanoma

Aprende calorespirometría para analizar el metabolismo energético celular mediante la medición simultánea de consumo de oxígeno y producción de calor. Este método no invasivo evalúa vías aeróbicas y anaeróbicas en muestras biológicas.

Calorespirometry: Es un enfoque potente y no invasivo para investigar el metabolismo energético celular

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