Protocolo CÚBICO Visualiza la expresión de la proteína en la resolución de la celda individual en su totalidad para la piel Mount

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la proliferación celular y los patrones de expresión de proteínas a nivel de una sola célula en tres dimensiones y evaluar con precisión la anatomía y la patología de la piel. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo los mecanismos celulares y moleculares controlan el desarrollo y la regeneración epidérmica y cómo estos mecanismos se alteran durante la enfermedad de la piel. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un protocolo técnicamente sencillo para visualizar células individuales en biopsias de piel de espesor completo en tres dimensiones con una precisión sin precedentes.

El método también facilita la investigación de las interacciones entre la epidermis y la dermis en muestras de piel completa. Por lo general, los investigadores nuevos en este método pueden tener dificultades para preparar las pequeñas biopsias de piel plana sin dañar los folículos pilosos. La demostración del procedimiento estará a cargo de Betty Maclarios, estudiante de doctorado en la Unidad de Dermatología Regenerativa y del Desarrollo de la UNSW Australia.

Comience usando recortadoras para afeitar el cabello del cuello de un ratón sacrificado, teniendo cuidado de no herir la piel. A continuación, descontaminar la piel con etanol al 70% y PBS. A continuación, levante la piel del cuello dorsal con pinzas y use unas tijeras para quitar un área de aproximadamente 1,5 por 4 cm de piel de ratón dorsal.

A continuación, aplana la dermis de la piel con el lado hacia abajo sobre un trozo de papel de filtro, anotando la orientación anteroposterior de la muestra, y recorta el papel alrededor de la piel disecada. Para obtener imágenes óptimas, las muestras de piel deben permanecer planas con una orientación constante del folículo piloso. Para mantener las muestras en la posición anteroposterior adecuada, fijamos las piezas de piel en el papel de filtro en biopsias rectangulares.

Transfiera las muestras a un tubo de 15 ml lleno de PFA al 4% y PBS recién preparados. Luego, cuando se hayan fijado firmemente al papel de filtro, transfiera las muestras a un nuevo tubo de 15 ml de PBS durante dos lavados de cinco minutos. Para limpiar las biopsias de piel, después del segundo lavado use una cuchilla de afeitar afilada para cortar los tejidos en trozos de aproximadamente 0,2 por 0,5 cm, teniendo cuidado de que los lados más largos de las muestras se corten a lo largo de la dirección anteroposterior de las muestras.

Cortar a lo largo del lado de la biopsia paralelo a la orientación de los folículos pilosos también ayuda a evitar daños extensos en los folículos pilosos. Sumergen las biopsias en 5 mL de solución cúbica recién preparada en un tubo nuevo de 15 mL y colocan el tubo en una plataforma giratoria en un horno de hibridación a 37 grados centígrados. Una vez que las piezas de tejido estén transparentes, lave las biopsias en 4 mL de PBS durante cuatro lavados de seis horas a 37 grados Celsius, seguidos de un lavado de cuatro horas a 37 grados Celsius en 20% de peso por volumen, sacarosa y PBS.

Al final de la incubación, congele cada muestra en un compuesto a temperatura de corte óptima en tubos individuales de 15 ml durante la noche a 80 grados centígrados para aumentar la permeabilidad de los tejidos a la penetración de anticuerpos. A la mañana siguiente, tiñe las muestras de piel con los anticuerpos apropiados y los tintes vitales de interés. A continuación, incubar las muestras en 1 mL de solución cúbica de dos aclaraciones recién preparadas en tubos de 2 mL en un agitador durante 24 horas en el horno a 37 grados centígrados para igualar el índice de refracción de los tejidos.

Cuando los tejidos estén limpios, coloque las biopsias a lo largo del lado más largo de los cubreobjetos de vidrio individuales, de modo que la dirección del crecimiento del folículo piloso sea paralela a la superficie del cubreobjetos. Coloque una gota de solución cúbica dos sobre el pañuelo. Coloque dos tiras de tachuela azul de 1 ml por 2 cm en un cubreobjetos, luego cubra la biopsia con un segundo cubreobjetos.

A continuación, coloque la cámara de imágenes en una platina de microscopio confocal y mueva el tejido hacia la vía de luz. Utilizando la fuente de luz adecuada y los filtros de epifluorescencia estándar, escanee la muestra para identificar las regiones de interés teñidas con fluorescencia y, a continuación, adquiera imágenes confocales fluorescentes de las regiones de interés. Con este método, las biopsias de piel dorsal de ambos grosores de ratones adultos de tipo salvaje se pueden clarificar y teñir con anticuerpos contra el marcador de queratinocitos basales queratina 14.

Los núcleos positivos de Dappy son visibles en toda la muestra y permiten apreciar algunas de las características anatómicas, como las papilas dérmicas. La tinción K14 es evidente en la capa basal de una célula de espesor de la epidermis interfolicular. Delineando las glándulas sebáceas y las vainas radiculares externas de los folículos pilosos y en los gérmenes pilosos secundarios con solo niveles bajos de expresión de K14 detectados en el área abultada de los folículos pilosos.

Para visualizar las células proliferantes, se pueden clarificar y teñir biopsias de piel dorsal de espesor completo en ratones adultos de tipo salvaje, como se ha demostrado, revelando la presencia de queratinocitos proliferantes en la epidermis interfolicular basal y en el istmo, pero no en la región abultada de los folículos pilosos. Para visualizar las glándulas sebáceas, se pueden clarificar y teñir biopsias de piel dorsal de espesor completo en antígenos de ratones adultos de tipo salvaje, lo que facilita la detección de las glándulas sebáceas en la región del istmo de los folículos pilosos. Para visualizar los cambios morfológicos en la epidermis y los animales transgénicos, se pueden clarificar y teñir biopsias de piel dorsal de espesor completo, revelando hiperplasia de la epidermis interfolicular y folículos pilosos anormales con masas celulares marcadas con K14 que se extienden proximalmente hacia la dermis, lo que representa las poblaciones de células madre transgénicas ampliadas.

Después de ver este video, deberíamos tener una buena comprensión de cómo preparar y clarificar muestras de piel y visualizar los patrones de expresión de proteínas a la resolución de una sola célula en tres dimensiones. Este método es fácil de realizar y utiliza reactivos relativamente seguros y económicos. En el futuro se probarán más anticuerpos para comprobar su compatibilidad con este método, lo que permitirá ampliar este análisis para visualizar más proteínas y ciertos tipos de interés.

Se pueden realizar otros métodos de imagen, como la microscopía de lámina de luz, para la visualización de la anatomía de la piel y los patrones de expresión de proteínas de muestras de piel más grandes en tres dimensiones. Tras su desarrollo, esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la dermatología exploren las interacciones celulares y moleculares entre la dermis y la epidermis en la homeostasis de la piel, en modelos de ratón modificados genéticamente y en uno de nuestros modelos de enfermedad de la piel.