Fluorescencia de reflexión interna total de alto rendimiento y microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa utilizando un chip fotónico

El objetivo principal de este manuscrito es presentar un procedimiento de diagnóstico por imágenes de la microscopía TIRF basada en chips fotónicos recientemente desarrollada y la microscopía de localización de una sola molécula, como dSTORM. El componente principal aquí es el chip fotónico que están hechos de series de guía de onda óptica. La luz dentro de la guía de onda óptica se guía sobre la base de la reflexión interna total.

Parte de la luz está presente en la superficie en forma de las ondas evanescentes. Esas ondas evanescentes. Esto los hace adecuados para la iluminación TIRF.

La iluminación TIRF a través de la guía de ondas óptica está disponible en un área extremadamente grande, definida por la geometría de la guía de ondas, y por lo tanto es ideal para imágenes de alto rendimiento. La diferencia clave entre una configuración tradicional de TIRF y dSTORM en comparación con nuestro enfoque es que utilizamos un chip fotónico para iluminar la muestra, en lugar de enviar luz a través de una lente objetivo de imagen. Nuestro enfoque desacopla la iluminación y la parte de luz de la colección, abriendo nuevas posibilidades de imagen.

Coloque el chip en el plato Petri de vidrio con una pinza de oblea y cúbralo completamente con una solución de 1%Hellmanex. Coloque el plato Petri en una placa caliente a 70 grados durante 10 minutos. Mientras esté en la placa caliente, frote la superficie con un hisopo de tejido de sala limpia.

Retire el chip de la placa Petri. Enjuagar con al menos 100 mililitros de agua desionada. Enjuagar con al menos 100 mililitros de isopropanol, teniendo cuidado de que el disolvente no se seque en la superficie para evitar manchas de evaporación.

Enjuagar con al menos 100 mililitros de agua desionada. Seque el chip con una pistola de nitrógeno. Preparar un posterior de 150 micrómetros PDMS girando en un plato Petri.

Utilice un bisturí para cortar un marco de aproximadamente 1,5 por 1,5 centímetros de la capa PDMS. Levante el marco del plato Petri con una pinza. Depositarlo plano en un chip limpio y pulido.

La muestra ya está lista para la siembra de células. Después de la siembra de la célula, retire el chip del medio. Utilice una pipeta para eliminar cualquier exceso de líquido de fuera de la cámara PDMS.

Retire el fluido actual del interior de la cámara PDMS con una tubería mientras agrega aproximadamente 60 microlitros limpios de PBS al mismo tiempo. Sustituya el PBS por 60 microlitros limpios de PBS y déjelo incubar durante un minuto. Repita el paso anterior, dejándolo incubar durante cinco minutos esta vez.

Retire el PBS y sustitúyalo por 60 microlitros de la solución de tinte. Deje que la muestra se incuba durante unos 15 minutos, protegiendola de la luz. Lave la muestra con PBS utilizando el procedimiento descrito anteriormente.

Retire el PBS y sustitúyalo por 40 microlitros del búfer de imágenes al mismo tiempo. Coloque un cubreobjetos en la parte superior, evitando que se formen burbujas de aire debajo. Presione suavemente el cubreobjetos contra la cámara de imágenes para eliminar cualquier exceso de medios.

Utilice una pipeta para eliminar cualquier exceso de medios fuera del cubreobjetos. Limpie el área fuera del cubreobjetos con un hisopo húmedo en agua para evitar cristales formados por residuos de medios de inmersión secos. Esta versión de la configuración consta de tres componentes principales.

El microscopio con el soporte del filtro, la fuente de luz blanca, la cámara y el revólver objetivo. La etapa de acoplamiento, que es una etapa piezoeléctrica de tres ejes, con un láser acoplado de fibra, y una lente de acoplamiento. La etapa de muestra, que es una etapa manual de un eje, con punta e inclinación, con un soporte de vacío.

Tanto el acoplamiento como la etapa de la muestra se montan en una etapa motorizada de dos ejes para la traslación de la muestra. Coloque el chip en el camión de vacío, con la faceta de acoplamiento hacia el objetivo de acoplamiento. Asegúrese de que el chip esté aproximadamente a una distancia focal del objetivo de acoplamiento.

Encienda la bomba de vacío. Encienda el láser a un milivatio. Ajuste aproximadamente la altura de la viruta para que la viga golpee el borde de la misma.

Apaga el láser. Encienda la fuente de luz blanca. Elija una lente objetivo de baja ampliación, por ejemplo, un 10x.

Enfoque el microscopio en una guía de ondas. Traduzca el microscopio a lo largo de la guía de ondas para ver si está bien alineada con la trayectoria óptica. Mueva el microscopio al borde del acoplamiento.

Encienda el láser a un milivatio o menos. Traduzca el microscopio a lo largo del borde de acoplamiento para encontrar la luz láser. Enfoque la viga en el borde de la viruta.

Ajuste la etapa de acoplamiento a lo largo de la trayectoria óptica en la dirección que reduce el tamaño del punto del rayo láser hasta que desaparezca. La viga está ahora por encima o por debajo de la superficie de la viruta. Ajuste la altura de la etapa de acoplamiento hasta que el punto de viga vuelva a aparecer y se maximice.

Repita los dos pasos anteriores hasta que el láser forme un punto enfocado. Mueva el punto enfocado a la guía de onda de interés. Traduzca el microscopio a una distancia corta del borde para que el punto de haz enfocado ya no sea visible.

Apaga la luz blanca. Ajuste el contraste. Si la guía de onda está guiando, la luz dispersa a lo largo de la guía de onda debe ser claramente visible.

Ajuste el eje de la etapa de acoplamiento para maximizar la intensidad de la luz dispersa. Apaga el láser. Encienda la luz blanca.

Ajuste el contraste si es necesario. Vaya a la región de imágenes. Concéntrese con el objetivo de imagine deseado.

Apague la luz blanca. Inserte el filtro de fluorescencia y gire la potencia del láser a un milivatio. Establezca el tiempo de exposición de la cámara en aproximadamente 100 milisegundos.

Ajuste el contraste según sea necesario. Asegúrese de que el acoplamiento sigue optimizado. Localice una región de interés para la creación de imágenes.

Active el bucle de etapa piezoeléctrica para promediar los nodos. Captura al menos 300 imágenes. Cargue la pila de imágenes capturada en Fiji mediante una pila virtual.

En el menú de imágenes de Fiji, elija Stacks y Z Project. Calcule la imagen TIRF eligiendo Tipo de proyección, Intensidad media. Encienda el láser en un milivatio y ajuste el tiempo de exposición de la cámara a 30 milisegundos.

Ajuste el contraste y el enfoque. Aumente la potencia del láser hasta que se observe el parpadeo. Amplíe una pequeña región de la muestra.

Ajuste el contraste. Captura algunas imágenes para ver si los parpadeos están bien separados. Ajuste el tiempo de exposición de la cámara para un parpadeo óptimo.

Encienda el bucle del escenario piezoeléctrico. Grabe una pila de imágenes de al menos 30.000 fotogramas, dependiendo de la densidad parpadeante. Abra Fiji y cargue la pila dSTORM como imágenes virtuales.

Ajuste el contraste si es necesario. Utilice la herramienta rectángulo para seleccionar el área que desea reconstruir. Abra el análisis de Run en el complemento ThunderSTORM en Fiji.

Establezca los ajustes básicos de la cámara en ThunderSTORM, correspondientes a su dispositivo. Los parámetros predeterminados restantes suelen ser satisfactorios. Comience la reconstrucción.

La lista de localización proporcionada por el software de reconstrucción se filtra para eliminar las localizaciones no específicas. Si es necesario, se aplica una corrección de deriva adicional. La principal diferencia entre las imágenes basadas en chip y las imágenes tradicionales está en la instrumentación y la adquisición de datos.

Por lo tanto, la calidad de las imágenes reconstruidas se puede evaluar de la misma manera que una imagen a partir de un microscopio comercial de superconorción. Dado que se utilizan guías de onda multimodo, la imagen resultante podría, sin embargo, exhibir excitación inhomogénea si se recogen muy pocas imágenes. Esto se muestra en el panel a.

El aumento de la cantidad de patrones de excitación debe dar lugar a una excitación inhomogénea, como se muestra en el panel b. Aquí hemos imágenes de células endoteliales sinusoidales hepáticas, con membrana plasmática con etiqueta fluorescente. Los paneles a y b son imágenes limitadas por difracción.

El panel c muestra una imagen limitada por difracción del inserto en el panel b. El panel d muestra una imagen dSTORM de la misma región. Las células endoteliales sinusoidales hepáticas tienen fenestraciones de tamaño nanométrico en su membrana plasmática, que son claramente visibles en la imagen de superresoría en el panel d.

Una de las principales ventajas de la imagen de superresorción basada en chip es el gran campo de visión que es alcanzable. El panel a muestra una imagen dSTORM de 500 micras por 500 micras de gran tamaño de células endoteliales sinusoidales hepáticas con microtubulina etiquetada fluorescentemente. El panel b muestra el inserto magenta del panel a, con imágenes de difracción limitadas y superconorción para la comparación.

El panel c muestra el inserto verde del panel a. La resolución de la imagen capturada es de 77 nanómetros. En este video, hemos realizado un gran campo de visión TIRF y dSTORM imágenes de células endoteliales sinusoidales hepáticas utilizando un chip fotónico para la iluminación.

Nuestro método es menos complejo, más compacto y más flexible que la forma convencional de realizar TIRF utilizando un objetivo de microscopio de una apertura numérica predeterminada y un campo de visión bajo. La microscopía de localización, como dSTORM, es una de varias técnicas de imágenes de super resolución que hemos explorado utilizando chips fotónicos. Por ejemplo, la luz puede estar mucho más estrechamente confinada dentro de un material de guía de onda óptica de alto índice de refracción de lo que es posible utilizando una lente objetivo de imagen.

Esta propiedad de la iluminación de virutas ha encontrado aplicación en el aumento de la resolución del método de microscopía óptica basada en fluctuaciones de intensidad y la microscopía de iluminación estructurada. Además, los chips fotónicos también se benefician de la miniaturización, la rentabilidad y una configuración óptica sencilla. Al ser una tecnología integrada hace que sea compatible con otras funciones ópticas en chip.

En conjunto, esto hace posible el retroadaptación en microscopios convencionales limitados por difracción, lo que permite una super-resolución a un bajo costo.