Método autoradiográfico cuantitativo para la determinación de las tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales in Vivo

La medición de las tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales puede rastrear la respuesta del cerebro a cambios a largo plazo tales que ocurren durante el desarrollo y la neuroplasticidad. Nuestro método tiene las ventajas de que las mediciones son totalmente cuantitativas, y se hacen en el animal despierto que se comporta. La técnica autorradica cuantitativa permite mediciones en todas las regiones cerebrales simultáneamente.

Demostrando el procedimiento estarán Anita Torossian, una compañera post-bachillera en mi laboratorio, y Tianjian Huang, nuestro cirujano animal. Comience este procedimiento con la preparación para la cirugía como se detalla en el protocolo de texto. Una vez en la etapa de la cirugía, utilice tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de un centímetro desde la parte medial superior del muslo izquierdo rostralmente hacia la línea media revelando la arteria femoral y la vena.

Retirar la piel suelta con ganchos quirúrgicos de la piel por encima y a ambos lados de la incisión. Asegure los ganchos de la piel pegándolos a la etapa de la cirugía. Aplicar cloruro de sodio estéril al 0,9% en el área expuesta para mantener una humedad adecuada.

Use fórceps para diseccionar contundentemente, separando el tejido conectivo alrededor de una pequeña sección de la arteria femoral y la vena. Separe cuidadosamente la arteria y la vena. Ahora usa fórceps para enhebrar una hebra de sutura absorbible debajo de la vena femoral y la arteria en el punto más lateral de la incisión.

Tire de la sutura hasta la mitad para que los extremos estén uniformes. En un punto más proximal a la ingle, utilice fórceps para enhebrar una segunda sutura solo debajo de la vena femoral. Ate suavemente un medio nudo que se utilizará para restringir el flujo sanguíneo.

En un punto entre la hebra A y la hebra B, utilice fórceps para enhebrar una tercera sutura solo debajo de la vena femoral. Ate suavemente un nudo completo que se utilizará para restringir el flujo sanguíneo. Tenga cuidado de no romper la vena.

Tire suavemente de la hebra B para restringir el flujo sanguíneo. Use un hemostat para tirar suavemente de la hebra B para mantener la restricción de sangre. Ahora, conecte el extremo sin corte del tubo de PE a una aguja de calibre 32 y una jeringa de un milímetro llena de solución salina heparinizada.

Enjuague el catéter para eliminar las burbujas de aire. Cortar un pequeño agujero en el área restringida de la vena femoral con micro tijeras, e insertar cuidadosamente el extremo en ángulo del PE enrojecido ocho tubos hacia la hebra B.Una vez insertado, liberar la tensión de la hebra B y guiar el catéter más arriba de la vena. Apriete la hebra B alrededor de la vena que contiene el catéter.

Usando la hebra C, ate un nudo adicional alrededor del catéter. Asegúrese de que este nudo no capture la arteria femoral. Tire suavemente del barril de la jeringa para llenar parcialmente el tubo con sangre para asegurarse de que el catéter se ha implantado correctamente antes de insertar un catéter PE 10 en la arteria femoral izquierda utilizando el mismo procedimiento.

Una vez que se hayan asegurado tanto la vena femoral como los catéteres arteriales, ate la hebra A en un nudo alrededor de ambos catéteres. Después de cortar todo el exceso de suturas y eliminar los ganchos de la piel, enjuague el catéter arterial con solución salina heparinizada para evitar la coagulación. Cauterizar los extremos de ambos catéteres para crear un sello.

Coloque el ratón en la posición propensa y haga una pequeña incisión en la base del cuello aplicando solución salina a la zona expuesta. Inserte una varilla metálica hueca subdérmicamente desde la incisión del cuello hasta la incisión femoral. Snake los catéteres a través de la varilla hueca y fuera de la incisión del cuello.

Después de extraer la varilla hueca, cierre la incisión femoral con sutura seguida de analgesia postquirúrgica. Snake los catéteres a través de un tubo hueco flexible de 30 centímetros para hacer la correa de resorte antes de suturar el botón de la correa de resorte debajo de la piel seguido de analgesia postquirúrgica. Mueva el ratón a un contenedor cilíndrico transparente con un soporte giratorio y brazo para albergar el ratón durante el período de recuperación.

Coloque un calentador de manos debajo del recipiente para mantener el ratón caliente. Asegúrese de que el ratón está en un estado fisiológico normal al comienzo del experimento tomando muestras como se detalla en el protocolo de texto. Para administrar el trazador por vía intravenosa, utilice un conector Y con una jeringa que sostenga el trazador de leucina etiquetado C 14 conectado a un brazo, y una jeringa con 100 a 200 microlitros de solución salina estéril para vaciar la línea venosa conectada al otro brazo.

Conecte el conector Y a la línea venosa. Inicie el estudio iniciando simultáneamente un cronometrando un reloj de parada, inyectando el trazador y recogiendo muestras de sangre arterial cronometrando. Enjuague la línea venosa con solución salina inmediatamente después de la inyección.

Recoger muestras de sangre del uno al siete continuamente durante los primeros dos minutos del experimento de la misma manera. Después de recoger las siete muestras, recoja 30 microlitros de sangre espacial muerta antes de cada muestra restante. Las muestras de ocho a 14 se recogen en tres, cinco, 10, 15, 30, 45 y 60 minutos respectivamente.

En algún momento del experimento, procese tres tubos para estándares internos que contengan leucina tritiada y norleucina como se detalla en el protocolo de texto. Para cuantificar las concentraciones plasmáticas de leucina, utilice un sistema HPLC con una columna de intercambio catiónico de sodio y derivación posterior a la columna con detección de ortoftaldehído y harina. El área bajo la curva de leucina es proporcional a la concentración de leucina en la muestra.

Utilice la comparación con las normas para cuantificar las concentraciones de leucina en las muestras. A continuación, utilice un contador de centelleo líquido para cuantificar las desintegraciones por minuto de tritio y C 14 en las muestras de plasma. Utilice estas concentraciones para construir la curva de aclaramiento de C 14 etiquetada leucina a partir de la circulación y el curso de tiempo de su actividad específica en el plasma arterial.

A partir del gráfico, calcule la actividad específica de leucina etiquetada C 14 integrada en el plasma arterial. Para realizar la autoradiografía cuantitativa, prepare las secciones cerebrales de 20 micras de espesor. Sección del cerebro por medio de un criostato a menos 20 grados centígrados.

Secciones de montaje de descongelación en portaobjetos recubiertos de gelatina. Después de la fijación de las diapositivas, organice las diapositivas en un casete de película de rayos X junto con un conjunto de estándares de metacrilato de metilo previamente calibrados. En una habitación oscura y bajo una luz segura, coloque un pedazo de película de rayos X, el lado de la emulsión hacia abajo sobre los lados y los estándares.

Cierre el cassette y colóquelo en una bolsa de cambio negra. Desarrolle las películas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. No se recomienda el desarrollo automatizado de películas porque el fondo puede ser desigual y puede afectar a la cuantificación.

Construir una curva de calibración de densidad óptica frente a la concentración del tejido C 14 basada en los valores de densidad óptica del conjunto de estándares calibrados en la película. Ajuste estos datos a una ecuación polinómica. Una ecuación polinómica de segundo o tercer grado encaja muy bien.

Para analizar regiones cerebrales específicas, localice la región de interés o ROI en seis a ocho secciones en comparación con un atlas cerebral. Registre la densidad óptica de los píxeles dentro de un ROI en todas las secciones. En función de la curva de calibración, calcule la concentración del tejido C 14 en cada píxel.

Por último, calcular las tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales a partir de la concentración media de tejido C 14 en el ROI en la integral de las proporciones de las concentraciones plasmáticas arteriales de leucina no etiquetada y etiquetada a veces t y lamba. La fracción de leucina en la piscina precursora de tejido que proviene del plasma. Aquí se muestran imágenes representativas de un animal tratado con vehículo en comparación con un animal tratado con anisomicina, un inhibidor de la síntesis de proteínas.

Las tasas de síntesis de proteínas son proporcionales al nivel de oscuridad en la imagen. La anisomicina reduce drásticamente las tasas medidas de síntesis de proteínas cerebrales que indican la especificidad de este método. Aquí, los autoradiogramas digitalizados se muestran a partir de un ratón de comportamiento despierto a nivel del hipocampo y el hipotálamo.

Las regiones más oscuras tienen mayores tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales. Aquí se muestra un autoradiograma digitalizado de un ratón de control de comportamiento despierto a nivel del hipocampo dorsal. Las tasas de síntesis de proteínas cerebrales están recubiertas de color en las imágenes de acuerdo con la barra de color.

Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que los animales están en un estado fisiológico normal durante las mediciones. Nuestra metodología ya ha demostrado la desregulación de la síntesis de proteínas en trastornos del neurodesarrollo como el síndrome de X frágil. También puede ser un marcador útil para cambios degenerativos y condiciones como la enfermedad de Alzheimer.

El método de síntesis de proteínas se puede utilizar junto con la histoquímica inmune en secciones alternas para correlacionar los cambios en la síntesis de proteínas con los cambios regionales en proteínas específicas. En resumen, el método cuantitativo de leucina autoradiográfica L-1 C 14 es ideal para la determinación precisa de las tasas regionales de síntesis de proteínas in vivo. Ofrece ventajas considerables en términos de precisión y su aplicabilidad a las condiciones in vivo.