Disección de la función del reforzador mediante Multiplex basados en CRISPR potenciador de interferencia en líneas celulares

Este protocolo describe los pasos necesarios para diseñar y realizar targeting multiplexados de potenciadores con la desactivación proteína de fusión SID4X-dCas9-Cascarudo, también conocido como interferencia de enhancer (potenciador-i). Este protocolo permite la identificación de los reforzadores que regulan la expresión génica y facilita la disección de las relaciones entre los potenciadores de regulación de un gen de destino común.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica y la regulación génica, como la forma en que múltiples regiones reguladoras de genes, también conocidas como potenciadores, trabajan juntas para controlar la transcripción. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden probar simultáneamente múltiples potenciadores cerca de múltiples genes diferentes para identificar rápidamente las regiones que están involucradas en la regulación génica. Para comenzar el diseño de ARN guía, primero genere secuencias de ADN como se describe en el protocolo de texto.

Utilice un programa como E-CRISP en las secuencias de ADN generadas para encontrar ARN guía con bajos objetivos fuera de los objetivos. Los ARN guía constan de 20 nucleótidos aguas arriba de un motivo adyacente al protoespaciador, que toma la forma de NGG para el dCas9 de S. pyogenes. En el sitio web de E-CRISP, seleccione el organismo de su interés utilizando el menú desplegable.

El ensamblaje del genoma aparece a la derecha del nombre de la especie. Seleccione el botón de opción La entrada es la secuencia FASTA. Copie las secuencias FASTA de arriba y péguelas en el cuadro de diálogo.

Asegúrese de que se incluya un encabezado FASTA para cada secuencia. Seleccione el botón de opción mediano y Diseño único en el menú desplegable. Haga clic en el botón Iniciar búsqueda de ARNg único.

Se abrirá una nueva pestaña del navegador y se mostrarán los resultados. Descargue las secuencias candidatas haciendo clic en el botón Descargar un informe tabular formulado en Excel para todas las secuencias de consulta juntas. A continuación, utilice el navegador de genomas de UCSC para BLAT candidatos a secuencias de ARN guía de longitud completa al genoma.

En un navegador, navegue hasta el sitio web del navegador del genoma de la UCSC. En la sección Nuestras herramientas, localice la palabra BLAT y haga clic en ella. Se abrirá la herramienta de búsqueda BLAT.

Utilice los menús desplegables ubicados debajo del texto del genoma de búsqueda BLAT para seleccionar el organismo y el ensamblaje del genoma de interés. Copie las secuencias de ARN guía del informe tabular generado por E-CRISP y péguelas en el cuadro de diálogo. Asegúrese de que cada secuencia tenga un encabezado FASTA único y, a continuación, haga clic en enviar en la parte inferior del cuadro de diálogo.

En la página de resultados de búsqueda de BLAT, aparecerán las alineaciones de cada secuencia de ARN guía, y cada línea representa una alineación. Idealmente, debería haber una alineación para cada ARN guía, lo que indica la singularidad de ese ARN guía. Si es posible, evite las guías que se asignan a múltiples ubicaciones en el genoma.

Para examinar la localización y distribución del ARN guía dentro de la región de interés, haga clic en el enlace del navegador en la sección Acciones para uno de los ARN guía consultados. Aparecerá el navegador del genoma, que se centrará en el ARN guía seleccionado. Utilice los botones de alejamiento en la parte superior de la página para visualizar la distribución de otros ARN guía identificados por E-CRISP dentro de la región de interés.

Seleccione cuatro ARN guía, preferiblemente no superpuestos, que se distribuyan por toda la región de interés. Si la región de interés supera los 600 pares de base, considere agregar una o dos guías adicionales. Evite los ARN guía con estiramientos homopoliméricos y un contenido extremo de GC, ya que estas características pueden dificultar el proceso de clonación del ARN guía y reducir la eficiencia de la focalización del ARN guía.

Reconstituir los oligonucleótidos de ARN guía a una concentración final de 100 micromolares en agua ultrapura. Debe haber al menos cuatro oligonucleótidos de ARN guía separados para cada región de interés. Para cada región reguladora de interés, cree un grupo de todos los oligonucleótidos correspondientes a la región de interés.

En un tubo de Eppendorf, combine cinco microlitros de cada oligooligo de ARN guía reconstituido individual para cada región. Mezcle bien la piscina mediante vórtice, luego retire un microlitro y diluya este eloquat 1 a 200 en agua ultrapura. Realice una breve PCR con los cebadores USICS para adjuntar regiones de homología a los oligonucleótidos como se detalla en el protocolo de texto.

Se agregarán alrededor de 40 bases a cada oligonucleótido, lo que produce un producto aproximado de 100 pares de bases que contiene suficiente homología con el espectro USIC en ambos extremos. A continuación, configure las reacciones de Gibson Assembly en hielo. Utilice 50 nanogramos del vector digerido y siete nanogramos del inserto en una reacción de 20 microlitros.

Además, configure una reacción de ensamblaje de Gibson solo vectorial digerido utilizando 50 nanogramos del vector y reemplazando el inserto con agua. Incubar las reacciones de Gibson Assembly durante 15 minutos a 50 grados centígrados, seguido de una retención a 4 grados centígrados. Después de transferir los productos ensamblados a hielo, diluirlos de 1 a 4 en agua ultrapura sobre hielo.

Por ejemplo, agregue cinco microlitros de producto Gibson Assembly a 15 microlitros de agua ultrapura. A continuación, transforme los productos diluidos de Gibson Assembly. Haga caer células competentes de alta eficiencia en el hielo y haga 25 eloquats de microlitros para cada transformación.

Si se desea un grupo complejo dirigido a varios sitios, coloque suficientes celdas en diferentes tubos para realizar múltiples transformaciones independientes. Coloque 50 microlitros de las células transformadas y coloque las placas en una incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. Para la mini-preparación de las piscinas dirigidas a sitios individuales, coloque las celdas directamente en tres a cinco mililitros de caldo LB que contenga ampicilina o carbenicilina.

Incubar las celdas durante la noche agitando a 250 rpm y 37 grados centígrados. Para bibliotecas grandes, use un raspador de placas para recolectar todas las colonias de cada placa individual en una maxi-preparación. Esto se puede facilitar vertiendo aproximadamente cinco mililitros de LB con el antibiótico apropiado en un tubo Falcon de 15 mililitros y raspando las colonias en el tubo.

El día antes de la transfección, coloque las células en una placa de 24 pocillos, con una confluencia del 30 al 50%. Coloque suficientes células de modo que las transfecciones se puedan realizar por duplicado, e incluya los pocillos que se van a transfectar con ARN guía de control. Asegúrese de que las celdas se distribuyan uniformemente por el pocillo, agitando suavemente la placa después de la colocación de la placa celular.

Agitar cada cinco minutos en los primeros 15 minutos. Al día siguiente, prepare las transfecciones según las instrucciones del reactivo de transfección de su elección. Para las células de Ishikawa, use 550 nanogramos de plásmido total para cada pocillo de una placa de 24 pocillos.

Diluir los plásmidos hasta una concentración final de 020 microgramos por mililitro en medios sin suero. Use tres microlitros de reactivo de transfección por cada microgramo de ADN, haga vórtice suavemente e incube durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. Agregue 25 microlitros de la mezcla final a cada pocillo.

Prepare un volumen suficiente de tampón de lisis con 1%beta-mercaptoetanol. Aspire el medio con un aspirador de vacío. Lave las celdas una vez con un volumen igual de 1x PBS y aspire para eliminar la mayor cantidad de PBS posible.

Añada 300 microlitros de la solución de lisis BME a cada pocillo, utilizando una pipeta multicanal. Pipetee la solución de lisis hacia arriba y hacia abajo de ocho a diez veces, y transfiérala a una placa de pocillo profundo o tubos Eppendorf de 1,7 mililitros sobre hielo. El ARN se puede extraer inmediatamente o los lisados se pueden congelar a menos 80 grados Celsius para su procesamiento futuro.

Se muestran diseños de ARN guía para los tres sitios de unión de factores de transcripción cerca de MMP17. La región diana es el sitio de unión para el RE alfa definido por ChiP-seq, y los cuatro ARN guía se agrupan en esta región. Aquí se muestra el producto de ARN guía esperado después de una PCR corta, utilizando los cebadores internos de la USIC.

La reacción agregará 20 pares de bases de secuencia a cada extremo del fragmento de ARN guía de 59 pares de bases, lo que dará como resultado una secuencia aproximada de 100 pares de bases. Se muestran los resultados cualitativos de la PCR de un experimento Enhancer-I en MMP17. Los sitios a los que se dirige Enhancer-I se indican con un hexágono negro.

Los sitios 1 y 2 son necesarios para la respuesta estrogénica completa de MMP17, mientras que el sitio 3 no contribuye. El sitio 1 puede aportar alguna expresión por sí mismo, pero la mayor actividad se observa cuando los sitios 1 y 2 están activos. Una vez optimizada para la línea celular de interés, esta técnica se puede realizar en cinco a siete días, si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseñar ARN guía para Enhancer-I, crear y transfectar grupos complejos de ARN guía y cosechar células transfectadas. Al intentar este procedimiento, es importante mantener un entorno de cultivo de tejidos estéril y utilizar materiales libres de ARNasa y DNasa. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como ChiP-seq y RNA-seq, para responder a preguntas adicionales, como en qué parte del genoma se une Enhancer-I y cómo afecta a la expresión génica global.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran la regulación génica inducida por estrógenos en loci endógenos en el genoma humano, en lugar de usar reporteros episomales. No olvide que trabajar en entornos de cultivo de tejidos de mamíferos puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, mientras se realiza este procedimiento.