Aislamiento y análisis de comunidades microbianas en el suelo, rizosfera y raíces en los experimentos de pastos perennes

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del microbioma del suelo, la rizosfera y el endosfera de las raíces, como cómo cambia la diversidad de la comunidad microbiana en respuesta al tipo de muestra, el tratamiento y el genotipo de la planta. La principal ventaja de esta técnica es que es muy adecuada para experimentos de campo que requieren un gran número de muestras y replicación. Stephanie Futrell, estudiante de posgrado y técnica de investigación de mi laboratorio, demostraremos el procedimiento.

Para comenzar el protocolo, etiquete una bandeja de lavado y un balde con una nota adhesiva con detalles de la muestra de la planta. Lleve el cubo etiquetado a la parcela y deje la bandeja de lavado en la estación de trabajo establecida en el campo. Elija y recoja al azar dos plantas por parcela de diferentes áreas dentro de la parcela.

A continuación, perfore la tierra con una pala a una profundidad de 30 centímetros para cortar cualquiera de las raíces laterales que sujetan la planta en el suelo. Excave las raíces de las plantas aprovechando la pala y coloque el cepellón en el cubo etiquetado. Lleve el balde de regreso a la estación de trabajo en el campo.

Sacuda las raíces y use una pala o un cultivador de mano para quitar la tierra de las raíces. Use guantes y coloque las raíces cerca de la estación de procesamiento. Después de sacudir las raíces, mezcle la tierra en la bandeja de lavado y rompa los terrones de tierra con un cultivador de mano.

Coloque una muestra de tierra que esté libre de escombros en una bolsa de almacenamiento con cremallera etiquetada de 17.7 por 19.5 centímetros y colóquela sobre hielo. Esterilizar las tijeras de podar en etanol al 70%. Use las tijeras estériles para extirpar una variedad de raíces, aproximadamente de cuatro a seis raíces por planta y cada raíz de aproximadamente nueve a 12 centímetros de largo.

Coloque las raíces extirpadas en un tubo etiquetado de 50 mililitros que contenga 35 mililitros de tampón de fosfato esterilizado en autoclave con un surfactante como Silwet L-77. Agite los tubos durante dos minutos para liberar la rizosfera de la superficie de las raíces. Mejore el temblor con un generador y un vórtice.

Con pinzas esterilizadas en etanol al 70%, retire las raíces del tubo, séquelas brevemente con toallas de papel y colóquelas en un tubo nuevo de 50 mililitros etiquetado. Coloque tanto el tubo que contiene la rizosfera como el que contiene las raíces sobre hielo. Agregue aproximadamente 35 mililitros de 50% de lejía más 0.01%Tween 20 a los tubos de 50 mililitros con raíces recolectadas en el campo.

Agite los tubos durante 30 a 60 segundos. Vierta la lejía, agregue 35 mililitros de etanol al 70% y agite las raíces durante otros 30 a 60 segundos. Después de agitar, vierta el etanol al 70% y agregue 35 mililitros de agua estéril ultrapura y vórtice o agite la muestra durante un minuto.

Repita el paso de enjuague con agua dos veces más para que la raíz reciba un total de tres enjuagues con agua estéril y ultrapura. Seque las raíces con toallas de papel secas y limpias y use una toalla de papel limpia para cada muestra. Con pinzas estériles y tijeras de podar, corte las raíces en trozos de aproximadamente cinco milímetros y colóquelas en un tubo cónico limpio y etiquetado de 15 mililitros, luego almacene las muestras a menos 80 grados Celsius hasta que se procesen más.

Agite los tubos de 50 mililitros que contienen muestras de rizosfera del campo durante 20 a 30 segundos para volver a suspender toda la muestra. Usando un filtro de celdas de malla estéril de 100 micrones, filtre la muestra resuspendida en un nuevo tubo de 50 mililitros. A continuación, centrifugar los tubos a 3.000 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Vierta y deseche inmediatamente el sobrenadante. Coloque los gránulos de rizosfera en los tubos de 50 mililitros sobre hielo. A continuación, añada 1,5 mililitros de tampón de fosfato estéril sin tensioactivo a los gránulos de la rizosfera y vértice ellos para volver a suspender la muestra.

Pipetea el líquido suspendido en un tubo de microfuga limpio y etiquetado de dos mililitros. Gire los tubos a 15, 871 veces g durante dos minutos a temperatura ambiente. Vierta inmediatamente el sobrenadante y escurra los tubos sobre toallas de papel limpias.

Almacene los gránulos a menos 20 grados centígrados hasta que se procesen más. Con una espátula de metal estéril, llene un tubo limpio y etiquetado de dos mililitros con aproximadamente tres gramos de tierra para la extracción de ADN y evite los pequeños trozos de raíz y desechos. Enjuague la espátula de metal con etanol al 70% entre cada muestra.

Almacene esta muestra de suelo a menos 20 grados centígrados. En una bandeja de lavado limpia, vacíe la bolsa de tierra en tamices apilados con el tamiz más grande encima del tamiz más pequeño y tamice manualmente la tierra a través de ambos tamices. Utilice un cepillo para limpiar cuidadosamente los tamices entre muestras.

Reserve de 100 a 125 gramos de tierra tamizada en una bolsa con cremallera de 17,7 por 19,5 centímetros para futuros análisis físicos-químicos y de textura del suelo. Coloque las bolsas de tierra a cuatro grados centígrados para su almacenamiento a corto plazo. A continuación, vierta nitrógeno líquido en un vaso de precipitados de plástico con espátulas limpias y en un mortero limpio.

Coloque el pañuelo congelado en el mortero y triélelo con el mortero hasta obtener un polvo fino. Agregue continuamente nitrógeno líquido durante la molienda para mantener las muestras congeladas. Use una espátula para transferir el tejido molido en un tubo limpio y etiquetado de dos mililitros y luego almacene el tejido a menos 80 grados centígrados.

Limpie el área de trabajo con 70% de etanol y 1% de lejía doméstica. Retire las muestras de suelo del almacenamiento a menos 20 grados centígrados y descongélelas en una cubeta de hielo. Retire la cubierta del tapete de sellado de una placa de extracción de 96 pocillos y coloque la cubierta entre dos toallitas de papel para mantenerla limpia mientras no esté en uso.

Cubra las 12 columnas de la placa con tiras adhesivas de PCR de 8 pocillos para evitar la contaminación. Tara un embudo de pesaje estéril de tamaño pequeño en una báscula y pesa de 200 a 250 miligramos de tierra. Levante con cuidado la tira adhesiva, coloque el cuello del embudo de pesaje lleno en el pocillo apropiado y guíe suavemente la muestra de suelo hacia el pocillo apropiado.

Vuelva a colocar la tira adhesiva para cubrir el pozo. Repita este proceso para cada pocillo, utilizando un nuevo embudo estéril para cada muestra. Vuelva a colocar la cubierta del tapete de sellado en la placa de extracción y almacene la placa a menos 20 grados centígrados hasta que esté lista para la extracción de ADN.

Retire las muestras de rizosfera del almacenamiento a menos 20 grados centígrados y descongele en una cubeta de hielo. Prepare la placa de extracción de ADN como se hizo en la sección anterior. Coloque una toallita de papel limpia en una báscula, luego tara una espátula de metal estéril en la báscula.

Use la espátula para sacar con cuidado un poco de la bolita de rizosfera de un tubo de muestra. Pesar entre 200 y 250 miligramos de la muestra de rizosfera. Levante con cuidado la tira adhesiva para descubrir el primer pocillo de la placa de extracción.

Incline la espátula llena en el pocillo y raspe el material de la rizosfera en el pocillo apropiado con un palillo estéril. Enjuague la espátula de metal con agua seguida de etanol al 70% entre muestras. Finalmente, repita este proceso para cada pocillo de la placa hasta que la placa esté llena, dejando un pocillo vacío como control de extracción en blanco.

En este conjunto de datos representativo, hubo diferencias altamente significativas entre los tipos de muestra, y la rizosfera y el suelo parecen ser más similares en composición entre sí que la raíz. Un análisis más detallado muestra que también hubo diferencias muy significativas en la composición de la comunidad microbiana entre la rizosfera y el suelo. El análisis de la diversidad alfa muestra que las comunidades microbianas en la endosfera eran más bajas que las comunidades en el suelo y la rizosfera.

La única diferencia significativa en la diversidad entre las especies de gramíneas fue entre las muestras de la endosfera de tallo azul grande y pasto varilla. El análisis de abundancia relativa destaca la dominancia de Proteobacteria seguida de Actinobacteria en todos los tipos de muestras. El suelo y la rizosfera están dominados por Acidobacteria y Chloroflexi, mientras que las raíces tenían una mayor abundancia relativa de Bacteriodetes.

El análisis de PERMANOVA de todos los tipos de muestras elucidó una diferencia altamente significativa en la composición de la comunidad microbiana debido a las especies de plantas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una serie de pasos para usar en el estudio de los microbiomas del suelo, la endosfera y la rizosfera. Nos gustaría agradecer al EPSCoR de Nebraska y al Programa de Infraestructura de Investigación EPSCoR de la Fundación Nacional de Ciencias Track 1 por el financiamiento parcial de este video educativo.