Name: Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Aprende a realizar genotipado rápido en pez cebra mediante PCR con análisis de derretimiento de alta resolución. Este método detecta mutaciones y transgenes con alta sensibilidad en menos de ocho horas.

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Damos las gracias a los miembros de las Blaschke, Grunwald, y Wittwer laboratorios para el asesoramiento y la asistencia técnica. Este trabajo es apoyado por la Fundación PCMC, NIH R01 MH092256 y DP2 MH100008, y la Fundación March of Dimes beca de investigación # 1-FY13-425, a JLB.

1. Preparación de ADN <ol><li> Preparar ADN tampón de lisis: 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 0,3% de Tween 20, 0,3% de NP40. Añadir fresco proteinasa K a una concentración final de 1 mg / ml en el día de uso 12. </li><li> Colección de tejidos: <ol><li> Para el adulto clip de aleta de los pescados: <ol><li> Anestesie peces: Coloque el pescado en un 0,004% de MS-222 solución (tricaína). Espere hasta que el movimiento de enmalle se desacelera. </li><li> Coloque el pescado en una pila de 5-10 Kimwipes y cortar un pequeño trozo de la aleta de la cola, de unos 2-3 mm, con una hoja de afeitar estéril. </li><li> Coloque rápidamente a los peces en un tanque de la etiqueta con agua dulce para la recuperación; etiquetar cuidadosamente tanto el depósito y el tubo correspondiente que contendrá el clip de la aleta. Cambie el agua y alimentar a los peces todos los días. </li><li> Levante el clip de la aleta con una punta de pipeta estéril y la transfiere en un tubo relleno con 100 l de tampón de lisis de ADN. </li><li> Desechar la punta de la pipeta, y deseche la hoja de afeitar en un recipiente para objetos filosos. </li></ol></li><li> Para clip de la cola del embrión: <ol><li> Coloque embriones en 0,004% MS-222 solución (tricaína). Espere 2 min. </li><li> Corte un pedazo de cola con pinzas bajo un microscopio de disección. </li><li> Ponga la cola en un tubo etiquetado lleno de 30 l de tampón de lisis de ADN. </li><li> Poner rápidamente el embrión en un tubo que contiene 100 l 4% de paraformaldehído. </li><li> Marque los tubos con los embriones y sus tubos de cola correspondientes. </li><li> Guarde los tubos con los embriones a 4 ° C durante la noche para la fijación. </li><li> Limpie la pinza usando agua Milli-Q y Kimwipes entre cada embrión para minimizar la contaminación. </li></ol></li><li> Para los embriones enteros: <ol><li> Coloque embriones en 0,004% MS-222 solución (tricaína). Espere 2 min. </li><li> Ponga 1-5 embriones en un tubo relleno con 100 l de tampón de lisis de ADN. Dechorionation no es necesario. </li></ol></li></ol></li><li> La digestión de ADN Incubar los tubos con tejido (o de aleta de cola clips o embriones) a 55 ° Cdurante 4 horas o hasta el día 12. </li><li> Inactivar la proteinasa K Tubos de calor a 95 ° C durante 15 min 12. ADN se debe utilizar para PCR inmediatamente o se almacenó a -20 ° C durante un máximo de 3 meses. </li></ol> 2. PCR <ol><li> Primers diseño ya sea manualmente o mediante imprimación de software de diseño (por ejemplo Lightscanner Primer Software de Diseño-Biofire). Productos de la PCR para HRMA son generalmente 50-200 pb; productos de PCR para la detección de SNP deben ser más pequeñas, típicamente 50-80 pb. </li><li> PCR <ol><li> Realizar reacción de PCR en una placa de 96 pocillos o 384 pocillos. </li><li> Utilice 10 l volumen total: 4 l mezcla maestra LightScanner (0,1 U hot-start Taq polimerasa-AB, tampón, dNTPs 0,2 mM, cloruro de magnesio 2 mM, y 1x colorante fluorescente de unión a ADN de doble cadena), 5 pmol de cada cebador, y 1 l de plantilla de ADN genómico extraído de aleta de la cola adulto o 3 l de ADN genómico de la cola embrionaria 13. </li><li> Muestras de cubierta con 30 l de aceite mineral. </li&gt; <li> Cubra la placa con un sello adhesivo ópticamente transparente. </li><li> Optimizar PCR ciclismo condiciones típicas de condiciones son de 95 ° C durante 5 min y 30 ciclos de 10 segundos a 95 ° C, 25 seg a 60 ° C, 30 seg a 72 ° C, terminando con 95 ° C durante 30 segundos y se enfrió a 15 ° C. </li><li> Tienda placas PCR a 4 ° C o siguen directamente a HRMA. </li><li> Confirmar nuestro producto de PCR mediante el análisis de su tamaño utilizando electroforesis en gel de agarosa durante la optimización inicial de la PCR, y si está indicado, por secuenciación del producto de PCR. </li></ol></li></ol> 3. HRMA <ol><li> Placas de calor <ol><li> Coloque la placa en un sistema de análisis de fusión. </li><li> Abra el software (Software LightScanner Call-IT 2.0). </li><li> Placas de calor de 60-95 º C. </li><li> Crear un nuevo archivo de almacenamiento de datos. </li></ol></li><li> Analizar los datos HRMA (Figura 2). Son posibles varias etapas de análisis. Mostramos el conjunto de datos m más utilizadoanipulations. <ol><li> Ajuste de subconjuntos Haga clic en la pestaña de subconjuntos. Seleccione los pocillos con muestras. </li><li> Normalización <ol><li> Seleccione la pestaña Normalizar en el panel izquierdo. Para eliminar la varianza de fluorescencia, coloque manualmente la doble línea paralela en pre-(inicial) y las regiones posteriores (final) de fusión, como se ilustra (Figura 2 C, puntas de flecha) y normalizar Premelt y fluorescencia después de la fusión en las señales de todas las muestras a 1 y 0 , respectivamente 14. </li><li> Ajuste la posición de las líneas de modo que la región de fusión es en la región entre los pre-y post-fusión en las líneas, pero no se selecciona. En general, el Min Baja y el Bajo Max (y Superior y Superior Min Max) líneas de temperatura se deben colocar aproximadamente 1 ° C de diferencia. </li><li> Elija posiciones de temperatura para la normalización de tal manera que todas las muestras tienen (100%) de fluorescencia máxima o total de la región Premelt y mínima o ninguna (0%) de fluorescencia para la región de post-fusión (como mejor como POSble). La normalización debería dar lugar a una línea casi horizontal en la fluorescencia máxima de 1 que se extiende hasta el punto de fusión y luego una línea casi horizontal desde el punto de fusión a la fluorescencia mínima de 0, no debería haber niveles de fluorescencia por encima o por debajo de 1 0 . Por ejemplo, en la Figura 2C, normalizar las curvas de fusión previa usando los rangos de temperatura de 79-80 ° C. </li></ol></li><li> Agrupación / Clustering Distinguir los genotipos en función de su temperatura de fusión (Figura 2 C, caja de color verde). Seleccione Agrupación. <ol><li> Seleccione Autogroup de la lista de selección de Normas en la sección Agrupación. </li><li> Seleccione Normal o Alta para la fusión de perfiles con transiciones individuales o múltiples transiciones, respectivamente, desde la lista de selección de sensibilidad en la sección Agrupación. </li><li> Seleccionar ComputeGrupos menores de la sección Agrupación. </li><li> Vaya al menú Archivo y haga clic en Guardar para guardar los resultados. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

PCR combinada con HRMA es una tecnología de gran alcance para el genotipado de pez cebra. Las ventajas de este enfoque son su velocidad, robustez, y la sensibilidad para detectar incluso mutaciones puntuales. El protocolo de todo, desde el análisis hasta derretir curva fin-clip, se puede realizar en menos de ocho horas por un solo individuo. Además, la técnica es susceptible de cribado de alto rendimiento; no requiere el uso de bromuro de etidio, y se sella para todos PCR y pasos de análisis que ayuda a minimizar los pr...

El pez cebra (Danio rerio) es un sistema modelo de vertebrados ampliamente utilizada para estudios de desarrollo y modelado de la enfermedad. Recientemente, numerosas tecnologías transgénicas y de mutación se han desarrollado para el pez cebra. Técnicas de transgénesis rápida, generalmente basados ​​en un sistema transposón Tol2 1, se han combinado con mejores opciones de clonación para el montaje fragmento de ADN múltiple 2. Nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y de transcripción nucleasas efectoras del tipo activador (Talens) se han utilizado para dirigir los loci tanto en las células somáticas y de línea germinal en el pez cebra 3,4. Estas técnicas pueden generar eficientemente animales modificados genéticamente, con la creación de mutación de alta frecuencia y la transmisión de la línea germinal 3,4. A pesar de estos avances, las técnicas de genotipado tradicionales en el pez cebra limitando la plena potencia de las herramientas de mutagénesis y transgénesis. PCR seguida de electroforesis en gel, a veces combinada con restriccioneN enzima de digestión, se utiliza ampliamente para detectar la modificación del genoma, pero consume tiempo y menos sensible para identificar pequeñas inserciones o deleciones. Ensayos con sondas TaqMan tienen altos costos iniciales y requieren una cuidadosa optimización. La secuenciación de los productos de la PCR puede tomar varios días y no es práctico para el cribado a gran escala. Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) sólo puede discriminar SNPs que afectan a una gama limitada de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción. Análisis de alta resolución de fusión (HRMA), un método de análisis post-PCR en tubo cerrado, es un método recientemente desarrollado que es rápido, sensible, de bajo costo, y es susceptible de análisis de gran número de muestras. HRMA se puede utilizar para detectar los SNPs, mutaciones, y los transgenes 5-7. HRMA está basado en la desnaturalización térmica de los ADN de doble cadena, y cada uno de amplificación de PCR tiene un único disociación (fundir) característica 5. Las muestras pueden ser discriminados por to su composición de nucleótidos diferente, contenido de GC, o longitud, típicamente en combinación con un colorante fluorescente que sólo se une de doble cadena de ADN 8. Por lo tanto, HRMA puede distinguir diferentes genotipos en base a las diferentes características en estado fundido de la curva. Debido a HRMA utiliza reactivos de bajo costo y es un proceso de post-PCR de un solo paso, que puede ser utilizado para las estrategias de alto rendimiento. HRMA es no destructivo, por lo siguiente análisis de los amplicones de PCR se pueden utilizar para otras aplicaciones. HRMA se ha aplicado en muchos organismos y sistemas, incluyendo líneas celulares, ratones y seres humanos 9-11. Su uso ha sido recientemente descrito en el pez cebra para detectar mutaciones inducidas por las nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y talens 6,12,13. En este trabajo se describe la forma de realizar HRMA PCR basada en el pez cebra embrionarias y adultas (Figura 1). Este protocolo es adecuado para la detección de SNPs, los transgenes, y mutaciones, incluyendo SINGLE cambios de pares de bases, inserciones o deleciones.

<table><tbody><tr><td>100 Reaction LightScanner Master Mix BioFire</td><td></td><td>HRLS-ASY-0002</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>PCR de carcasa dura Placas BLK/WHT de 96 pocillos</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSP9665</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Sellos adhesivos Microseal 'B'</td><td>Bio-Rad Laboratories MSB1001</td><td></td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Instrumento LightScanner de 96 pocillos</td><td>BioFire</td><td>LSCN-ASY-0040</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Software LightScanner con Call-IT 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Análisis de fusión de alta resolución 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>LightScanner Software de diseño de imprimación</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Vector NTI Software</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehido</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rápido y eficiente de pez cebra genotipado utilizando pcr con análisis del derretimiento de alta resolución

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

El pez cebra es un modelo de sistema de vertebrados de gran alcance para el estudio del desarrollo, modelado de la enfermedad, y la realización de la detección de drogas. Recientemente se ha introducido una variedad de herramientas genéticas, incluyendo las múltiples estrategias para inducir mutaciones y la generación de líneas transgénicas. Sin embargo, el cribado a gran escala está limitada por los métodos de genotipificación tradicionales, que consumen mucho tiempo y mano de obra intensiva. Aquí se describe una técnica para analizar los genotipos de pez cebra mediante PCR en combinación con el análisis de alta resolución de fusión (HRMA). Este enfoque es rápido, sensible y de bajo costo, con menor riesgo de artefactos de contaminación. La genotipificación por PCR con HRMA se puede utilizar para los embriones o los peces adultos, incluidos en los protocolos de selección de alto rendimiento.

El protocolo se puede realizar durante un solo día o separado en pasos lo largo de varios días (diagrama de flujo de trabajo se muestra en la Figura 1). La extracción de ADN es seguido por la masa fundida y el análisis de los amplicones de PCR. Las temperaturas de la masa fundida del amplicón dependen del tamaño y contenido de GC, pero generalmente comienzan y las temperaturas extremas de 50 ˚ C y 95 ˚ C son apropiadas (Figuras 2A y 2B). Una vez que se realiza la masa f...

PCR combinada con el análisis de fusión de alta resolución (HRMA) se demuestra como un método rápido y eficiente para determinar el genotipo de pez cebra.

Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar un cribado rápido de diferentes genotipos, mutaciones o transgenes en pez cebra. Esto se logra primero extrayendo ADN de pequeñas muestras y luego amplificando el ADN mediante PCR. El siguiente paso consiste en desnaturalizar los amplicones de PCR mientras se registran las curvas de fusión, las cuales son analizadas por software. En última instancia, los resultados muestran curvas de fusión distinguibles para diferentes genotipos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la electroforesis en gel tras PCR, es que es sensible a cambios de un solo nucleótido, pequeñas inserciones, todas las deleciones, y además esta técnica es rápida y confiable. Aunque esta técnica puede utilizarse para genotipificar rápidamente peces cebra de forma eficaz, también puede aplicarse a otros sistemas y organismos modelo, incluyendo líneas celulares, ratones y otros animales.El día de la preparación del ADN, agregue proteinasa K fresca al tampón de lisis a una concentración de un miligramo por mililitro. El tejido puede obtenerse de un pez adulto mediante un corte fino o de un pez embrionario. Primero, anestesie el pez en

rapid-efficient-zebrafish-genotyping-using-pcr-with-high-resolution

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Investigación

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Biología

Este artículo describe la extracción de ADN de la pinza de la cola del pez cebra. El protocolo demuestra un método rápido y eficiente para analizar los genotipos de pez cebra.

Extracción de ADN de la pinza de la cola: un método utilizado en el genotipado del pez cebra

En este video, describimos una técnica de PCR de fusión de alta resolución para determinar el polimorfismo de longitud de fragmentos de ADN de diferentes longitudes de secuencia, basada en el análisis de la temperatura de fusión.

PCR de fusión de alta resolución para determinar variaciones de secuencia en secuencias de ADN mutante

Si bien el análisis alta resolución de fusión ofrece la capacidad de diferenciar entre polimorfismos de nucleótido único en una población heterogénea, alelo mutante sesgo de amplificación puede aumentar su capacidad para detectar alelos presentes en porcentajes relativamente bajos dentro de una muestra. Este protocolo describe las mejoras que mejoran la sensibilidad del análisis de fusión de alta resolución.

Los métodos para aumentar la sensibilidad de alta resolución de fusión polimorfismo de nucleótido único Genotipado de la Malaria

La técnica de determinación del genotipo se describe aquí, que las parejas de reacción en cadena de la polimerasa fluorescente (PCR) para electroforesis capilar en gel, permite para el genotipado de alto rendimiento de clones knockout nucleasa mediada. Se evita limitaciones que enfrentan las otras técnicas de genotipificación y es más rentable que los métodos de secuenciación.

Usando una técnica fluorescente PCR-capilar Electroforesis en gel con el genotipo CRISPR / Cas9 mediada Knockout mutantes en un formato de alto rendimiento

Pez cebra han utilizado recientemente como un sistema de modelo en vivo para el estudio de tiempo de replicación del ADN durante el desarrollo. Aquí está detallada de los protocolos para el uso de embriones de pez cebra para sincronización de replicación de perfil. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para el estudio de la sincronización de replicación en mutantes, tipos de células individuales, modelos de la enfermedad y otras especies.

Perfiles de sincronización de replicación de ADN utilizando el pez cebra como un sistema de modelo en Vivo

Pez cebra se han utilizado como organismos modelo genética fiable en la investigación biomédica, especialmente con el advenimiento de las tecnologías de edición de gene. Cuando se esperan fenotipos larvales, identificación de extracción y genotipo de ADN puede ser difícil. Aquí, describimos un procedimiento eficiente de genotipado para larvas de pez cebra, por cola de recorte, tan pronto como 72 h post fertilización.

Extracción de ADN de alto rendimiento y genotipificación de 3dpf larvas de pez cebra por recorte de aleta

Las tecnologías de edición de genes han permitido a los investigadores generar mutantes de peces cebra para investigar la función génica con relativa facilidad. Aquí, proporcionamos una guía para realizar el genotipado de embriones paralelos y la cuantificación de señales de hibridación in situ en peces cebra. Este enfoque imparcial proporciona una mayor precisión en los análisis fenotípicos basados en la hibridación in situ.

Genotipado y cuantificación de la tinción de hibridación in situ en el pez cebra

La regeneración del músculo esquelético es impulsada por las células madre musculares residentes en el tejido, que se ven afectadas en muchas enfermedades musculares, como la distrofia muscular, y esto resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. Aquí, describimos un protocolo que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.

Examinando la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular

Las tecnologías CRISPR-Cas han revolucionado el campo de la edición del genoma. Sin embargo, encontrar y aislar la edición de la línea germinal deseada sigue siendo un cuello de botella importante. Por lo tanto, este protocolo describe un método robusto para examinar rápidamente el esperma de pez cebra inyectado con CRISPR F0 para ediciones de la línea germinal utilizando técnicas estándar de PCR, digestión de restricción y electroforesis en gel.

Detección de espermatozoides para el aislamiento rápido de ediciones de la línea germinal en el pez cebra

Aquí, describimos un protocolo para generar mutantes maternos que acopla una línea knock-in zpc:cas9 estable con la entrega mediada por Tol2 de casetes de expresión de sgRNA.

Generación de mutantes maternos usando pez cebra zpc:cas9 knock-in

Aprende a realizar genotipado rápido en pez cebra mediante PCR con análisis de derretimiento de alta resolución. Este método detecta mutaciones y transgenes con alta sensibilidad en menos de ocho horas.

Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

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