Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

El objetivo general de este procedimiento es detectar rápidamente diferentes genotipos, mutaciones o transgenes en el pez cebra. Esto se logra extrayendo primero el ADN de clips delgados y luego amplificando el ADN por PCR. El siguiente paso es desnaturalizar los amplicones de PCR mientras se registran las curvas de fusión, que se analizan mediante software.

En última instancia, los resultados muestran curvas de fusión distinguibles para diferentes genotipos. La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente como la PCR de volumen de electroforesis en gel, es que es sensible a los cambios de un solo nucleótido, a la inserción pequeña, a todas las deleciones, y esta técnica es rápida y fiable. Aunque esta técnica se puede utilizar para genotipar rápida y eficazmente el pez cebra, también se puede aplicar a otros sistemas y organismos modelo, incluidas líneas celulares, ratones y otros animales.

El día de la preparación del ADN, agregue proteinasa K fresca al tampón de lisis a una concentración de un miligramo por mililitro. El tejido se puede recolectar de un pez adulto usando una pinza delgada o de un pez embrionario. Primero anestesiar a los peces en la solución de Trica.

Espere hasta que los movimientos branquiales sean más lentos. Luego coloque el pez en una pila de pañuelos y, con una hoja de afeitar estéril, corte un pequeño trozo de la aleta caudal de unos dos a tres milímetros de largo. Coloque rápidamente los peces en un tanque etiquetado con agua dulce para su recuperación.

Tome la pinza de aleta con una punta de pipeta estéril y transfiérala a un tubo lleno de 100 microlitros de tampón de lisis de ADN. Asegúrese de etiquetar tanto el tanque del animal como el tubo, incubar todos los tejidos recolectados durante al menos cuatro horas y hasta toda la noche a 55 grados centígrados después de la incubación. Inactiva la proteína ACE K calentando los tubos a 95 grados centígrados durante 15 minutos.

Estas muestras deben usarse para PCR de inmediato, pero también se pueden almacenar a menos 20 grados Celsius durante un máximo de tres meses. Realice la PCR en una placa de 96 o 384 pocillos para cada reacción. Combine no más de un microlitro de ADN adulto con cuatro microlitros de escáner de luz.

Mezcla maestra que contiene la sonda fluorescente y los cebadores a una concentración final de cinco picos molares cada uno. Si el ADN proviene de un embrión, use hasta tres microlitros. Cubra las reacciones con 30 microlitros de aceite mineral y luego ciérrelas.

A continuación, cubra la placa PCR cargada con un sello adhesivo ópticamente transparente. Ahora optimice las condiciones de ciclo de PCR. Un conjunto de condiciones típico comienza con cinco minutos de tiempo de fusión.

A esto le siguen 30 ciclos de PCR con diez segundos de fusión, 25 segundos de tiempo de rodillas y 30 segundos de elongación. La reacción debe terminar con un 32º derretimiento adicional y luego enfriarse a 15 grados centígrados. Analice la placa de PCR colocándola en un sistema de análisis de masa fundida en el software.

Configure la temperatura y cree un nuevo archivo de almacenamiento de datos. Configure un subconjunto. Seleccione los pocillos con muestras en la parte inferior izquierda de la pantalla.

Seleccione la pestaña normalizada para eliminar las variantes fluorescentes. Coloque manualmente la línea doble paralela en las regiones prem, melt y post melt y normalice las señales fluorescentes premel y post melt de todas las muestras a uno y cero respectivamente. A continuación, distinga los genotipos en función de su temperatura de fusión seleccionando primero el agrupamiento.

A continuación, seleccione grupo automático en la lista de selección estándar. En la sección de agrupación, seleccione normal o alto para fundir perfiles con transiciones simples o transiciones múltiples, respectivamente. Están en la lista de selección de sensibilidad en la sección de agrupación.

Ahora seleccione grupos de proceso en la sección de agrupación y, a continuación, vaya al menú de archivos y haga clic en guardar para guardar los resultados. El protocolo se puede realizar durante un solo día o se puede separar en pasos a lo largo de varios días. Al realizar la PCR, las temperaturas para la fusión del amplicón dependen del tamaño y el contenido de GC, pero generalmente las temperaturas de inicio y final de 60 grados Celsius y 95 grados Celsius son apropiadas una vez que se realiza la fusión.

El análisis de las curvas de fusión fluorescente generalmente requiere la normalización de la variación de las diferentes curvas de muestra utilizando regiones de pre y post fusión como estándares. Esto mejora la comparación de los resultados de diferentes muestras en las que la variación de la fluorescencia está relacionada con variaciones experimentales menores. Cada par de líneas de temperatura para la normalización debe colocarse aproximadamente a un grado Celsius de distancia.

Los datos se pueden representar de dos maneras mediante un gráfico que muestra los archivos de perfiles de la curva de fusión, o mediante un gráfico que muestra un gráfico de diferencia sustractiva en comparación con una muestra de referencia después de que se puedan detectar mutaciones o transgenes en el análisis HRMA. Dos mutaciones diferentes en el gen EIF dos B cinco se observan por las curvas roja y azul. Estas muestras mutantes se identifican por su diferencia significativa en su curva de fusión, formas o cambio en la fluorescencia en comparación con las curvas estándar de tipo salvaje.

Este ejemplo de cuatro genotipos diferentes en una sola colección de embriones ilustra el poder y la sensibilidad del método. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de ocho horas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar HRMA para una detección eficiente a gran escala de genotipos de pez cebra.