Un enfoque simplificado para la proteómica basada en espectrometría de masas utilizando regiones de tejido seleccionadas

Hemos desarrollado un método simplificado para estudiar el proteoma en regiones específicas de muestras de tejido superior utilizando espectrometría de masas. Nuestro objetivo es mejorar la técnica proteómica, incluida la preparación de muestras y el análisis por espectrometría de masas, para lograr una alta precisión y fiabilidad. Un desafío en la proteómica espacial basada en FFPE es la digestión incompleta de proteínas, lo que reduce la cobertura general de proteínas.

Superar estos requiere protocolos de digestión optimizados y estrategias mejoradas de espectrometría de masas para mejorar las profundidades y la precisión del proteoma. Identificamos distintas alteraciones proteicas en diferentes tipos de enfermedad pancreática, proporcionando información sobre las diferencias entre las afecciones benignas y precancerosas. Estos hallazgos podrían ayudar en el diagnóstico temprano del cáncer de páncreas.

Nuestro objetivo es avanzar en el método de proteinasa del paciente para lograr un mapeo de proteínas de alta resolución dentro de las regiones de los tejidos. Utilizando la proteómica basada en espectrometría de masas, buscamos identificar firmas moleculares específicas de la región que contribuyan al descubrimiento de biomarcadores. Nuestro enfoque integra esas trampas para el paciente y la preparación previa con la espectrometría de masas de ocasión independiente de los datos para generar rápidamente datos de proteoma de alta calidad a partir de regiones seleccionadas de tejido FFPE.

Este método permite una gran cuantificación del proteoma espacial. Para comenzar, prepare un portaobjetos de tejido teñido con hematoxilina y eosina o con inmunohistoquímica con la región de interés indicada por un patólogo. Coloque el portaobjetos de tejido sin teñir y el portaobjetos de tejido teñido de espalda con espalda, asegurándose de una alineación adecuada.

Con un bisturí, extraiga las regiones de tejido que no sean de interés y raspe las regiones de tejido de interés hacia el centro del portaobjetos. Transfiera el tejido recolectado a un tubo limpio de unión a proteínas de 1,5 mililitros y agregue 180 microlitros de tampón de lisis SDS a cada tubo. Realice la sonicación de la sonda al 20% de amplitud durante 10 ciclos de cinco segundos de encendido y cinco segundos de apagado.

Ahora, incube las muestras a 100 grados centígrados durante 3,5 horas manteniendo una velocidad de 1.000 G. Después de la incubación, deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, centrifugar a 16.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para separar los restos de tejido del sobrenadante. Recoja el sobrenadante en un tubo limpio y etiquetado y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior.

Para la precipitación de acetona, coloque la muestra de proteína correspondiente a 100 a 300 microgramos en un tubo compatible con acetona. Luego, agregue acetona helada, previamente enfriada a menos 20 grados Celsius, en un volumen cinco veces mayor que el volumen de la muestra. Incuba la mezcla a menos 20 grados centígrados durante 18 horas.

Después de la incubación, centrifugar el tubo a 16.000 g durante 15 minutos. Deseche con cuidado el sobrenadante sin alterar la pelletza de proteína. Agregue 500 microlitros de acetona templada a menos 20 grados centígrados y centrifuga.

Después de decantar el sobrenadante, seque la muestra al aire. Prepare el tampón de lisis de atrapamiento de suspensión en agua desionizada. A continuación, añada 40 microlitros del tampón preparado al tubo de muestra y haga un vórtice completo para disolver la pastilla de proteína secada al aire.

Coloque la muestra en una incubadora agitadora a 100 grados centígrados a 1.000 g durante 35 minutos. A continuación, añada 10 microlitros del reactivo alquilante a la muestra e incube la muestra a temperatura ambiente a 300 g durante una hora. Dentro de una campana de gases químicos, agregue cinco microlitros de ácido tricloroacético al 10% a la muestra, lo que hace que el volumen total sea de 55 microlitros.

Verifique el pH de la muestra con papel de pH para asegurarse de que sea inferior a uno. A continuación, añada 350 microlitros de tampón de unión a la muestra para atrapar las proteínas. Coloque la columna de captura de suspensión en un tubo de dos mililitros y transfiera toda la muestra, incluido cualquier material insoluble, a la columna.

Centrifugar la columna a 4.000 g durante 50 segundos para atrapar las proteínas. A continuación, añade 400 microlitros de tampón de lavado dos. Después de centrifugar, deseche el flujo.

Después del lavado final, centrifugar la columna a 4.000 g durante 1,25 minutos para asegurar el paso completo del tampón uno. Agregue 125 microlitros de tampón de digestión a la columna de captura de suspensión y cúbrala para evitar la evaporación. Incubar la muestra a 37 grados centígrados durante 18 horas sin agitar.

A continuación, añada 80 microlitros de tampón de elución a la columna de captura de suspensión y centrifugar a 4.000 g durante 1,25 minutos. Extraiga los péptidos eluidos y transfiéralos a un tubo nuevo y limpio. Después de la cuantificación de péptidos, liofilizar 20 microgramos de péptidos.

Volver a disolver los péptidos liofilizados en 40 microlitros de tampón acuoso que contenga un 3% de acetonitrilo en agua con ácido fórmico al 0,1% y sonicar durante 10 minutos en un baño de sonicación. Centrifugar la muestra a 16.000 g durante 60 minutos y transferir el sobrenadante a viales para el análisis por espectrometría de masas. Inyecte dos microlitros de cada muestra utilizando el muestreador automático del sistema de espectrometría de masas de cromatografía nanolíquida.

Péptidos separados en una columna de fase reversa empaquetada con material C18 de tres micrómetros utilizando un gradiente de 127 minutos de acetonitrilo de cinco a 35% a 100 nanolitros por minuto. Ionice los péptidos a través de una fuente de iones nanospray y transfiéralos a un espectrómetro de masas basado en Orbitrap. Analice los péptidos mediante un método de adquisición independiente de datos de rango estrecho.

El aislamiento preciso de la región de interés durante el procesamiento de tejidos FFPE se logró en diferentes tejidos pancreáticos quísticos fijados en formalina e incluidos en parafina. Se obtuvieron cromatogramas iónicos totales reproducibles entre trireplicas biológicas para cada tipo de neoplasia quística pancreática. El análisis de espectrometría de masas por cromatografía líquida identificó 9.703 proteínas.

La abundancia de todas las proteínas identificadas abarcó 6,25 órdenes de magnitud, lo que demuestra una cobertura completa del proteoma, y se cuantificaron los marcadores de proteínas de cáncer de páncreas conocidos. Se identificaron un total de 933 proteínas expresadas diferencialmente, con 457 reguladas al alza y 476 a la baja en las neoplasias mucinosas papilares intraductales. El análisis bioinformático reveló que las proteínas expresadas diferencialmente se asociaron con varias vías relacionadas con el cáncer de páncreas.