En Vivo Medición electrofisiológica de potencial de acción compuesto del músculo de las extremidades anteriores en modelos de ratón de la degeneración de la motoneurona

Con este método podemos estimar la degeneración de los axones así como la desmielinización en los nervios periféricos de modelos murinos de neurodegeneración. La principal ventaja de esta técnica es que este método mínimamente invasivo es factible para mediciones repetidas de una sola vez, no se hizo un seguimiento de los múltiples nervios en los mismos animales. La sensibilidad de este método permite la detección temprana de la pérdida de axones en la modulación, incluso antes de que se puedan registrar más defectos notables, lo que permite la detección temprana de estos defectos.

Para comenzar este procedimiento, anestesiar al ratón con inhalación de oxígeno isoflurano. Confirme la anestesia adecuada aplicando una presión leve en la almohadilla para caminar de la extremidad posterior para verificar la ausencia de un reflejo de retirada del dolor. A continuación, coloque un cono de nariz en la cara del animal para mantener la anestesia.

Asegúrese de que el cono de la nariz no bloquee las vías respiratorias y que el animal respire de manera constante. A continuación, mantenga la temperatura corporal del animal a 37 grados centígrados utilizando una placa calefactora termostática. Para medir el CMAP en la extremidad trasera, coloque el ratón en posición prona.

Extienda la extremidad trasera y fije la pata a la superficie de trabajo con cinta adhesiva. A continuación, coloque cinco milímetros de los electrodos estimulantes de calibre 27 por vía subcutánea a ambos lados de la cabeza ciática sin perforar los músculos subyacentes con dos centímetros entre los electrodos. Del mismo modo, coloque el electrodo de registro por vía subcutánea por encima y en paralelo al músculo gastrocnemio.

A continuación, coloque el electrodo de referencia por vía subcutánea junto al tendón de Aquiles en un ángulo de 30 grados y deje de dos a cinco milímetros de la aguja debajo de la piel. Coloque el electrodo de tierra por vía subcutánea en el costado del ratón de manera similar a los electrodos estimulantes. Para medir el CMAP en las extremidades delanteras, coloque el ratón en la almohadilla de cabecera en posición supina y utilice cinta adhesiva para extender ambas extremidades anteriores a los lados del cuerpo.

A continuación, coloque cinco milímetros del electrodo estimulante por vía subcutánea sin perforar los músculos subyacentes a ambos lados de la extremidad anterior para alinearlos con el nervio del plexo braquial. A continuación, coloque el electrodo de registro por vía subcutánea sobre el músculo bíceps braquial. A continuación, coloque tres milímetros del electrodo de referencia en un ángulo de 30 grados en las almohadillas para caminar e inserte el electrodo de tierra por vía subcutánea en el lateral del ratón.

Los electrodos están muy cerca unos de otros en esta configuración. Evite que los electrodos se toquen entre sí, ya que esto distorsiona la grabación. Estimula todos los axones usando un pulso por segundo con una duración de estímulo de 0,1 milisegundos.

Para adquirir datos, inicie la estimulación presionando el botón de estímulo recurrente en la unidad controladora y gire la perilla del controlador de intensidad para aumentar el estímulo. Para alcanzar estímulos súper máximos, aplique estímulos crecientes girando la perilla del controlador de intensidad hasta que la amplitud de la respuesta CMAP deje de aumentar. A partir de ahí, aumente aún más el estímulo en un 20% para asegurar que la amplitud del CMAP haya alcanzado su máxima respuesta.

Finalice la estimulación presionando nuevamente el botón de estímulo recurrente. Utilice la herramienta de marcador para indicar los siguientes puntos en la grabación. Inicio de la respuesta, pico positivo máximo y pico negativo máximo.

El inicio del estímulo es determinado automáticamente por el software. Determine la latencia como un retraso desde el inicio del estímulo hasta el inicio de la respuesta. Utilice la latencia para evaluar la desmielinización en los axones.

Mida la amplitud desde el pico negativo máximo hasta el pico positivo máximo y use la magnitud de la amplitud para correlacionar el número de axones funcionales. Dado que la ubicación exacta de los electrodos puede afectar el valor del resultado del registro, reemplace los electrodos y mida el mismo nervio tres veces utilizando un estímulo súper máximo para asegurarse de que se obtenga la respuesta más grande. Utilice el promedio de las grabaciones.

Después de las mediciones, retire todos los electrodos y deje que el mouse se recupere en la placa calefactora o bajo una lámpara infrarroja durante aproximadamente dos a cinco minutos hasta que haya recuperado la conciencia suficiente. No deje al ratón desatendido y en compañía de otros ratones hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia. Los ratones C61 PMP22 con sobreexpresión de tres a cuatro copias de la PMP22 humana y los ratones heterocigotos recapitulan un fenotipo muy leve de la enfermedad CMT1A con desmielinización leve y CMAPs reducidas, pero sin fenotipo visible.

En el año y medio a dos años de edad de los ratones transgénicos C61 PMP22, las amplitudes de CMAP se reducen y las latencias se prolongan tanto en las extremidades posteriores como en las anteriores. La amplitud disminuyó tanto en las extremidades posteriores como en las delanteras en los ratones transgénicos, y la latencia se prolongó en todas las extremidades en los ratones transgénicos CMT, e incluso se detectaron cambios sutiles en las extremidades anteriores con esta medición. El requerimiento de intensidad del estímulo se incrementó en los ratones C61 PMP22, que se asemeja al fenotipo detectado en los pacientes con CMT1A.

Una vez dominado, la grabación de CMAP se puede realizar tanto para las extremidades traseras como para las delanteras en 15 minutos cuando se realiza correctamente. La técnica presentada proporciona nuevas posibilidades para la caracterización de modelos murinos de trastornos neurodegenerativos como la esclerosis amiotrófica lat y la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. La evaluación de la funcionalidad del axón nervioso proporciona información detallada sobre la progresión de los trastornos neuromusculares.

Se utilizan registros similares en entornos clínicos, lo que enfatiza el potencial traslacional de este método.