Proteómica de arriba hacia abajo a gran escala mediante electroforesis capilar de zona Spectrometry total en tándem

Este método puede ayudar a mejorar la caracterización a gran escala y de alta resolución de las isoformas proteicas y las modificaciones post-traduccionales de proteínas en las células. La principal ventaja de esta técnica es que la espectrometría de masas de electroforesis de zona capilar ofrece una separación altamente eficiente y una detección altamente sensible de proteínas intactas. Para pretratar el capilar, séquelo con gas nitrógeno a 10 psi durante al menos 12 horas.

A continuación, llene el capilar con 50%volumen por volumen de metacrilato de 3 propilo en metanol utilizando una bomba de jeringa. Selle ambos extremos del capilar con goma de sílice. Después de incubar a temperatura ambiente durante al menos 24 horas, continúe con un recubrimiento lineal de poliacrilamida en la pared interna del capilar de separación, como se describe en el protocolo de texto.

Quemar una porción del capilar utilizando una llama suave para eliminar el recubrimiento exterior de poliamida a unos cuatro centímetros de distancia de un extremo del capilar. Limpie suavemente la parte quemada del capilar limpiando para eliminar completamente el recubrimiento de poliamida. Taladre un pequeño agujero al final de un tubo de 200 microlitros alrededor del mismo tamaño que el diámetro exterior capilar para mantener suficientemente el capilar en su lugar una vez que se enhebra a través de este agujero.

Enrosque el extremo del capilar que está cerca de la parte quemada a través del agujero hasta que la porción quemada esté en el tubo. A continuación, agregue aproximadamente 150 microlitros de HF al tubo de 200 microlitros para que la solución hf esté aproximadamente a la mitad de la parte quemada en el capilar. Incubar el capilar en la solución de HF a temperatura ambiente durante 90 a 100 minutos.

Prepare la mezcla de proteínas estándar y la muestra de E.coli como se describe en el protocolo de texto. Para configurar la electroforesis de zona capilar, o sistema CZE, cargue la muestra, el electrolito de fondo y el capilar de separación en el automuestrador CZE. Seleccione la carga de muestra en la página de control manual del muestreador automático CZE.

Cargue el vial de electrolito de fondo en la bandeja tampón del muestreador automático, observando su posición en la bandeja tampón. A continuación, cargue el vial de muestra en la bandeja de muestra del muestreador automático, observando su posición en la bandeja de muestras. Coloque el muestreador automático en la posición de alineación mediante el control manual.

Ahora, cargue el capilar de separación en el automuestrador CZE utilizando el extremo no grabado del capilar. Ajuste la altura del extremo de inyección del capilar si el volumen de la muestra es inferior a 50 microlitros. Cambie el muestreador automático a modo de espera mediante el control manual.

Escriba la posición de la muestra en el sistema y mueva el capilar a la muestra. Empuje el extremo de inyección del capilar más abajo para llegar a la parte inferior del vial de la muestra. Continuando con el control manual, enjuague el capilar con el electrolito de fondo durante 20 minutos con una presión de 20 psi.

Ahora, monte una interfaz de flujo de vaina bombeada electrocinetically comercial en la parte delantera del espectrómetro de masas. Llene el depósito de tampón de vaina con un tampón que contenga metanol de volumen del 10% y ácido fórmico de volumen del 0,2%en agua de grado LCMS. Enjuague la T en la interfaz con el tampón de la vaina mediante la aplicación de presión manualmente con una jeringa.

Enrosque el extremo de un milímetro de diámetro exterior de un emisor de electrospray a través de un tubo de manguito y conecte el emisor con un puerto de la T a través de un accesorio. Simplemente enjuague la T manualmente de nuevo con una jeringa para llenar el emisor con el tampón de vaina. Ajuste la distancia entre el orificio del emisor y la entrada del espectrómetro de masas a aproximadamente dos milímetros con la ayuda de la cámara que viene con la interfaz.

Aplique una tensión de dos a 2,2 kilovoltas en el vial de tampón de vaina para electrospray. A continuación, ajuste la tensión de pulverización para alcanzar una electrospray estable. Aplicar una presión baja en el extremo de inyección del capilar durante este proceso para asegurarse de que no hay burbujas en el capilar.

Apague la tensión de pulverización y enrosque suavemente el extremo grabado del capilar de separación a través de la T en el emisor hasta que no pueda ser empujado más. Después de detener la baja presión en el extremo de inyección del capilar, enjuague el emisor un poco con el tampón de vaina. Una vez más, aplicar de dos a 2,2 kilovoltas de voltaje de pulverización para probar el aerosol.

Seleccione un nuevo método en el menú desplegable del archivo en la pantalla principal del instrumento. Allí, seleccione la entrada como vial de muestra inicial, vial de muestra final, bandeja como muestra, presión como cinco psi, kilovoltas como cero y duración de 95 segundos para una inyección de muestra. A continuación, establezca la entrada como vial de entrada, la bandeja como tampón, la presión como cero psi, los kilovoltas como 30 y la duración como 4.200 segundos para la separación de la muestra de mezcla de proteína estándar.

Para la separación de la muestra de proteome de E.coli, ajuste la entrada como vial de entrada, la bandeja como tampón, la presión como cero psi, los kilovoltas como 20 y la duración como 6.600 segundos. Por último, seleccione la entrada como vial de entrada, la bandeja como tampón, la presión de 10 psi, los kilovoltas como 30 y la duración de 600 segundos para el lavado capilar. Ahora, configure los parámetros MS y MS/MS para el análisis de proteínas intactos utilizando un espectrómetro de máscara de trampa de iones cuádruples.

Para ajustar la configuración del archivo de ajuste, active el modo de proteína intacta y utilice una presión de reventado de 0,2. Ajuste la temperatura capilar de transferencia de iones a 320 grados Celsius y el nivel de RF de lente S a 55. Para realizar el experimento CZE MS/MS, inicie el método de adquisición de datos en el equipo del espectrómetro de masas, primero seleccionando la secuencia de ejecución.

A continuación, inicie la secuencia de electroforesis capilar en el ordenador de automuestración de electroforesis capilar. Realice una búsqueda de base de datos con TopPIC en la suite TopPIC y en la interfaz gráfica de usuario de TopPIC. Haga clic en el archivo de base de datos y seleccione una base de datos adecuada para la búsqueda.

Haga clic en el archivo de espectro y seleccione el ms2 generado. msalign archivo generado como entrada. Seleccione el archivo de entidades MS1 y elija el archivo de entidades generado.

Establecer cisteína carbamidomethyl C57 como una modificación fija debido al tratamiento de la iodoacetamida. Seleccione la función de base de datos de señuelo y, en Configuración de corte, seleccione la tasa de detección falsa en el menú desplegable junto al nivel de espectro. Establezca la tasa de detección falsa en 0.01 en el nivel de espectro.

Deje la función de generación sin seleccionar y establezca la tolerancia de error en 15 partes por millón. Establezca la tasa de detección falsa en 0,05 en el nivel de proteoformo. En Parámetros avanzados, seleccione dos para el número máximo de turnos de masa en el menú desplegable.

Establezca el desplazamiento de masa máximo de modificaciones desconocidas en 500 daltons. Deje todos los demás parámetros en sus valores predeterminados y haga clic en el botón de inicio en la parte inferior derecha de la interfaz gráfica de usuario. Se muestra el electroferograma representativo para la mezcla de proteínas estándar.

La mezcla de proteínas estándar se ejecuta normalmente al menos por duplicado para evaluar la eficiencia de separación y la reproducibilidad del sistema. La eficiencia de separación se puede evaluar con el número de placas teóricas de algunas proteínas. La reproducibilidad puede evaluarse por las desviaciones estándar relativas de la intensidad de las proteínas y el tiempo de migración.

La plataforma CZE MS/MS se puede utilizar para la caracterización a gran escala de proteoformas en varios proteomas complejos, identificando más de 500 proteoformas y 190 proteínas de un proteoma de E.coli en una sola carrera con alta confianza. Aquí, se puede utilizar un zoom en la vista del electroferograma para evaluar la ventana de separación del sistema. El muy bajo valor E y FDR espectral sugiere la alta confianza del ID proteoformo.El alto número de iones de fragmentos emparejados indica además la alta confianza del ID.Al intentar este procedimiento, es importante recordar enhebrar el capilar de separación grabado en el emisor de electrosprayter lentamente y suavemente.

El etiquetado de isótopos estables o los métodos libres de etiquetas se pueden incorporar en el procedimiento CZE MS para determinar cómo cambia la abundancia de proteoformos en las células en varias condiciones. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la proteómica de arriba hacia abajo exploraran las funciones de los proteoformos en la regulación de diversos procesos biológicos en las células. No olvide que trabajar con ácido fluorhídrico puede ser extremadamente peligroso y las precauciones tales como el equipo de protección personal adecuado y tener procedimientos de emergencia en su lugar siempre deben tomarse al realizar este procedimiento.