Generación eficiente de hiPSC Neuronales Lineage Reporteros Knockin concreto utilizando la CRISPR / Cas9 y Cas9 Doble Sistema Nickase

El objetivo general de este procedimiento es generar células madre pluripotentes inducidas humanas específicas de linaje o reporteros knockin H-I-P-S-C utilizando la recombinación homóloga mediada por CRISPR Cas nine. Esto se logra diseñando y construyendo primero vectores de orientación. El segundo paso es diseñar y construir ARN de guía simple para el sistema CRISPR Cas nine o el sistema CAS nine N de doble caja.

2 93 PIES. A continuación, las células se transfectan con los ARN guía único y el vector de expresión CAS nine, y el ADN se extrae y amplifica para su evaluación mediante un ensayo de endonucleasa T seven one. El paso final es realizar una predicción in silico de posibles sitios fuera del objetivo. Sitios. En última instancia, las PSC HI se transfectarán con el vector objetivo y los componentes del sistema CRISPR Cas nueve para crear líneas celulares reporteras de knockin de linaje neuronal.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es la recombinación homóloga convencional. En cambio, la segmentación génica mediada por CRISPR cast nine tiene una eficiencia de segmentación mucho mayor. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque puede llevar algo de práctica diseñar un solo ARN de GA.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos para el diseño de AR de guía única y la predicción en calidad de sitios fuera del objetivo son difíciles de aprender porque el concepto de CRISPR Cas nine se introdujo recientemente para la edición de genes y las nuevas herramientas de recursos en línea se emplean una vez determinado el marcador específico del linaje. Localice la secuencia genómica del gen y diseñe los brazos de homología en consecuencia. En este ejemplo se utiliza el locus genómico A, LDH, uno L, uno.

La construcción de la focalización se realiza mediante la subclonación de GFP aguas abajo de la secuencia genómica justo antes de que el código de parada se conecte por autoescisión dos secuencias de péptidos A que agreguen un casete de selección positiva, como un casete de neomicina F fundido aguas abajo del reportero, incluya un casete de selección negativa, por ejemplo, timidina quinasa fuera del brazo de homología de tres primos. Comience este procedimiento determinando el marcador específico de linaje al que se dirigirá para hacer que el reportero A LDH uno L uno se utilice en esta demostración. Copie la secuencia CDNA de la base de datos NCBI.

Vaya a la búsqueda de blatt humano para obtener una alineación de ADN genómico. Haga clic en la pestaña del navegador para ver el ensamblaje del gen en la pestaña de vista. Haga clic en ADN para obtener la secuencia completa de ADN genómico en un formato rápido.

Localice el código de parada dentro de la secuencia de ADN donde se marcarán la secuencia bidireccional y el casete reportero. Busque el protoespaciador, el motivo adyacente o Pam, por ejemplo, NGG, dentro de las proximidades del código de parada en el escaneo de ambas hebras para localizar la secuencia NGG adecuada. Copie la secuencia de la base 20 inmediatamente antes de NGG y péguela en la herramienta de diseño web Z fit design oligos con voladizos compatibles con MLM 3 6 3 6.

El vector de expresión de GRNA humano con un promotor U seis. Después de que se hayan sintetizado los oligonucleótidos directos e inversos, proceda a hacer ARN guía simple de doble cadena para una reacción de 50 microlitros. Agregue 22,5 microlitros de oligonucleótidos hacia adelante y hacia atrás, respectivamente, y cinco microlitros de tampón de rodillas Anne, desnaturalice ambos oligonucleados a 70 grados centígrados durante 15 minutos y enfríe gradualmente a temperatura ambiente.

A continuación, mezcle y lige los oligonucleótidos con BSMB uno digerido MLM 3 6 3 6. Para una reacción de 20 microlitros, agregue un microlitro de oligonucleótidos de 100 nanogramos de MLM 3 6 3 6 6 y un microlitro de T cuatro ligasa incube a temperatura ambiente durante la noche al día siguiente, transforme las células DH cinco componentes alfa con un producto de ligadura mediante choque térmico a 42 grados Celsius durante 30 segundos. Cultive las bacterias en una placa de ampicilina de barrena LB a 37 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, elija de tres a cinco colonias para la preparación de plásmidos. Posteriormente, el ADN del plásmido se confirma mediante secuenciación comercial y se prepara el plásmido correcto utilizando un protocolo estándar de preparación maxi para comenzar este procedimiento, obtener un doble nick case CAS nine ND 10 un vector Diseñe un par de oligonucleótidos directos e inversos para cada locus objetivo siguiendo el mismo procedimiento demostrado para el sistema CRISPR Cas nine. Un LDH uno L uno volverá a ser el ejemplo aquí.

Copie la secuencia de 20 bases inmediatamente aguas arriba de NGG y péguela en la web. Diseño de la herramienta Z fit para la obtención de oligonucleótidos compatibles con el vector. Retire la primera base y la última base de los oligonucleótidos delanteros e inversos que se muestran en la herramienta de diseño de ajuste Z.

Sintetice los oligonucleótidos directo e inverso y nómbralos de la siguiente manera. FN en minúsculas, F mayúscula y FN en minúsculas, R mayúscula En el caso de las MAP situadas en un lado del sitio de destino y R en minúsculas y F mayúsculas y R en minúsculas y R mayúsculas en el caso de las PAM situadas en el otro lado del emplazamiento de destino de estas N es el número para designar las diferentes MAP La f y la r minúsculas representan la ubicación de las PAM en la hebra de sentido o antisentido, y las f y r mayúsculas representan hacia delante y oligonucleótidos inversos. Después de identificar el par optimizado de ARN guía simple que se utilizará para CAS nine n mediante el ensayo T seven E one, proceda a hacer ARN guía simple de doble cadena para una reacción de 50 microlitros, agregue 22,5 microlitros de oligonucleótidos directos e inversos respectivamente y cinco microlitros de un tampón arrodillado.

Desnaturalice ambos oligonucleótidos a 70 grados centígrados durante 15 minutos y enfríe gradualmente hasta temperatura ambiente. Mezclar y ligar los oligonucleótidos con bbbs. Una nase doble digerida CAS nueve ND 10 un vector.

Para una reacción de 20 microlitros, agregue un microlitro de ARN guía simple de 100 nanogramos de bbbs, un vector digerido y un microlitro de T 4ligasa, incube a temperatura ambiente durante la noche y transforme DH cinco células componentes alfa con un producto de ligadura por choque térmico a 42 grados Celsius durante 30 segundos. Cultive las bacterias en una libra de ampicilina agar a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, elija de tres a cinco colonias para la preparación de plásmidos.

Posteriormente, el ADN del plásmido es confirmado por un proveedor comercial de secuenciación y se prepara el plásmido correcto utilizando un protocolo estándar de preparación maxi para comenzar este ensayo. Co transfecte 2 células de 93 pies con el plásmido de ARN guía única y el vector de expresión CAS nine a 0,5 microgramos de vector de ARN guía único, 0,5 microgramos de vector de expresión CAS nine y 1,5 microlitros de lipectomía 2000 a las células. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 72 horas.

Después de 72 horas, recoja las células retirando el medio de cultivo de cada pocillo. La adición de 100 microlitros de tampón de extracción rápida de ADN y la clasificación de prueba transfieren vigorosamente las células a los tubos. Incuba la mezcla a 68 grados centígrados durante 15 minutos, seguido de 95 grados centígrados durante ocho minutos.

Esta es la plantilla para los experimentos posteriores de PCR. Configure la PCR para amplificar la secuencia que flanquea el motivo adyacente del protoespaciador. Para una reacción de 50 microlitros, combine un microlitro de la plantilla, 0,5 microlitros de Hércules, dos 0,5 microlitros de DMSO, 10 microlitros de cinco tampones, 0,5 microlitros de mezcla A-D-N-T-P y un microlitro de una mezcla de cebadores directo e inverso.

Realizar la PCR siguiendo los parámetros descritos en el protocolo cuando la PCR esté completa y las concentraciones de ADN de los productos de PCR se hayan medido a 400 nanogramos de productos de PCR a dos microlitros de tampón de digestión dos, ADD DD H2O a una reacción final. Volumen de 19 microlitros incubar en agua hirviendo durante cinco minutos. Deje reposar la reacción en el banco durante 45 a 60 minutos para que se enfríe naturalmente a temperatura ambiente.

A continuación, agregue un microlitro de T seven E one e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Detenga la reacción añadiendo dos microlitros de EDTA 0,25 molar mezclado con seis colorantes de carga XDNA. Cargue toda la reacción de 20 microlitros en un gel AROS al 2,5%.

Haga funcionar el gel a 100 a 150 voltios durante 30 minutos. Inspeccione el gel bajo luz ultravioleta para evaluar la escisión mediada por ARN de una sola guía. Posteriormente, cree reporteros de linaje neuronal mediante células madre pluripotentes electroinducidas por humanos o HI PSC con un vector de orientación linealizado CAS 9 0 0 3 vector de expresión y vector o vectores de ARN guía única apropiados Los posibles sitios fuera del objetivo se pueden predecir utilizando una herramienta de código abierto en línea llamada CS ot, que es un programa basado en perlas.

Para un sistema de ventanas, descargue el programa CS OT y los archivos de la base de datos del genoma humano en un disco duro local. Prepare el archivo objetivo del ARN guía único diseñado en el formato FASTA. Abra el archivo llamado cas ot.

Aparecerá una ventana de comandos. Déjalo como está por ahora. A continuación, abra el archivo llamado opt generator.

Para generar una cadena de opciones, pegue la ruta y el nombre del archivo de destino en el cuadro de diálogo de la opción menos T o menos destino. Pegue la ruta del archivo de secuencia del genoma en el cuadro de diálogo de la opción menos G o menos genoma. Copie la cadena de opción y péguela en la ventana de comandos CAS OT.

Como se muestra anteriormente, al finalizar el programa CAS OT, se generará una carpeta de ejecución. Abra el archivo CSV dentro de la carpeta con un programa de hoja de cálculo. Este archivo contiene la siguiente información para cada sitio fuera del objetivo, ubicación cromosómica y genómica.

Secuencia del tipo de sitio no coincidente, número total de bases no coincidentes e información del exón relacionada con el sitio fuera del objetivo antes del transecto. Hola PSCs. Los ARN guía simple se evalúan en 2 células de 93 pies mediante el ensayo T seven E.

En este resultado representativo, los ARN guía únicos están diseñados para dirigirse al oli humano. Dos carriles génicos del uno al tres se transfectan con un vector de expresión CAS nueve y los carriles cuatro a 11 se transfectan con un vector de expresión CAS nine N. GFP se utiliza como control.

El carril dos contiene ARN guía simple para oli. Dos objetivos mediante CAS nueve carriles cinco solo contiene hebra de sentido de unión. El carril seis contiene solo hebra antisentido de unión a ARN guía única y los carriles nueve y 10 contienen un par de ARN guía simple para ambas hebras de ADN.

El producto de PCR no digerido es de aproximadamente 614 pares de bases en el carril dos. Una parte de los productos de PCR se digiere en dos bandas de aproximadamente 470 pares de bases y 140 pares de bases con un porcentaje de inserción y deleción del 33% en los carriles nueve y 10. Las dos bandas digeridas son aproximadamente 410 pares de bases y 200 pares de bases con porcentajes de inserción y deleción entre tres y 8%Una vez que se domina el vector y el diseño de guía única y la evaluación se puede realizar en aproximadamente una semana.

Se realiza correctamente después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de la biología de células madre con amplias funciones génicas en el desarrollo y enfermedades en los sistemas humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar y construir matrices de guía simple para el sistema CRISPR Cas nine y CAS nine N double N.