Generación de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos a través de CRISPR / Cas9

CRISPR/Cas9 es un sistema robusto para producir disrupción de genes y elementos genéticos. En este trabajo describimos un protocolo para la creación eficiente de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR/Cas9.

El objetivo general de este procedimiento es utilizar el sistema CRISPR Cas nine nucleasa para crear deleciones genómicas. Primer electropurado, los dos plásmidos CRISPR y un plásmido reportero A GFP simultáneamente en las células. Luego, utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia, aísle el 3% superior de las células que expresan GFP.

A continuación, coloque las células clasificadas en la dilución límite y detecte clones de deleción bioalélica mediante PCR convencional. En última instancia, CRISPR Cas nine se puede utilizar para estudiar genes y elementos genéticos produciendo alelos de deleción de pérdida de función En comparación con las mutaciones de cambio de marco producidas por un solo ARN guía, las grandes deleciones generadas por el sistema de nucleasa Cas nine de CRISPR pueden ayudar a garantizar la pérdida de mutaciones de función. Este enfoque también permite un cribado fácil y barato a través de una PCR convencional.

Tuvimos la idea de este método por primera vez cuando descubrimos que el cribado de pequeños indels creados por un solo ARN guía era técnicamente desafiante, laborioso y costoso. Los alelos de deleción también son particularmente informativos para el estudio de elementos genéticos no recubrimientos. Por cada pellet de par CRISPR, dos veces 10 por las seis células cultivadas en suspensión. Vuelva a suspender las células en 100 microlitros de solución de electroporación y luego transfiéralas a un QAT de electroporación.

Agregue cinco microgramos de CRISPR Cas nine construct SG RNAA cinco microgramos de CRISPR Cas nine. Construya SG, a, B y 0,5 microgramos de la expresión GFP, construya la pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces suavemente para mezclar. Trate de evitar producir burbujas utilizando un sistema de electroporación.

Electropurar las celdas con 250 voltios durante cinco milisegundos en una vete de dos milímetros con una pipeta de transferencia estéril Transfiera inmediatamente la solución a un mililitro de medio de cultivo precalentado. Incubar las células a 30 grados centígrados durante 24 a 72 horas. Pase las células a través de un filtro estéril de 50 micras a un tubo de fax.

A continuación, clasifique por fax el 3% superior de las células positivas para GFP con el fin de enriquecer para las células que recibieron altos niveles de los plásmidos. Después de optimizar las condiciones de dilución limitantes para las celdas de interés, la placa clasificó las células en una placa de 96 pocillos y una dilución de 30 celdas por placa con 100 microlitros de medios de cultivo celular por pocillo. Para las celdas a granel ordenadas restantes, congele la mitad de las celdas para el enchapado futuro.

Coloque la otra mitad en una placa para el cribado y la validación de la imprimación. Incube estas células a granel a 37 grados centígrados durante tres a siete días. Permita que los clones incuben a 37 grados centígrados durante siete a 14 días, dependiendo del tiempo de duplicación de la línea celular.

Se utiliza para aislar el ADN genómico Resus, suspender los gránulos de células parentales y a granel en 50 microlitros de solución de extracción de ADN. Ejecute la muestra en un termociclador para extraer el ADN genómico. A continuación, mida la concentración de ADN.

Ahora ensamble una reacción de PCR de 20 microlitros combinando 10 microlitros de dos mezclas XPCR. 0,5 microlitros de cebador directo de 10 micromolares 0,5 microlitros de cebador inverso de 10 micromolares, 50 a 100 nanogramos de ADN genómico y agua hasta 20 microlitros. Realice la PCR para la banda de no deleción y la banda de deleción en reacciones separadas.

A continuación, coloque las muestras en un termociclador y ejecútelas utilizando 35 ciclos con una temperatura de arrodillamiento A de 60 grados centígrados, como se detalla en el protocolo escrito adjunto. Resuelva las muestras en un gel de 2%aros a 10 voltios por centímetro utilizando un tampón XTAE. A continuación, examine las muestras para detectar la presencia o ausencia de bandas de no deleción y de deleción.

Considere una estrategia para multiplexar los pares de cebadores de PCR con deleción y sin deleción en una sola reacción. Alternativamente, puede ejecutar reacciones de PCR de deleción y no deleción por separado. En el caso de las células en suspensión, transfiera todos los clones a una sola placa de 96 pocillos que ya contenga 50 microlitros de medios de cultivo celular por pocillo.

A continuación, transfiera 50 microlitros de cada pocillo a una placa de PCR de 96 pocillos. Alternativamente, para las células de adherencia, tripsina, ojos, clones antes de la transferencia a una sola placa de 96 pocillos. A continuación, transfiera 50 microlitros de cada pocillo a una placa de PCR de 96 pocillos, centrifugar la placa de PCR a 400 veces G durante cinco minutos y retire el sobrenadante moviendo la placa de PCR sobre un fregadero.

Ahora agregue 50 microlitros de solución de extracción de ADN por pocillo y vuelva a suspender los gránulos celulares después de la extracción de ADN genómico, ejecute reacciones de PCR para detectar bandas de no deleción y deleción de los clones. Resuelva los productos de PCR en un gel de 2%aros a 10 voltios por centímetro. Usando un búfer XTAE.

Identifique los clones con la deleción deseada y amplifique los cultivos en una placa o matraz más grande. En el ejemplo que se muestra observa de izquierda a derecha células parentales, tres clones sin deleción, tres clones de deleción monoalélica y tres clones de deleción bialélica. El uso de múltiples pares de ARN SG r que no se superponen puede ayudar a controlar los efectos fuera del objetivo.

Cada par daría lugar a la producción de una eliminación única. El punto de ruptura dirigido a pares de SG en varias ubicaciones con respecto al gen se puede usar para eliminar todo el cuerpo del gen para crear indels de cambio de marco, incluso si uno o ambos alelos no se eliminaron o para permitir la interrupción de una isoforma en particular. En este experimento.

En cuanto a la deleción de todo el gen, se diseñaron pares de ARN PIM uno dos SG clonados en el vector de expresión PX 3 3 0 y entregados a las células MEL por electroporación. Junto con el indicador de GFP, el 3% superior de las células positivas para GFP se sembraron clonalmente para limitar la deleción y se examinaron mediante PCR para clones de deleción monoalélica y bioalélica sin deleción para esta deleción PIM one. Los clones de deleción bioalélica se seleccionaron para una mayor proliferación después de permitir cinco días para la expansión.

Cada clon se volvió a analizar mediante PCR de ADN genómico para confirmar la deleción y deleción de BIC. Los amplicones se sometieron a secuenciación Sanger para identificar la deleción precisa. El ARN se aisló de clones de deleción BIC y se analizó mediante R-T-Q-P-C-R para confirmar la pérdida de la expresión de PIM one.

Una vez dominada, esta técnica puede completarse en cuestión de semanas para identificar clones de deleción vital. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el sistema CRISPR CAS de nueve nucleasas para crear deleciones genómicas mediante la depuración de plásmidos CRISPR, la clasificación de células brillantes GFP y la detección de clones individuales mediante PCR convencional para clones de deleción BioE.