Name: Aislamiento y análisis de comunidades microbianas en el suelo, rizosfera y raíces en los experimentos de pastos perennes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprenda a aislar y analizar comunidades microbianas del suelo, rizosfera y endosfera en pastos perennes. Este protocolo estandarizado permite estudios de ecología microbiana y salud del suelo con resultados reproducibles.

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El desarrollo de este manuscrito es apoyado por el Centro Nacional de Ciencias Fundación EPSCoR de raíz y Rhizobiome innovación Premio OIA-1557417. La recolección de datos fue apoyada por fondos de la Universidad de Nebraska-Lincoln, investigación y desarrollo agrario y por una subvención de portilla de USDA. También reconocemos el apoyo de la USDA-ARS y fue apoyado por la agricultura y alimentos investigación iniciativa competitiva beca Nº 2011-68005-30411 del Instituto Nacional de alimentos de USDA y agricultura para establecer y gestionar estos campos.

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<li>Bougoure, D. S., Cairney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblages+of+ericoid+mycorrhizal+and+other+root-associated+fungi+from+Epacris+pulchella+%28Ericaceae%29+as+determined+by+culturing+and+direct+DNA+extraction+from+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots.</a> Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).</li>
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<li>Gottel, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+microbial+communities+within+the+endosphere+and+rhizosphere+of+populus+deltoides+roots+across+contrasting+soil+types%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).</li>
<li>Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+three+endophytic%2C+indole-3-acetic+acid-producing+yeasts+occurring+in+Populus+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Mycological+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees.</a> Mycological Research. 113, 973-980 (2009).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biolology%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biolology. 12, 87(2014).</li>
<li>Gohl, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+improvement+of+amplicon+marker+gene+methods+for+increased+accuracy+in+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).</li>
<li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+MiSeq+Illumina+sequencing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform.</a> Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li>
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<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPARSE%3A+highly+accurate+OTU+sequences+from+microbial+amplicon+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads.</a> Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li>
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<li>Yeoh, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+root+microbiome+of+sugarcanes+cultivated+under+varying+nitrogen+fertilizer+application%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application.</a> Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos descritos en este manuscrito deberían permitir a los científicos entrar fácilmente en el campo de la metagenómica de suelo y planta. Con los años, hemos refinado nuestros métodos desde realizar el experimento descrito en este manuscrito. Un cambio es que ahora la etiquetamos los tubos antes de salir al campo a la muestra. Nuestro laboratorio utiliza un sistema de código de barras y una impresora de etiquetas. La impresora no sólo ahorra tiempo cuando etiquetado tubos, pero también lo hace todo más fácil para seguir y para identificar correctamente las muestras sin los caprichos de la escritura de la mano humana. Otro punto crítico es que tratamos de procesar el material después de traerlo detrás del campo tan pronto como sea posible. Nuestro objetivo es congelar el suelo utilizado para el análisis de ADN, esterilizar y congelar las raíces y filtrar y congelar la rizosfera dentro de 12 a 36 horas después de regresar del campo. Los procedimientos de extracción de ADN son largos con muchos pasos, sobre todo de suelos y rizosfera, así que hemos comprado un robot (Kingfisher Flex, ThermoFisher) que minimiza las manos a tiempo para los protocolos de extracción de ADN, reduce los errores humanos que pueden ser introducidos, y mejora la consistencia en la manera diferente se procesan lotes de tierra, raíces o rizosfera. Cuando se trabaja con material vegetal es importante decidir el tipo de raíz a estudiar o a tomar una variedad de tipos de raíz para obtener una "muestra representativa". Mantener las raíces y deja en un estado congelado cuando realizar las extracciones de ADN es importante, como es garantizar no hay ninguna contaminación cruzada entre muestras al llenar placas de extracción de ADN de 96 pocillos. Otro factor importante a considerar es el número de repeticiones cuando diseñar experimentos de campo y utilizando una completa al azar diseño en lo posible26. Debido a la variabilidad del campo alto puede ser necesario disponer de un gran número de repeticiones para detectar pequeñas diferencias. Finalmente, desde nuestra experiencia es esencial para asegurarse de que los suelos no son demasiado mojados cuando excavando las raíces. Si los suelos están saturados con agua no sólo es sucio trabajar con, pero también es muy difícil definir la rizosfera y a quitar el suelo de las raíces.
Una modificación que se hizo durante el desarrollo de estos métodos fue en lugar de agitación de los tubos con la mano para soltar la rizosfera que aumentamos a vortexers alimentado por un generador de gas para facilitar el trabajo en el campo y más estandarizada en términos de el tiempo y forma que cada tubo se agitó. Una limitación del enfoque de secuenciación de amplicones es que la resolución taxonómica de los resultados a menudo es limitada y muchos OTUs conocido desconocido o solamente a nivel de familia o género. Este campo de la investigación está evolucionando rápidamente por lo que es importante ser consciente de los enfoques nuevos y en desarrollo, particularmente para el análisis de datos que puede aumentar la resolución de los resultados.
Estos protocolos son sólo para el estudio de las bacterias y arqueas, no hongos. Se permitirá el uso de diferentes primers para la amplificación para el estudio de las comunidades fúngicas utilizando el mismo DNA muestras27,28. Estos métodos no requieren la compra de grandes cantidades de equipo ya que pueden simplificar los métodos. Los métodos que Describimos aquí son principalmente para determinar "quién está allí", pero el campo está evolucionando rápidamente a importantes preguntas sobre la función, que puede resolverse usando métodos de secuenciación de escopeta, aislamiento y pruebas de la funcionalidad de microbios, o genomas microbianos todo la secuencia.
Los resultados representativos destacan las diferencias en las comunidades microbianas que pueden ser identificadas usando los métodos descritos. Usando un enfoque de diversidad beta para el análisis de datos22, se demostraron diferencias compositivas entre tipos de muestras. Estas diferencias se han observado claramente en la mayoría de los otros estudios donde endosphere, rizosfera y suelo contienen comunidades microbiana3. Se calculó el índice de diversidad de Shannon para determinar la abundancia y la uniformidad de las especies microbianas presentes dentro de cada especie de planta en el suelo, endosphere y rizosfera. Como se muestra en este estudio y en muchos otros, la diversidad alfa es más alta en el suelo, disminuyendo ligeramente en la rizosfera y luego disminuyendo significativamente en el endosphere3,5,29. Estos resultados indican que los métodos aquí descritos son adecuados para la identificación de cambios composicionales en el endosphere, la rizósfera y suelo.
La dominación de las proteobacterias es el encontrar común en estudios de suelo y endosphere30,31,32. Endosphere tiene generalmente una baja diversidad de especies microbianas con una mayor abundancia relativa de las proteobacterias. Otra vez esto pone de relieve que los resultados aquí son representativos de otros hallazgos en la literatura. Los efectos del tratamiento en este estudio no fueron significativamente diferentes y dos razones principales para que pueden ser que no eran lo suficientemente grandes como para generar suficiente variación para detectar las diferencias impuestas por los tratamientos y que este muestreo se realizó al final de la temporada, cuando los campos puedan haber tenido tiempo suficiente para reducir el nitrógeno a niveles similares, que es lo que se midió en el final de la temporada de cultivo. En otro estudio utilizando tasas de fertilización similares durante un tiempo, relativamente pequeños cambios en la composición de la microbioma fueron medidos33. Otros estudios han mostrado cambios en las comunidades de hongos y bacterias debido al nitrógeno fertilizante34,35.
Especies de plantas se sabe que desempeñan un papel en la determinación de su microbiomes3,32,36 y aún pequeñas diferencias en la variación de la comunidad microbiana han sido demostradas entre genotipos de plantas dentro de un sola especie37. En este estudio, se encontró una diferencia significativa en la composición de la comunidad microbiana entre especies de plantas. En todos los tipos de muestra parece que switchgrass tenía la composición microbiana más diferenciada, pero las diferencias entre especies sólo fueron estadísticamente significativas en la endosphere. Composición de la comunidad de rizosfera puede se han convertido en importante si disponía de más repeticiones para el análisis.
Campo combinado, laboratorio los protocolos analíticos descritos aquí proporcionan un método poderoso para el estudio de cómo los diferentes factores influencia la composición de las comunidades microbianas de suelos y rizosfera la endosphere de raíces36. Hay una gran cantidad de trabajos a realizar en el área de estudio de microbiomes, particularmente en los campos agrícolas. Preguntas importantes acerca de cómo los rendimientos se ven alterados por el microbioma del suelo tienen que ser aclarado completamente. Incluso las preguntas más básicas sobre cómo rotaciones influyen en el microbioma de la tierra, cómo el tiempo altera el microbioma, estrés abiótico como altera el microbioma, tipo de suelo interactúa con estos factores para modificar el microbioma y si hay universales microbios en ciertos cultivos o regiones de los Estados Unidos son todas las cuestiones pendientes. Estos métodos también será útiles para estudios epidemiológicos identificar la presencia y persistencia de bacterias patógenas y beneficiosas. Otro horizonte futuro de estos métodos será iniciar la integración de los métodos de ADN descritos aquí con planta y microbio RNA y los datos del metabolito. Mejoría adicional y pruebas de variables será importantes para la mayor optimización de estos protocolos.

Microbioma investigación tiene implicaciones importantes para entender y manipular procesos del ecosistema como nutrientes bicicleta, volumen de materia orgánica y el desarrollo o inhibición de patógenos de suelo1,2. Esta área de investigación tiene también gran potencial para la comprensión de los impactos de los microbios del suelo en la productividad de las comunidades vegetales naturales y agroecosistemas. Si bien hay muchos estudios que se han centrado en el microbioma del suelo en ecosistemas naturales, pocos se han centrado en microbios de la rizosfera y endosphere de la planta en agroecosistemas3. En Nebraska, la agricultura domina el paisaje en gran parte del estado, haciendo los estudios de estos suelos donde agrícola importante cultivos un tema vital para la investigación. El objetivo de este trabajo de métodos es proporcionar a los investigadores un conjunto estándar de protocolos para describir los microbios presentes en los agroecosistemas, para determinar cómo las raíces de plantas modificar las comunidades microbianas en la rizosfera y endosphere y finalmente entender las funciones de que estos microbios juegan en productividad de planta y salud del suelo.
El método presentado aquí difiere ligeramente de los métodos utilizados por otros4,5 en que este documento está dirigido a aprender qué microbios son exclusivamente dentro de la raíz y cómo difieren de los microbios inmediatamente fuera de la raíz en el rizosfera. La secuenciación del amplicón utilizada en este estudio identifica los taxones microbianos encontrados en la muestra de ADN y permite a los investigadores a determinar cómo las comunidades cambian dependiendo del tipo de muestra o tratamiento. Una de las principales diferencias entre este protocolo y un protocolo muy similar utilizada por Lundberg et al. 6 es que en vez de sonicación, este protocolo utiliza esterilización superficial con lejía y el etanol para extraer la rizosfera de las raíces. Otros también han utilizado esterilización superficial efectiva7,8,9,10. Estos métodos no son más ventajosos que otros métodos, pero un poco diferente. Estos métodos son particularmente bien adaptados para los experimentos de campo grande ya con bastante gente que es posible procesar más de 150 parcelas de campo por día, que agrega hasta aproximadamente 450 muestras cuando dividida en endosphere, rizosfera y suelo. Este manuscrito describe en detalle los métodos utilizados para la muestra en el campo, procesar el material en el laboratorio, extraer y secuenciar el ADN y ofrece una breve descripción de los pasos para analizar los datos resultantes de la secuencia.

<table><tbody><tr><td>Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit</td><td>Qiagen/MoBio</td><td>12955-4</td><td>Kit de extracción para suelo y rizosfera</td></tr><tr><td>Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit</td><td>Qiagen/MoBio</td><td>13496-4 Kit de</td><td>extracción para raíces</td></tr><tr><td>Pala de excavación con mango en D, 101 cm L</td><td>Fiskars</td><td>9669</td><td></td></tr><tr><td>Motoazada rápida, 40 cm L</td><td>Bolsas Ziploc Truper</td><td>34316</td><td></td></tr>, <tr><td>17,7 cm x 19,5 cm</td><td>Ziploc</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Nevera</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de lavado</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de plástico</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Guantes (de trabajo y de laboratorio)</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>20 cm de diámetro Tamiz de tierra #8, 2360 &mu; m tamaño de malla</td><td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td><td>US8-8FS</td> 20 cm de <td></td></tr><tr><td>diámetro Tamiz de suelo #4, 4750 &mu; m tamaño de malla</td><td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td><td>US8-4FS</td><td></td></tr> generador <tr><td>portátil</td> La <td>marca Honda funciona bien</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células estériles 100 &mu; m tamaño de malla</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>VWR</td><td>0823</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>VWR</td><td>0404</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Lehman Seeds</td><td>VIS-30</td> Autoclaves de <td>surfactantes</td></tr><tr><td></td><td>Cualquier</td><td>horno</td> de secado NA <td></td></tr><tr><td></td><td>Cualquier</td><td></td> báscula NA <td></td></tr><tr><td></td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lejía</td><td>CLOROX - fuerza doméstica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno líquido</td><td>Cualquiera</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de hielo seco</td><td>Cualquiera</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Cualquiera</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de precisión de punta fina de 11 cm Pinzas de punta recta</td><td>Fisher</td><td>17456209</td><td></td></tr><tr><td>18 cm</td><td>VWR</td><td>82027-436</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de poda de 13,5 cm</td><td>Fiskars</td><td>9921</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 2 mL</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo cónico de PP</td><td>MIDSCI</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo cónico de PP</td><td>MIDSCI</td><td>C50B</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura</td><td>Millipore-sigma</td><td>Milli-Q Integral, Q-POD</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 fluorímetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Para la cuantificación de ADN de muestras extraídas</td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA System</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>Para la cuantificación</td></tr><tr><td>de ADN Negro de 96 pocillos con placas de fondo plano transparente</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>pPNA Bloqueador de PCR</td><td>PNA Bio</td><td>PP01-50</td><td></td></tr><tr><td>mPNA</td><td>PNA Bio</td><td>MP01-50</td><td></td></tr><tr><td>ADN genómico de la comunidad microbiana simulada B (incluso de baja concentración) v5.1L, para secuenciación de genes de ARNr de 16s</td><td>Recursos BEI</td><td>HM782D</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo 8 tiras de pocillos para placas</td><td>VWR</td><td>89134-434</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de acero inoxidable, 3,2 mm de diámetro</td><td>Siguiente Advance</td><td>SSB32</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Bloque de ensayo (placa de extracción de ADN para el Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit)</td>Embudo de pesaje de PP antiestático <td>CoStar</td><td>3959</td><td></td></tr><tr><td>, tamaño pequeño para suelo/rizosfera</td><td>TWD Tradewinds, INC</td><td>ASWF1SPK</td><td></td></tr><tr><td>embudo de pesaje de PP antiestático, tamaño x-small para raíz/hoja</td><td>TWD Tradewinds, INC</td><td>ASWFXSCS</td><td></td></tr><tr><td>Genie 2 Digital Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de vórtice para tubos de</td> <td>50 mLScientific Industries</td><td>SI-H506</td><td></td></tr><tr><td>Mortero (100 mL) y mortero</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microespátula metálica</td><td>VWR</td><td>80071-672</td><td></td></tr><tr><td>Microespátulas antiestáticas desechables</td><td>VWR</td><td>231-0106</td><td></td></tr><tr><td>Marrón Bolsa de papel 2# (10,95 cm x 6,19 cm x 20 cm)</td><td>Duro</td><td>18402</td><td></td></tr><tr><td>5424 Centrífuga para tubo de 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga para placa de 96 pocillos</td><td>Sigma4-16S</td><td>81510</td><td></td></tr><tr><td>Rotor centrífugo para tubos de 50 mL</td><td>Sigma4-16S</td><td>12269 - Biosafe</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi ADN polimerasa</td><td>Kapa Biosystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y análisis de comunidades microbianas en el suelo, rizosfera y raíces en los experimentos de pastos perennes

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Estudios de planta y suelo microbioma se están volviendo cada vez más importantes para comprender que los microorganismos papeles juegan en la productividad agrícola. El objetivo de este manuscrito es proporcionar detalles sobre cómo rápidamente el suelo, rizosfera y endosphere de los ensayos de campo replicados de la muestra y analizar los cambios que pueden ocurrir en las comunidades microbianas debido al tipo de muestra, tratamiento y genotipo de la planta. El experimento utilizado para demostrar estos métodos consiste en parcelas de campo replicado que contiene dos, puro, pastos de estación cálida (Panicum virgatum y Andropogon gerardii) y una mezcla de pasto de baja diversidad (a. gerardii, Sorghastrum nutans, y Bouteloua curtipendula). Brevemente, las plantas son excavadas, una variedad de raíces se cortan y colocan en tampón fosfato y a continuación a agitar para recoger la rizosfera. Las raíces son llevadas al laboratorio en hielo y superficie esterilizado con lejía y el etanol (EtOH). La rizosfera es filtrada y concentrada por centrifugación. Suelo excavado de alrededor de la bola de la raíz se coloca en bolsas de plástico y trajo al laboratorio donde se toma una pequeña cantidad de suelo para las extracciones de ADN. ADN es extraído de las raíces, el suelo y la rizosfera y luego amplificado con cebadores para la región V4 del gene del rRNA 16S. Amplicones son ordenados y analizados con herramientas bioinformáticas de acceso abierto. Estos métodos permiten a los investigadores probar cómo la diversidad de la comunidad microbiana y composición varía debido al tipo de muestra, tratamiento y genotipo de la planta. Utilizando estos métodos y modelos estadísticos, los resultados representativos demuestran que existen diferencias significativas en las comunidades microbianas de suelo, raíces y rizosfera. Métodos presentados aquí ofrecen un conjunto completo de pasos de cómo recoger las muestras de campo, aislar, extraer, cuantificar, amplificar y la secuencia de ADN y analizan la diversidad de la comunidad microbiana y composición en ensayos de campo replicados.

Los resultados representativos presentados en este manuscrito proceden de un sitio de campo establecido en 2012 en la Universidad de Nebraska-Lincoln agricultura investigación división granja cerca de Mead, NE antes del experimento, el sitio había sido manejado como una rotación de maíz-soja . El sitio de estudio se encuentra en tres diferentes tipos de suelos, pero los datos se analizaron como si todos los cambios en las propiedades de suelo medidas fueron debido a los tratamientos impuestos.
El sitio de campo contuvo dos, puro, soportes de switchgrass (libertad de cvp. virgatum ) y big bluestem (a. gerardii) así como una mezcla de hierba baja diversidad que contienen big bluestem, indiangrass (S. nutans) y 'Butte' pasto banderita ( B. curtipendula). Las tres parcelas de césped de temporada cálida fueron en un diseño de bloques completos al azar que se replicó tres veces. Anidado en las tres parcelas de hierba diferente eran dos tratamientos de fertilización de nitrógeno (N) que fueron 56 (N1) y 112 (N2) kg N ha-1 de urea aplicada. En el momento de muestreo del microbioma en el final de la temporada de cultivo, el suelo contenida 8.0 ± 1.1 (media ± SD) ppm nitrato en las parcelas fertilizadas con 112 kg de N ha-1 y 6,8 ± 0.7 (media + SD) nitratos ppm en las parcelas fertilizan con 56 kg N ha-1. Las parcelas habían sido fertilizadas una vez al año. El césped de estación cálida parcelas fueron señaladas como las parcelas principales (8000 m2) y tratamientos de N fueron las parcelas divididas (4000 m2). Bluestem grande fue sembrada como una mezcla de 50: 50 de 'Bonanza' y 'mina ' de oro y tallo fue sembrado como una mezcla de 50: 50 de 'Scout' y 'Warrior'. Las parcelas fueron plantadas en el 2012, y la primera aplicación de N se produjo en la primavera de 2013.
El suelo y muestreo de raíz se realizó en 15 de septiembre de 2014. La obra que se describe a continuación se llevó a cabo en un campo que se estableció como un diseño al azar de parcelas divididas con tres repeticiones (figura 1). La profundidad promedio de la secuencia de todas las muestras de endosphere fueron los siguientes: 4871 ± 5711 (media ± SD), rizosfera: 40726 ± 14684, suelo: 38184 ± 9043. Una de las mayores fuentes de variación en estos experimentos, mediante los métodos descritos, es la diferencia en las comunidades microbianas que se encuentran entre los tipos de muestra (figura 2). En este conjunto de datos representativo, la rizósfera y suelo parecen ser más similares en composición entre sí que el endosphere (figura 2A). Sin embargo, hubo también altamente significativa (p = 0,001) diferencias en la composición de la comunidad microbiana entre la rizósfera y suelo (figura 2B). La variación total en estos experimentos analizados por tipo de muestra fue de 26%.
Análisis de la diversidad alfa demostró que las comunidades microbianas en la endosphere fueron menores en la diversidad de la muestra en comparación con el suelo y la rizosfera (figura 3). Las diferencias significativas sólo en la diversidad entre las especies de hierba en cualquier compartimiento fueron entre las muestras de endosphere de bluestem grande y switchgrass, con switchgrass tiene significativamente mayor diversidad de especies microbianas (figura 3). El análisis de abundancia relativa (figura 4) destaca el predominio de proteobacterias seguido de Actinobacteria en todos los tipos de muestra. Suelo y rizosfera están dominados también por Acidobacteria y Chloroflexi mientras que los endosphere tenía una mayor abundancia relativa de Bacteriodetes.
En este experimento, las plantas fueron cultivadas con dos diferentes cantidades de fertilizante de N y por lo tanto, se analizaron los datos para determinar si existen efectos del tratamiento. Efectos del tratamiento representan 12% de la variación total pero no fueron significativamente diferentes, aunque en la ordenación los dos tratamientos parecen diferentes (figura 5). Esto pone de relieve la importancia de los análisis estadísticos de estos conjuntos de datos en lugar de inspección visual o los juicios cualitativos.
Planta de influencia las diferencias en el microbioma de tejidos de la planta y del suelo fueron visualizadas usando un método limitado de ordenación. Las diferencias estadísticas se determinaron mediante un análisis PERMANOVA para comprobar variables específicas, tales como especie, como resultado en la composición de la comunidad microbiana significativamente diferentes entre las muestras. Cuando todos los tipos de muestra se analizaron juntos, se encontró una diferencia altamente significativa en la composición de la comunidad microbiana debido a especies de plantas (figura 6). En este experimento, la cantidad de variación por especies de plantas fue de 6.7%. Por último, cada tipo de muestra se analizó individualmente para determinar cuál de los tipos de muestra podría conducir el efecto de las especies de planta significativa. Sólo en el endosphere hubo una diferencia altamente significativa (p = 0.001) entre las composiciones de la comunidad microbiana de las diferentes especies de plantas (figura 7). En los otros tipos de muestra, el efecto de especies no fue significativo cuando se analizan individualmente. En el endosphere, la variación porcentual debido a la especie fue 27%, mientras que fue menor en la rizosfera (18%) y suelo (15%). Esto destaca más la importancia de analizar individualmente cada tipo de tejido.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig1.jpg"> Figura 1: ejemplo del diseño de campo experimental. Diseño de campo experimental que ilustra un diseño de bloques completos al azar en triplicado del sitio campo ubicado en la Universidad de Nebraska-Lincoln del este Nebraska centro de investigación y extensión cerca de Mead, NE. Descripción del sitio completo consulte la sección de resultados. N1 es el bajo (56 kg N ha-1 urea) y N2 (112 kg de N ha-1 urea) es la tasa más alta de nitrógeno aplicado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig2.jpg"> Figura 2: Análisis de diversidad Beta que comparaban la composición microbiana en los tipos de diferentes de la muestra incluyendo endosphere, rizosfera y suelo de la toma de muestras de pastos perennes en el 2014. El análisis se realizó utilizando un script de Python en QIIME1.9.1 para producir la matriz de disimilitud de Bray-Curtis. Análisis de coordenadas principales (PCoA) basados en la matriz de disimilitud de Bray-Curtis fue visualizado en RStudio. PCoA1 y PCoA2 indican la primera y segunda varianza explicada por el análisis de PCoA. Se realizó análisis estadístico PERMANOVA para determinar la significancia entre los tipos de muestra y el valor de p se muestra en la esquina superior derecha. Cada símbolo en las figuras representan a toda la comunidad microbiana de cada muestra. (A) tipos de muestras de suelo, rizosfera y Endosphere se analizaron juntos. Todas las 87 muestras fueron enrarecidas a 486 secuencias por muestra. (B) las muestras de rizósfera y suelo se analizaron juntos. Todas las 59 muestras fueron enrarecidas con 8231 secuencias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig3.jpg"> Figura 3: Análisis de diversidad alfa utilizando el índice de Shannon para cada especie en el endosphere, rizosfera y suelo. El análisis se realizó utilizando un script en Python en el QIIME1.9.1. Vacuo se hizo endosphere, rizosfera y tipos de muestras de suelo respectivamente con secuencias 486, 17154 y 8231 por muestra. Cajas indican los percentiles 25 y 75 (primeras y terceros cuartiles). La línea horizontal dentro de la caja indica la mediana y el rojo además muestra la media. Bigotes muestran el rango de los datos excluyendo valores extremos (que se muestran como puntos negros) que cayó más de 1.5 veces el rango intercuartílico (n = 6 para cada muestra excepto de pasto banderita mezcla donde n = 5). El índice de Shannon de las cinco especies en el endosphere fueron más bajas que la rizósfera y suelo. No paramétrica prueba de suma de rango de Wilcoxon fue utilizada para determinar la significancia entre las especies y sólo diferencias significativas entre especies fueron demostradas encima de las cajas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig4.jpg"> Figura 4: abundancia relativa en el nivel de phylum en el suelo, endosphere y rizosfera. Las muestras fueron analizadas para comparar la abundancia de phyla microbiana entre los tipos de muestras diferentes (n = 29 para cada tipo de muestra). El análisis se realizó utilizando un script de Python en QIIME1.9.1 de la tabla de la OTU. Los distintos colores dentro del gráfico indican lo phyla. El porcentaje indica la abundancia relativa de cada phylum en cada tipo de muestra. La información de filo fue anotada con el proyecto de base de datos Ribosomal clasificador (RDP)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig5.jpg"> Figura 5: análisis con tratamiento como factor vinculante entre todos los tipos de muestra. Análisis canónico de análisis de coordenadas principales (CAP) fue realizado para determinar si existen diferencias en la composición de la comunidad microbiana entre los tratamientos. Para cada tratamiento de N, n = 42 para N1 (56 kg N ha-1) y n = 45 para N2 (112 kg de N ha-1). La matriz de disimilitud de Bray-Curtis se generó usando un script en python en el QIIME1.9.1. Se realizó análisis de tapa basado en la matriz de disimilitud de Bray-Curtis al limitar el tratamiento como el factor de RStudio. Se realizan análisis PERMANOVA para determinar si las diferencias de tratamiento fueron significativas, y el valor de p se muestra en la esquina superior derecha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig6.jpg"> Figura 6: análisis utilizando especies de plantas como factor vinculante entre todos los tipos de muestra. Análisis se realizaron para determinar si existen diferencias en la composición de la comunidad microbiana entre especies vegetales en todos los tipos de muestra. Ordenación de coordenadas principales y el análisis de la tapa de todos los tipos de muestra (endosphere, rizosfera y suelo) se realizaron utilizando una matriz de disimilitud de Bray-Curtis. La matriz de disimilitud de Bray-Curtis fue generada usando el script de Python en QIIME1.9.1. Análisis de tapa basado en la matriz de disimilitud de Bray-Curtis fue hecho por restricción de las especies de plantas como el factor de RStudio. Se realizó análisis estadístico PERMANOVA para determinar la significancia entre especies de plantas, y el valor de P se muestra en la esquina superior derecha. Cada símbolo en las figuras representa a toda la comunidad microbiana para esa muestra. n = 18 para cada especie en todos los tipos de muestra excepto n = 15 para la mezcla de grama pasto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig7.jpg"> Figura 7: ejemplo de análisis de PAC con especies como factor de restricción para cada tipo de muestra individualmente. Ordenación de coordenadas principales y el análisis de la tapa de cada tipo de muestra (endosphere, rizosfera y suelo) utilizando la matriz de disimilitud de Bray-Curtis. Cada tipo de muestra fue enrarecido a 486, 17154 y 8231 lecturas por muestra en endosphere, rizosfera y suelo respectivamente. Especies se utilizan como factor para restringir la ordenación. Se realizó análisis estadístico PERMANOVA para determinar la significancia entre especies de plantas en cada tipo de muestra y el valor de p se muestra en la esquina superior derecha. Cada símbolo en la figura representa a toda la comunidad microbiana de cada muestra. Tamaño de la muestra es n = 29 para cada tipo de muestra, n = 6 para cada especie de planta en cada tipo de muestra, excepto para la mezcla de grama de pasto (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Excavación de raíces de las plantas del campo, así como procesamiento de muestras en endosphere, rizosfera y suelo se describen en detalle, incluyendo métodos de análisis de datos y extracción de ADN. Este documento está diseñado para permitir a otros laboratorios a utilizar estas técnicas para el estudio del suelo, endosphere y microbiomes de la rizosfera.

Aislamiento y análisis de comunidades microbianas en el suelo, rizosfera y raíces en los experimentos de pastos perennes

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del microbioma del suelo, la rizosfera y el endosfera de las raíces, como cómo cambia la diversidad de la comunidad microbiana en respuesta al tipo de muestra, el tratamiento y el genotipo de la planta. La principal ventaja de esta técnica es que es muy adecuada para experimentos de campo que requieren un gran número de muestras y replicación. Stephanie Futrell, estudiante de posgrado y técnica de investigación de mi laboratorio, demostraremos el procedimiento.Para comenzar el protocolo, etiquete una bandeja de lavado y un balde con una nota adhesiva con detalles de la muestra de la planta. Lleve el cubo etiquetado a la parcela y deje la bandeja de lavado en la estación de trabajo establecida en el campo. Elija y recoja al azar dos plantas por parcela de diferentes áreas dentro de la parcela.A continuación, perfore la tierra con una pala a una profundidad de 30 centímetros para cortar cualquiera de las raíces laterales que sujetan la planta en el suelo. Excave las raíces de las plantas aprovechando la pala y coloque el cepellón en el cubo etiquetado. Lleve el balde de regreso a la estación de trabajo en el campo.Sacuda las raíces y use una pala o un cultivador de mano para quitar la tierra de las raíces. Use guantes y coloque las raíces cerca de la estación de procesamiento. Después de sacudir las raíces, mezcle la tierra en la bandeja de lavado y rompa los terrones de tierra con un cultivador de mano.Coloque una muestra de tierra que esté libre de escombros en una bolsa de almacenamiento con cremallera etiquetada de 17.7 por 19.5 centímetros y colóquela sobre hielo. Esterilizar las tijeras de podar en etanol al 70%. Use las tijeras estériles para extirpar una variedad de raíces, aproximadamente de cuatro a seis raíces por planta y cada raíz de aproximadamente nueve a 12 centímetros de largo.Coloque las raíces extirpadas en un tubo etiquetado de 50 mililitros que contenga 35 mililitros de tampón de fosfato esterilizado en autoclave con un surfactante como Silwet L-77. Agite los tubos durante dos minutos para liberar la rizosfera de la superficie de las raíces. Mejore el temblor con un generador y un vórtice.Con pinzas esterilizadas en etanol al 70%, retire las raíces del tubo, séquelas brevemente con toallas de papel y colóquelas en un tubo nuevo de 50 mililitros etiquetado. Coloque tanto el tubo que contiene la rizosfera como el que contiene las raíces sobre hielo. Agregue aproximadamente 35 mililitros de 50% de lejía más 0.01%Tween 20 a los tubos de 50 mililitros con raíces recolectadas en el campo.Agite los tubos durante 30 a 60 segundos. Vierta la lejía, agregue 35 mililitros de etanol al 70% y agite las raíces durante otros 30 a 60 segundos. Después de agitar, vierta el etanol al 70% y agregue 35 mililitros de agua estéril ultrapura y vórtice o agite la muestra durante un minuto.Repita el paso de enjuague con agua dos veces más para que la raíz reciba un total de tres enjuagues con agua estéril y ultrapura. Seque las raíces con toallas de papel secas y limpias y use una toalla de papel limpia para cada muestra. Con pinzas estériles y tijeras de podar, corte las raíces en trozos de aproximadamente cinco milímetros y colóquelas en un tubo cónico limpio y etiquetado de 15 mililitros, luego almacene las muestras a menos 80 grados Celsius hasta que se procesen más.Agite los tubos de 50 mililitros que contienen muestras de rizosfera del campo durante 20 a 30 segundos para volver a suspender toda la muestra. Usando un filtro de celdas de malla estéril de 100 micrones, filtre la muestra resuspendida en un nuevo tubo de 50 mililitros. A continuación, centrifugar los tubos a 3.000 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.Vierta y deseche inmediatamente el sobrenadante. Coloque los gránulos de rizosfera en los tubos de 50 mililitros sobre hielo. A continuación, añada 1,5 mililitros de tampón de fosfato estéril sin tensioactivo a los gránulos de la rizosfera y vértice ellos para volver a suspender la muestra.Pipetea el líquido suspendido en un tubo de microfuga limpio y etiquetado de dos mililitros. Gire los tubos a 15, 871 veces g durante dos minutos a temperatura ambiente. Vierta inmediatamente el sobrenadante y escurra los tubos sobre toallas de papel limpias.Almacene los gránulos a menos 20 grados centígrados hasta que se procesen más. Con una espátula de metal estéril, llene un tubo limpio y etiquetado de dos mililitros con aproximadamente tres gramos de tierra para la extracción de ADN y evite los pequeños trozos de raíz y desechos. Enjuague la espátula de metal con etanol al 70% entre cada muestra.Almacene esta muestra de suelo a menos 20 grados centígrados. En una bandeja de lavado limpia, vacíe la bolsa de tierra en tamices apilados con el tamiz más grande encima del tamiz más pequeño y tamice manualmente la tierra a través de ambos tamices. Utilice un cepillo para limpiar cuidadosamente los tamices entre muestras.Reserve de 100 a 125 gramos de tierra tamizada en una bolsa con cremallera de 17,7 por 19,5 centímetros para futuros análisis físicos-químicos y de textura del suelo. Coloque las bolsas de tierra a cuatro grados centígrados para su almacenamiento a corto plazo. A continuación, vierta nitrógeno líquido en un vaso de precipitados de plástico con espátulas limpias y en un mortero limpio.Coloque el pañuelo congelado en el mortero y triélelo con el mortero hasta obtener un polvo fino. Agregue continuamente nitrógeno líquido durante la molienda para mantener las muestras congeladas. Use una espátula para transferir el tejido molido en un tubo limpio y etiquetado de dos mililitros y luego almacene el tejido a menos 80 grados centígrados.Limpie el área de trabajo con 70% de etanol y 1% de lejía doméstica. Retire las muestras de suelo del almacenamiento a menos 20 grados centígrados y descongélelas en una cubeta de hielo. Retire la cubierta del tapete de sellado de una placa de extracción de 96 pocillos y coloque la cubierta entre dos toallitas de papel para mantenerla limpia mientras no esté en uso.Cubra las 12 columnas de la placa con tiras adhesivas de PCR de 8 pocillos para evitar la contaminación. Tara un embudo de pesaje estéril de tamaño pequeño en una báscula y pesa de 200 a 250 miligramos de tierra. Levante con cuidado la tira adhesiva, coloque el cuello del embudo de pesaje lleno en el pocillo apropiado y guíe suavemente la muestra de suelo hacia el pocillo apropiado.Vuelva a colocar la tira adhesiva para cubrir el pozo. Repita este proceso para cada pocillo, utilizando un nuevo embudo estéril para cada muestra. Vuelva a colocar la cubierta del tapete de sellado en la placa de extracción y almacene la placa a menos 20 grados centígrados hasta que esté lista para la extracción de ADN.Retire las muestras de rizosfera del almacenamiento a menos 20 grados centígrados y descongele en una cubeta de hielo. Prepare la placa de extracción de ADN como se hizo en la sección anterior. Coloque una toallita de papel limpia en una báscula, luego tara una espátula de metal estéril en la báscula.Use la espátula para sacar con cuidado un poco de la bolita de rizosfera de un tubo de muestra. Pesar entre 200 y 250 miligramos de la muestra de rizosfera. Levante con cuidado la tira adhesiva para descubrir el primer pocillo de la placa de extracción.Incline la espátula llena en el pocillo y raspe el material de la rizosfera en el pocillo apropiado con un palillo estéril. Enjuague la espátula de metal con agua seguida de etanol al 70% entre muestras. Finalmente, repita este proceso para cada pocillo de la placa hasta que la placa esté llena, dejando un pocillo vacío como control de extracción en blanco.En este conjunto de datos representativo, hubo diferencias altamente significativas entre los tipos de muestra, y la rizosfera y el suelo parecen ser más similares en composición entre sí que la raíz. Un análisis más detallado muestra que también hubo diferencias muy significativas en la composición de la comunidad microbiana entre la rizosfera y el suelo. El análisis de la diversidad alfa muestra que las comunidades microbianas en la endosfera eran más bajas que las comunidades en el suelo y la rizosfera.La única diferencia significativa en la diversidad entre las especies de gramíneas fue entre las muestras de la endosfera de tallo azul grande y pasto varilla. El análisis de abundancia relativa destaca la dominancia de Proteobacteria seguida de Actinobacteria en todos los tipos de muestras. El suelo y la rizosfera están dominados por Acidobacteria y Chloroflexi, mientras que las raíces tenían una mayor abundancia relativa de Bacteriodetes.El análisis de PERMANOVA de todos los tipos de muestras elucidó una diferencia altamente significativa en la composición de la comunidad microbiana debido a las especies de plantas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una serie de pasos para usar en el estudio de los microbiomas del suelo, la endosfera y la rizosfera. Nos gustaría agradecer al EPSCoR de Nebraska y al Programa de Infraestructura de Investigación EPSCoR de la Fundación Nacional de Ciencias Track 1 por el financiamiento parcial de este video educativo.

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Investigación

JoVE Journal

Environment

Entorno

Se presentan métodos para evaluar cómo el riesgo de depredación puede alterar la calidad química de las presas herbívoro mediante la inducción de cambios en la dieta para satisfacer las demandas de mayor estrés, y cómo la descomposición de los cadáveres de estos herbívoros estrés retarda la descomposición posterior residuos vegetales por microorganismos del suelo.

Vinculación de riesgo de depredación, Estrés Fisiológico herbívoro y descomposición microbiana de los desechos de las plantas

Comprender el papel de la heterogeneidad ambiental en la coexistencia de especies se ha centrado generalmente en los tipos de heterogeneidad que son extrínsecos a la composición de especies de la comunidad. Proporcionamos métodos detallados para la creación de nuevos tratamientos de la heterogeneidad del suelo utilizando los suelos sometidos a la retroalimentación acondicionado planta-suelo, o la heterogeneidad intrínseca a la composición de la comunidad.

Protocolo Experimental para la inducida por la planta Manipulación de la heterogeneidad del suelo

El artículo describe un método que incrementa el rendimiento mientras se equilibra el esfuerzo y precisión para la extracción de lípidos de las membranas celulares de los microorganismos para su uso en la caracterización tanto de los lípidos totales como de la abundancia relativa de los lípidos indicadores para determinar la estructura microbiana comunitaria en estudios con muchas muestras.

Un método de extracción y análisis de lípidos para caracterizar los microbios del suelo en experimentos con muchas muestras

Aquí, describimos un protocolo para obtener datos de la secuencia del amplicón del suelo, rizosfera y raíz endosphere microbiomes. Esta información puede utilizarse para investigar la composición y diversidad de las comunidades microbianas asociadas de planta y es conveniente para el uso con una amplia gama de especies de plantas.

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

Aquí describimos un ensayo de crecimiento de plantas hidropónicas para cuantificar la presencia de especies y visualizar la distribución espacial de bacterias durante la colonización inicial de las raíces vegetales y después de su transferencia a diferentes ambientes de crecimiento.

Monitoreo de la Colonización Y Mantenimiento Bacterial en Arabidopsis thaliana Roots en un Sistema Hidropónico Flotante

Describimos un protocolo para muestrear, preservar y seccionar raíces intactas y el suelo de la rizosfera circundante de ambientes de humedales utilizando arroz(Oryza sativa L.) como especie modelo. Una vez conservada, la muestra se puede analizar utilizando técnicas de imagen elemental, como la imagen de especiación química de fluorescencia de rayos X sincrotrón (XRF).

Un método para preservar las raíces y rizosferas de los humedales para imágenes elementales

Los productos a base de glifosato (GBP) son los herbicidas de amplio espectro más comunes en todo el mundo. En este artículo, presentamos pautas generales para cuantificar el efecto de GBP en los microbiomas, desde experimentos de campo hasta análisis bioinformáticos.

Cuantificación del impacto potencial de los productos a base de glifosato en los microbiomas

Las colonias de hongos entomopatógenos se aíslan de muestras de suelo tropical utilizando cebo Tenebrio , cebo Galleria , así como medio artificial selectivo, es decir, agar de dextrosa de papa enriquecido con extracto de levadura suplementado con cloranfenicol, tiabendazol y cicloheximida (medio CTC).

Comparación de métodos para aislar hongos entomopatógenos de muestras de suelo

Este protocolo presenta un resumen detallado de las estrategias para inocular las raíces de las plantas con microbios transmitidos por el suelo. Ejemplificado para los hongos Verticillium longisporum y Verticillium dahliae, se describen tres sistemas diferentes de infección radicular. Se destacan las aplicaciones potenciales y los posibles análisis posteriores, y se discuten las ventajas o desventajas para cada sistema.

Estrategias de inoculación para infectar las raíces de las plantas con microorganismos transmitidos por el suelo

Aquí se presenta un procedimiento rápido y estandarizado para establecer comunidades sinérgicas de biopelículas multiespecie de varios suelos de rizosfera. Se trata de un protocolo único diseñado para sondear y simular la compleja rizosfera de la microbiota del suelo.

Un enfoque para la construcción de comunidades de biopelículas multiespecies a partir del suelo de la rizosfera

Aquí presentamos un estudio establecido en el iDiv Ecotron, cámaras de mesocosmos terrestre con condiciones ambientales controladas por encima y por debajo del suelo, para estudiar los efectos independientes e interactivos de la historia de las plantas y la historia del suelo en el funcionamiento del ecosistema de las comunidades de pastizales a lo largo de un gradiente de diversidad de plantas.

JenaTron - Un enfoque experimental para estudiar los efectos de la historia de las plantas y la historia del suelo en el funcionamiento del ecosistema de pastizales

Aprenda a aislar y analizar comunidades microbianas del suelo, rizosfera y endosfera en pastos perennes. Este protocolo estandarizado permite estudios de ecología microbiana y salud del suelo con resultados reproducibles.

Aislamiento y análisis de comunidades microbianas en el suelo, rizosfera y raíces en los experimentos de pastos perennes

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