Recolección de las toxinas del veneno de insectos asesinos y otros insectos Heteropteran

Las chinches asesinas son un grupo de insectos que utilizan el veneno para paralizar y predigerir a sus presas. Sin embargo, a pesar de que los venenos animales son de interés como nuevos medicamentos, insecticidas y herramientas científicas, las toxinas que producen no están casi en su totalidad caracterizadas. Una razón para esto es que los insectos asesinos son menos conocidos en comparación con los icónicos artrópodos venenosos como las arañas y los escorpiones.

Otra razón es que, hasta hace poco, había poca información disponible sobre cómo cosechar sus toxinas. En este video, presentaremos métodos que permitirán a los investigadores cosechar con éxito toxinas venenosas de chinches asesinas, y también de insectos relacionados, como insectos acuáticos gigantes que matan peces. El primer protocolo describe cómo recolectar veneno mediante electroestimulación.

Primero, recoja los insectos adecuados. Los adultos y las ninfas grandes son los más fáciles de trabajar. Lo ideal es usar insectos de dos a siete días después de alimentarse, para asegurarse de que los insectos hayan acumulado existencias de veneno pero no se mueran de hambre.

Prepare un par de pinzas con electrodos en las puntas y conéctelas a una fuente de electricidad. Idealmente, este suministro debería ser un electroestimulador capaz de entregar pulsos de cinco milisegundos a cinco hercios. Use voltajes máximos entre 15 y 25 voltios para insectos pequeños o grandes, respectivamente.

Si no dispone de un electroestimulador, utilice voltajes constantes de cinco a 12 voltios. Sujete al insecto con bandas elásticas y una plataforma de espuma. Coloque la probóscide del insecto en un tubo colector.

Un tubo de pipeta P200 es ideal para la mayoría de los insectos asesinos. Opcionalmente, se puede agregar una pequeña cantidad de agua a la punta antes de la cosecha, para garantizar la máxima recuperación del veneno. Aplique gel conductor a los electrodos, encienda la fuente de alimentación y aplique las pinzas electrificadas al insecto.

Experimente con una variedad de puntos de contacto mientras monitorea la expulsión de veneno de la probóscide. Almacene el veneno a temperaturas de congelación para evitar la digestión autoproteolítica. Repita la electroestimulación con un nuevo tubo de pipeta hasta que no salga más veneno.

El protocolo dos describe cómo recolectar veneno provocando una reacción defensiva. Prepare y sujete un insecto como se describió anteriormente, insertando la probóscide en una punta de recolección. Acosa suavemente al insecto para provocar una reacción defensiva, sin herir al animal.

A veces, el simple hecho de sujetar al animal o insertar la probóscide en el tubo de recolección puede provocar una reacción defensiva acompañada de la expulsión del veneno de la probóscide. De lo contrario, toque suavemente al animal en el tórax, las patas, el abdomen y, especialmente, las antenas, para provocar el veneno. En el protocolo tres, en la forma escrita de este artículo, también describimos cómo recolectar veneno de especies que escupen veneno a la defensiva.

El protocolo cuatro describe cómo recolectar veneno directamente de las glándulas venenosas mediante disección. Anestesiar a los animales mediante la exposición al dióxido de carbono durante 10 minutos. Inserte tres alfileres en la parte posterior del abdomen para sujetar al insecto sin perforar las glándulas venenosas.

Haz una incisión corta en la línea media en la superficie ventral del abdomen con un bisturí en miniatura. Use tijeras en miniatura para extender la línea media en la dirección anterior a la cabeza, teniendo cuidado de cortar solo el exoesqueleto y no dañar las estructuras internas. Para exponer las estructuras internas, haz múltiples cortes laterales que se extiendan desde la incisión de la línea media hasta el costado del insecto.

El exoesqueleto ventral entre cada uno de los dos cortes se puede sujetar hacia atrás para revelar las estructuras internas. Inundar la bandeja de disección con una solución salina hasta que el insecto quede sumergido, permitiendo que las estructuras internas floten y se visualicen más fácilmente. Las glándulas venenosas aparecerán como estructuras translúcidas y alargadas que se extienden a cada lado del canal alimentario.

Con pinzas y microtijeras, retire con cuidado el tejido conectivo y nervioso y la tráquea, tratando de no romper el canal alimentario o las glándulas venenosas. La glándula principal es reconocible por su estructura característica, con lóbulos anterior y posterior, y dos conductos que se unen en el hilio. En el caso de los insectos asesinos, y tal vez de otros heterópteros, casi todas las toxinas se almacenan en los lúmenes de los dos lóbulos de la glándula principal.

Por lo tanto, después de liberar la glándula principal de la tráquea y el tejido conectivo, se pueden cortar los dos conductos que salen del hilio y recolectar la glándula venenosa principal. Si también se desea la glándula accesoria, generalmente está muy opuesta al intestino y se puede identificar sin ambigüedades trazando los conductos desde el hilio. En cualquier caso, tenga cuidado de no romper las glándulas prematuramente y perder el veneno en la solución salina circundante.

Si se van a separar los lóbulos de la glándula principal, hágalo rápidamente después de retirarlo de la solución salina e inmediatamente proceda a recolectar el contenido de los lúmenes de la glándula, como se describe en los pasos 4.6 y 4.7 del manuscrito escrito. Los resultados variarán según el subprotocolo exacto y la especie de insecto utilizada. El primer y segundo subprotocolo presentados en este video mostraron cómo recolectar toxinas venenosas mediante electroestimulación y acoso, respectivamente.

Ambos métodos suelen producir un líquido concentrado que contiene aproximadamente de 50 a 250 miligramos por milésima de pulgada de proteína, y más de 100 componentes a base de proteínas, incluidas enzimas, toxinas formadoras de poros y péptidos. La principal ventaja de estos dos protocolos es que son rápidos, no letales y el veneno no está contaminado por el tejido glandular. La mayor desventaja de la recolección por electroestimulación o acoso es que se desconoce la fuente glandular del veneno obtenido, y el contenido de proteína del veneno recolectado puede diferir, dependiendo del protocolo.

Además, la electroestimulación y el acoso no son efectivos para todas las especies depredadoras de heterópteros. En el último subprotocolo, mostramos cómo diseccionar las glándulas venenosas congestionadas para recolectar toxinas directamente. Esta técnica también produce un cóctel de diversas proteínas, aunque en este caso las toxinas del veneno pueden mostrar alguna contaminación con tejido glandular.

Sin embargo, una ventaja de recolectar toxinas de las glándulas disecadas es que se conoce con exactitud el compartimento glandular de origen. En conclusión, alentamos a los investigadores a seleccionar un método de recolección apropiado para su pregunta de investigación. Por ejemplo, las investigaciones sobre la biología del uso del veneno dentro de una especie se beneficiarán del empleo de múltiples técnicas de recolección.

En el caso de los estudios de bioprospección, un único método para recolectar venenos de varias especies puede ser más económico, dependiendo del diseño experimental específico. Esperamos que este video y el artículo escrito que lo acompaña faciliten a los investigadores la recolección de veneno de chinches asesinas y otros insectos heterópteros, lo cual es un requisito previo para comprender su composición, bioactividad y evolución.