Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

El objetivo general de este procedimiento es visualizar las estructuras subcelulares en las glándulas salivales murinas. Esto se logra exponiendo primero quirúrgicamente las glándulas salivales sin dañarlas. En el segundo paso, el animal anestesiado es inmovilizado en la platina del microscopio.

A continuación, las glándulas salivales se colocan cuidadosamente para no comprometer su función en el paso final. El ratón está estabilizado con un soporte personalizado para minimizar cualquier artefacto de movimiento debido a los latidos del corazón o la respiración del animal. En última instancia, la dinámica de las estructuras subcelulares se puede obtener mediante microscopía intravital.

Antes de la anestesia, pese a los ratones para determinar la dosis adecuada de anestésico. A continuación, inducir la preanestesia mediante la inhalación de flúor. Una vez que los animales estén inconscientes, confirme la sedación cada 15 minutos con un pellizco y mantenga a los ratones bajo una lámpara de calor durante la cirugía.

Controle la temperatura corporal de los animales con un termómetro de sonda rectal. Ahora afeita el cuello del ratón con un par de maquinillas eléctricas y luego usa una esponja de gasa empapada en etanol para limpiar el lado ventral del cuello, secando el exceso de alcohol con la toallita kim. A continuación, use un par de pinzas curvas sin filo para levantar un pequeño trozo de piel en el extremo inferior de los músculos del mazador y haga una pequeña incisión.

Inserte las tijeras en la incisión, apuntando las puntas hacia arriba, hacia la parte inferior de la piel, y abriendo las hojas varias veces hasta que la piel se haya separado del tejido subyacente. Luego, comenzando cerca de la base de las glándulas salivales, donde el conducto nervioso y los vasos sanguíneos conectan la glándula con el resto del cuerpo. Usa las tijeras para cortar una tira de piel suelta de tres milímetros de ancho y 10 milímetros de largo.

Después de limpiar el área de la herida, la abertura resultante tendrá forma ovalada y medirá aproximadamente ocho por 12 milímetros. Ambas glándulas salivales serán visibles. Use una jeringa para aplicar el gel de acoplamiento óptico en el centro del corte y luego use pedazos frescos de gasa estéril para limpiar el gel hacia el exterior de la abertura hasta que se elimine toda la sangre y el cabello suelto.

Ahora, usa un par de pinzas número siete para encontrar la punta de la glándula salival derecha, agarrando el tejido conectivo unos milímetros por encima de la parte superior de la glándula. Luego, desgarre el tejido conectivo alrededor de la glándula sin lesionar el parénquima. Una vez que la glándula esté expuesta, separe suavemente el tejido conectivo de la glándula, lavando cualquier sangrado con solución salina.

Asegúrese de que todos los tejidos conectivos estén separados y que la glándula esté completamente expuesta. Antes de llevar al animal al microscopio, coloque un trozo grueso de gasa y una bolsa de calor en la platina del microscopio, cubriendo también la parte superior de la bolsa de calor con un trozo delgado de gasa. Coloque una funda sobre el centro del escenario.

A continuación, coloque el ratón sobre su lado derecho encima de la gasa, asegurando al animal con un trozo de cinta adhesiva en el lado ventral de la pata delantera derecha y una sutura de seda enganchada alrededor de los incisivos. Crea algo de tensión entre el hilo y la pata y fíjalos en el escenario. Con más cinta adhesiva, la glándula salival debería descansar de forma natural.

En el centro de la funda. Utilice cuñas de plástico acopladas a la platina del microscopio para estabilizar aún más la cabeza y el tórax del ratón. A continuación, coloque un pequeño trozo de pañuelo limpiador de lentes sobre la glándula.

Extienda la glándula ligeramente y coloque un soporte personalizado sobre la glándula. Luego, acople firmemente el estabilizador a la etapa con una abrazadera de metal y cinta adhesiva. Cubra al animal con una gasa y una almohadilla térmica y controle la temperatura de las glándulas expuestas con un termómetro equipado con sonda térmica acoplada flexible. Inmediatamente después de estabilizar al animal, use la iluminación de epifluorescencia para enfocarse en la superficie de la glándula.

Evaluar el flujo sanguíneo en los capilares y la morfología general del tejido. Para excitar el gen GFP, utilice un láser de 488 nanómetros. Ajuste la potencia máxima a 0,5 milivatios para evitar el fotoblanqueo de la proteína de tomate en tándem.

Utilice un láser de 561 nanómetros, ajustando la potencia máxima a un milivatio. Ahora evalúe la estabilidad del tejido mediante el escaneo previo del área seleccionada. Si la preparación no es estable, ajuste el animal en consecuencia para encontrar el plano focal adecuado.

En el modo pre. Mueva gradualmente el objetivo hacia el cubreobjetos hasta que las estructuras del aser, los gránulos secretores y la membrana plasmática se hagan claramente visibles. A continuación, para obtener imágenes de la dinámica de los gránulos secretores, utilice una velocidad de escaneo de 0,5 a dos segundos por fotograma y de 256 por 256 píxeles con una escala espacial de 0,2 micrómetros por píxel.

Para visualizar de forma óptima los gránulos y la membrana plasmática, ajuste el grosor óptico entre 0,9 y 1,2 micrómetros. A continuación, grabe una imagen del campo de visión que se utilizará como punto de referencia. Por último, estimular la exocitosis inyectando por vía subcutánea 0,1 miligramos por kilogramo de isoproterenol y solución salina recién preparados.

Un minuto después de la inyección. La fusión de los gránulos secretores con la membrana plasmática se detectará mediante un aumento en la fluorescencia de GFP alrededor de los gránulos y la difusión del péptido de tomate en tándem en sus membranas limitantes. En el ratón tomate GFPM, la asinina aparece como estructuras claramente distintas que expresan GFP citosólica y péptido de tomate en tándem dirigido a la membrana, como lo indican las líneas discontinuas.

En las células aser asinine individuales están delineadas por el péptido de tomate en tándem, como lo indican las flechas. La GFP también se detecta en los núcleos que son claramente visibles dentro de las células aser. La GFP citosólica indicada por la punta de flecha se excluye de los gránulos secretores que aparecen como vesículas circulares oscuras de aproximadamente uno a 1,5 micrómetros de diámetro.

Para visualizar eventos exofíticos, se muestra un área representativa de la membrana plasmática que está enriquecida en gránulos secretores como lo indica el asterisco después de la inyección del isoproterenol. Se puede observar un aumento en los niveles de fluorescencia de GFP denotado por las flechas verdes alrededor de algunos de los gránulos secretores que están muy cerca de la membrana plasmática. Además, después de la fusión con la membrana plasmática, el péptido de tomate en tándem se difunde en las membranas limitantes de los gránulos secretores, como se destaca con las flechas rojas.

Después de 30 a 40 segundos, los gránulos de secretaria colapsan gradualmente y sus membranas limitantes se integran en la membrana plasmática apical. El enfoque presentado aquí representa un gran avance en la biología celular, ya que permite obtener imágenes de la dinámica de un proceso específico de tráfico de membrana en ratones vivos.