Calorespirometry: Es un enfoque potente y no invasivo para investigar el metabolismo energético celular

Los objetivos generales de este procedimiento son analizar la actividad metabólica de una muestra biológica y determinar en qué medida las vías anaeróbicas contribuyen a la producción de energía celular dentro de la muestra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo farmacéutico sobre el alcance de la toxicidad mitocondrial durante el desarrollo de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que facilita la medición simultánea del consumo de oxígeno y la producción de calor en una muestra celular de interés.

Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la planificación del tratamiento durante el desarrollo farmacéutico. También se puede aplicar a otros campos, como la cirobiología, en los que se pueden evaluar los efectos del precondicionamiento metabólico en la criopreservación. Para preparar el respirómetro, primero agregue dos mililitros de DMEM a cada cámara del respirómetro e inserte completamente los tapones.

Ajuste los tapones con una herramienta espaciadora de tapones para permitir una difusión óptima del oxígeno al medio, y configure las cámaras para agitar continuamente las muestras a 750 rpm a 37 grados Celsius hasta que la concentración de oxígeno y el flujo de oxígeno sean estables. Confirme que el software del respirómetro está programado para tener en cuenta la solubilidad del oxígeno del medio utilizado en el experimento. A continuación, seleccione una porción estable de la traza de concentración de oxígeno y calibre esta parte para una saturación de aire del 100%.

Ahora, cierre los tapones, teniendo cuidado de que no haya burbujas en las cámaras. Después de unos 10 minutos, se debe observar un flujo de oxígeno estable. Para prepararse para la calorimetría, primero agregue dos coma cinco mililitros de agua desionizada a la ampolla de referencia, luego apriete la tapa.

Con una bomba de aire, elimine los residuos externos de la ampolla, luego baje lentamente la ampolla para colocarla en el canal de referencia del calorímetro. La ampolla permanecerá en la posición uno hasta que se haya preparado la ampolla con la muestra de células. El DMEM, utilizado para la calorimetría, debe equilibrarse en una incubadora de 37 grados centígrados con una atmósfera humidificada y 5% de CO2.

Comience el experimento agregando tres mililitros de DMEM a una placa de 100 mililitros por cada ampolla calorimétrica que se utilizará, y coloque la placa en la incubadora hasta que la muestra esté lista para la calorimetría. Mientras el medio se equilibra, utilice un microscopio invertido para seleccionar una placa con células HepG2 que tengan entre un 60 y un 80% de confluentes y estén distribuidas homogéneamente. Primero, retire el medio de cultivo celular y lave las células dos veces con 10 mililitros de PBS.

Agregue tres mililitros de tripsina precalentada a 37 grados centígrados e incube la placa a 37 grados centígrados. Después de siete a 10 minutos de incubación, neutralice la reacción enzimática con los tres mililitros de DMEM de 37 grados centígrados y use una pipeta de cinco mililitros para disociar suavemente las células en una suspensión de una sola célula. Transfiera las células a un tubo cónico estéril de 15 mililitros para la centrifugación y vuelva a suspender la paleta en aproximadamente cinco mililitros de DMEM fresco.

Pipetee las células a fondo para desagregar cualquier grupo de células y, después de contar, concentre las células en aproximadamente dos millones de células por 50 microlitros de medio. La reproducibilidad de este método depende de recuentos celulares consistentes y precisos. Es fundamental asegurarse de que la muestra sea homogénea y que las células no se agrupen en ningún momento durante el análisis.

Luego, almacene las células en hielo hasta que estén listas para realizar mediciones respirométricas y calorimétricas. Antes de la medición calorimétrica, confirme que el calorímetro esté conectado a la computadora y que la señal calorimétrica sea estable y esté en microvatios. Diluir las células a 100.000 células por mililitro en el medio equilibrado que se colocó en la incubadora antes de la preparación de la muestra.

A continuación, añada dos mililitros de solución celular a cada ampolla, confirmando que se mantiene un volumen suficiente de aire entre las tapas de las ampollas y el medio para permitir la difusión del gas. Apriete inmediatamente las tapas y limpie las ampollas selladas con aire para eliminar cualquier residuo externo. A continuación, baje lentamente la ampolla sellada con la muestra de células para colocar uno de los calorímetros.

Mezcle bien la muestra para asegurar una solución homogénea e inyecte dos millones de células en cada cámara cerrada del respirómetro bajo agitación continua. Después de 15 minutos en la posición uno del calorímetro, baje lentamente tanto la ampolla de referencia como la ampolla con las celdas hasta la posición dos y registre el tiempo de descenso. De 10 a 15 minutos después de que las células se hayan inyectado en el respirómetro, se debe observar una estabilización del flujo de oxígeno y una disminución constante en la concentración de oxígeno.

Para determinar la respiración por fuga, inyecte un microlitro de cuatro miligramos por mililitro de oligomicina en cada cámara y deje que el flujo de oxígeno se estabilice durante unos 10 minutos, registrando la tasa de respiración de fuga estable como se acaba de demostrar. Luego, para determinar el flujo máximo, inyecte dos microlitros de FCCP milimolar de cero coma dos en la cámara, permitiendo que el flujo de oxígeno se estabilice después de cada inyección y continuando las valoraciones hasta que se alcance el flujo máximo. Registre la frecuencia respiratoria estable durante el flujo máximo.

Cuando la cámara del respirómetro está funcionando antes de la medición de la muestra, tanto la concentración de oxígeno como las trazas de flujo de oxígeno deben ser estables. Después de que la ampolla se ha bajado a la posición dos, se puede identificar un período de tiempo en el que la salida de calor es estable, y un tiempo correspondiente en el que el flujo de oxígeno es estable, para permitir el cálculo de la relación calorespirométrica. Si las células HepG2 se cultivan en ausencia de glucosa y se suplementa con galactosa para aumentar la afectación mitocondrial, las células no proliferan dentro del calorímetro, sino que disminuyen su actividad metabólica después de unos 30 minutos en la ampolla, restringiendo el cálculo calorespirométrico al punto de tiempo más temprano en el que se midió la disipación de calor.

Es fundamental registrar el tiempo en que las células se pipetean en la ampolla para que las mediciones de la producción de calor y el consumo de oxígeno se recopilen en puntos de tiempo idénticos, ya que se necesitan aproximadamente 15 minutos para que el flujo de oxígeno se estabilice y la concentración de oxígeno disminuya constantemente. Dado que el flujo de oxígeno estabilizado de las células sirve como sustituto del consumo de oxígeno al calcular la relación calorespirométrica, se pueden realizar valoraciones adicionales para evaluar la respiración por fuga, que se indica por una caída en el flujo de oxígeno y la respiración máxima desacoplada, que se indica por una falla en el aumento de la respiración con titulaciones sucesivas de FCCP. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en menos de cuatro horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que otras líneas celulares pueden tener diferentes propiedades metabólicas. Por lo tanto, cada nueva línea celular debe optimizarse tanto para sus mediciones calorimétricas como respiratorias. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar las células HepG2 para la calorespirometría para garantizar una calibración instrumental correcta y para realizar correctamente un experimento calorespirométrico.