Análisis de la función de célula Beta usando proyección de imagen de resolución sola célula calcio en islotes de pez cebra

Este método puede ayudar a comprender preguntas importantes en el campo de las células beta. Por ejemplo, la función heterogénea IT entre las células beta individuales dentro de un islote. La principal ventaja de esta técnica es la resolución espacial y temporal que proporcionan las imágenes en vivo de las células beta.

Podemos capturar las oscilaciones de calcio dentro de las células beta individuales. Después de sacrificar un pez de acuerdo con el protocolo de texto, transfiéralo a una placa de Petrie que contenga una solución de HBSS con calcio y magnesio. Luego, bajo un microscopio estereoscópico equipado con una lámpara de fluorescencia y un cubo de filtro rojo, use pinzas afiladas para cortar la piel desde la boca hasta la aleta anal.

Retire la piel cortada del lado derecho para exponer el abdomen, que expondrá los órganos internos. Luego, usando la fluorescencia roja para identificar la expresión de mKO2 en las células beta, localice los islotes. Limpie el islote primario extrayendo cuidadosamente el tejido circundante, como el hígado y los adipocitos.

Tome precauciones para no lastimar ni pinchar el islote. A continuación, pipetee una gota de 30 microlitros de HBSS en el centro de un plato con fondo de vidrio. A continuación, transfiera el islote diseccionado a la gota.

Con HBSS, lave cuidadosamente el islote una vez y luego use 30 microlitros de solución de trabajo de fibrinógeno para lavarlo una vez. Evite secar el islote durante las etapas de lavado, ya que podría provocar la muerte celular. Agregue lenta y suavemente 10 microlitros de 10 unidades por mililitro de solución de trombina al islote.

Deje el islote y el plato intactos durante 15 a 20 minutos. Observe que la gota de trombina de fibrinógeno se volverá viscosa y estable. Es necesario dar tiempo suficiente para que la trombina se polimerice en la solución de fibrinógeno.

De lo contrario, el molde no proporcionará estabilidad durante la sesión de imágenes. Para llevar a cabo imágenes en vivo ex vivo de la fluorescencia GCaMP, agregue 200 microlitros de HBSS en la parte superior del molde y coloque con cuidado el plato en el soporte de la placa del microscopio confocal. A continuación, con un objetivo de error 20X 0,8 NA y la opción de campo claro, localice el islote.

Uso del filtro de fluorescencia roja para ver la fluorescencia nuclear mKO2 en las células beta, concéntrese en el islote. Los núcleos individuales deben ser claramente visibles. Localice un plano de imagen claro moviéndose manualmente a través del grosor del islote a lo largo de su eje Z.

Asegúrese de que el plano de imagen contenga de 50 a 100 células beta para la obtención de imágenes y que el brillo de la fluorescencia nuclear mKO2 sea uniforme, especialmente en el centro del islote. A continuación, en el menú de configuración inteligente, configure una adquisición secuencial para la fluorescencia GCaMP6 y mKO2 utilizando los siguientes ajustes. Para GCaMP6 elija una excitación de 488 nanómetros y una emisión aproximada de 500 a 555 nanómetros.

En color falso, seleccione GFP. Para mKO2 elija una excitación de 561 nanómetros y una emisión de 570 a 630 nanómetros. Para el color falso, seleccione mCherry.

En el modo de adquisición, establezca la resolución de la imagen en 1.024 por 1.024 píxeles, la velocidad en 10 y el promedio en uno. Inicie una grabación continua seleccionando la opción de Serie temporal y estableciendo la duración en 500 ciclos con un tiempo de adquisición de aproximadamente dos segundos por fotograma. Esté atento al ciclo de imágenes.

Después de los primeros 50 fotogramas sin perturbar la adquisición de la imagen, pipetee suavemente cinco microlitros de solución de D-glucosa de 200 milimolares sobre el gel que sostiene el islote. A continuación, adquiera 150 fotogramas a 10 milimolares de glucosa. Los primeros 50 fotogramas de la serie temporal corresponden a la actividad de las células beta a cinco milimolares de glucosa.

Esta es la actividad basal. Una célula beta que responda mostrará un aumento y una disminución de la fluorescencia verde con el tiempo. A los 200 fotogramas, aumente la concentración de glucosa a 20 milimolares añadiendo suavemente 10 microlitros de D-glucosa de 200 milimolares.

A continuación, adquiera 150 fotogramas a la concentración de 20 milimolares. Para abrir el archivo de imagen en FIJI, seleccione Plugin, LSM Toolbox, show LSM Toolbox. En el cuadro de herramientas de LSM, haga clic en Abrir LSM y seleccione el archivo de imagen.

En Herramientas, en el menú Analizar, abra el Administrador de ROI. Con la herramienta de selección de polígonos ubicada en la barra de herramientas, dibuje manualmente el ROI. Dibuje el ROI en el canal rojo para que cubra un área más grande que un núcleo para incluir parte del citoplasma de la célula.

Asegúrese de que la posición del ROI sea coherente entre los fotogramas y ajuste la posición si es necesario. Agregue los ROI seleccionados al Administrador de ROI haciendo clic en el botón Agregar. Seleccione y agregue varios ROI para obtener datos en varias celdas.

A continuación, en el menú Analizar, seleccione Establecer mediciones. A continuación, seleccione Densidad integrada para especificar la extracción de la intensidad de fluorescencia total dentro del área. Cambie al canal verde que contiene la fluorescencia GCaMP y, en el Administrador de ROI, seleccione Multi Measure.

Esto proporcionará las mediciones de intensidad para las celdas a lo largo de la serie temporal. Guarde la salida FIJI como un archivo de texto separado por comas. En LSM Toolbox, obtenga las marcas de tiempo de los fotogramas de imagen.

Utilice Aplicar sellos, Aplicar sellos t, Nombre de archivo, Volcar a archivo de texto, para obtener las marcas de tiempo. Guarde las marcas de tiempo con la opción Guardar como o cópielas en la hoja de cálculo. Una vez compilados los valores de intensidad de todas las celdas, realice el análisis una celda a la vez o automáticamente.

Consulte el protocolo de texto para obtener detalles adicionales. En este experimento, se estimularon con una rampa de glucosa y luego se despolarizaron con cloruro de potasio las células beta individuales de la línea transgénica 45 DPF que expresaban mKO2 nuclear y GCaMP6 específicamente en células beta. Se analizó la actividad de las células.

Utilizando FIJI y software de análisis de datos, se extrajo y normalizó la intensidad de fluorescencia de GCaMP6 de células beta individuales. Como se ve a partir de este rastro de intensidad de fluorescencia, las células beta individuales muestran oscilaciones en la fluorescencia de GCaMP6 cuando se estimulan con glucosa, y la adición de cloruro de potasio estabiliza la fluorescencia. La técnica proporciona una resolución celular de la capacidad de respuesta a la glucosa de las células beta y una ventana a su funcionalidad.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 45 minutos si se hace correctamente. Al realizar este procedimiento, es importante verificar la viabilidad de las células beta. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las manipulaciones genéticas, para comprender el papel de genes específicos en la función de las células beta.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la respuesta de la glucosa dentro de las células beta individuales.