Un enfoque simplificado para la proteómica basada en espectrometría de masas utilizando regiones de tejido seleccionadas
18 de abril de 2025
Aquí, establecemos un método proteómico basado en espectrometría de masas utilizando regiones aisladas de interés en secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina. Este protocolo se utiliza para analizar el proteoma de áreas específicas de tejido en secciones de tejido archivadas fijadas en formol e incluidas en parafina.
Hemos desarrollado un método simplificado para estudiar el proteoma en regiones específicas de muestras de tejido superior utilizando espectrometría de masas. Nuestro objetivo es mejorar la técnica proteómica, incluida la preparación de muestras y el análisis por espectrometría de masas, para lograr una alta precisión y fiabilidad. Un desafío en la proteómica espacial basada en FFPE es la digestión incompleta de proteínas, lo que reduce la cobertura general de proteínas.
Superar estos requiere protocolos de digestión optimizados y estrategias mejoradas de espectrometría de masas para mejorar las profundidades y la precisión del proteoma. Identificamos distintas alteraciones proteicas en diferentes tipos de enfermedad pancreática, proporcionando información sobre las diferencias entre las afecciones benignas y precancerosas. Estos hallazgos podrían ayudar en el diagnóstico temprano del cáncer de páncreas.
Nuestro objetivo es avanzar en el método de proteinasa del paciente para lograr un mapeo de proteínas de alta resolución dentro de las regiones de los tejidos. Utilizando la proteómica basada en espectrometría de masas, buscamos identificar firmas moleculares específicas de la región que contribuyan al descubrimiento de biomarcadores. Nuestro enfoque integra esas trampas para el paciente y la preparación previa con la espectrometría de masas de ocasión independiente de los datos para generar rápidamente datos de proteoma de alta calidad a partir de regiones seleccionadas de tejido FFPE.
Este método permite una gran cuantificación del proteoma espacial. Para comenzar, prepare un portaobjetos de tejido teñido con hematoxilina y eosina o con inmunohistoquímica con la región de interés indicada por un patólogo. Coloque el portaobjetos de tejido sin teñir y el portaobjetos de tejido teñido de espalda con espalda, asegurándose de una alineación adecuada.
Con un bisturí, extraiga las regiones de tejido que no sean de interés y raspe las regiones de tejido de interés hacia el centro del portaobjetos. Transfiera el tejido recolectado a un tubo limpio de unión a proteínas de 1,5 mililitros y agregue 180 microlitros de tampón de lisis SDS a cada tubo. Realice la sonicación de la sonda al 20% de amplitud durante 10 ciclos de cinco segundos de encendido y cinco segundos de apagado.
Ahora, incube las muestras a 100 grados centígrados durante 3,5 horas manteniendo una velocidad de 1.000 G. Después de la incubación, deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, centrifugar a 16.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para separar los restos de tejido del sobrenadante. Recoja el sobrenadante en un tubo limpio y etiquetado y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior.
Para la precipitación de acetona, coloque la muestra de proteína correspondiente a 100 a 300 microgramos en un tubo compatible con acetona. Luego, agregue acetona helada, previamente enfriada a menos 20 grados Celsius, en un volumen cinco veces mayor que el volumen de la muestra. Incuba la mezcla a menos 20 grados centígrados durante 18 horas.
Después de la incubación, centrifugar el tubo a 16.000 g durante 15 minutos. Deseche con cuidado el sobrenadante sin alterar la pelletza de proteína. Agregue 500 microlitros de acetona templada a menos 20 grados centígrados y centrifuga.
Después de decantar el sobrenadante, seque la muestra al aire. Prepare el tampón de lisis de atrapamiento de suspensión en agua desionizada. A continuación, añada 40 microlitros del tampón preparado al tubo de muestra y haga un vórtice completo para disolver la pastilla de proteína secada al aire.
Coloque la muestra en una incubadora agitadora a 100 grados centígrados a 1.000 g durante 35 minutos. A continuación, añada 10 microlitros del reactivo alquilante a la muestra e incube la muestra a temperatura ambiente a 300 g durante una hora. Dentro de una campana de gases químicos, agregue cinco microlitros de ácido tricloroacético al 10% a la muestra, lo que hace que el volumen total sea de 55 microlitros.
Verifique el pH de la muestra con papel de pH para asegurarse de que sea inferior a uno. A continuación, añada 350 microlitros de tampón de unión a la muestra para atrapar las proteínas. Coloque la columna de captura de suspensión en un tubo de dos mililitros y transfiera toda la muestra, incluido cualquier material insoluble, a la columna.
Centrifugar la columna a 4.000 g durante 50 segundos para atrapar las proteínas. A continuación, añade 400 microlitros de tampón de lavado dos. Después de centrifugar, deseche el flujo.
Después del lavado final, centrifugar la columna a 4.000 g durante 1,25 minutos para asegurar el paso completo del tampón uno. Agregue 125 microlitros de tampón de digestión a la columna de captura de suspensión y cúbrala para evitar la evaporación. Incubar la muestra a 37 grados centígrados durante 18 horas sin agitar.
A continuación, añada 80 microlitros de tampón de elución a la columna de captura de suspensión y centrifugar a 4.000 g durante 1,25 minutos. Extraiga los péptidos eluidos y transfiéralos a un tubo nuevo y limpio. Después de la cuantificación de péptidos, liofilizar 20 microgramos de péptidos.
Volver a disolver los péptidos liofilizados en 40 microlitros de tampón acuoso que contenga un 3% de acetonitrilo en agua con ácido fórmico al 0,1% y sonicar durante 10 minutos en un baño de sonicación. Centrifugar la muestra a 16.000 g durante 60 minutos y transferir el sobrenadante a viales para el análisis por espectrometría de masas. Inyecte dos microlitros de cada muestra utilizando el muestreador automático del sistema de espectrometría de masas de cromatografía nanolíquida.
Péptidos separados en una columna de fase reversa empaquetada con material C18 de tres micrómetros utilizando un gradiente de 127 minutos de acetonitrilo de cinco a 35% a 100 nanolitros por minuto. Ionice los péptidos a través de una fuente de iones nanospray y transfiéralos a un espectrómetro de masas basado en Orbitrap. Analice los péptidos mediante un método de adquisición independiente de datos de rango estrecho.
El aislamiento preciso de la región de interés durante el procesamiento de tejidos FFPE se logró en diferentes tejidos pancreáticos quísticos fijados en formalina e incluidos en parafina. Se obtuvieron cromatogramas iónicos totales reproducibles entre trireplicas biológicas para cada tipo de neoplasia quística pancreática. El análisis de espectrometría de masas por cromatografía líquida identificó 9.703 proteínas.
La abundancia de todas las proteínas identificadas abarcó 6,25 órdenes de magnitud, lo que demuestra una cobertura completa del proteoma, y se cuantificaron los marcadores de proteínas de cáncer de páncreas conocidos. Se identificaron un total de 933 proteínas expresadas diferencialmente, con 457 reguladas al alza y 476 a la baja en las neoplasias mucinosas papilares intraductales. El análisis bioinformático reveló que las proteínas expresadas diferencialmente se asociaron con varias vías relacionadas con el cáncer de páncreas.
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Resumen
Este estudio presenta un método proteómico basado en espectrometría de masas para analizar regiones específicas de interés en cortes de tejido fijado con formalina e incluido en parafina. El protocolo tiene como objetivo mejorar la precisión y fiabilidad del análisis proteómico en muestras de tejido archivadas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Proteómica
- Espectrometría de masas
- Patología
Antecedentes
- Los tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE) se utilizan comúnmente en la investigación.
- Estudiar el proteoma en regiones específicas del tejido puede proporcionar información sobre los mecanismos de las enfermedades.
- Los desafíos incluyen una digestión incompleta de las proteínas que afecta la cobertura proteica.
- Se necesitan protocolos optimizados para un análisis preciso.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método optimizado para el análisis proteómico en regiones específicas del tejido.
- Mejorar las técnicas de preparación de muestras y espectrometría de masas.
- Identificar alteraciones proteicas en enfermedades pancreáticas.
Métodos Utilizados
- Espectrometría de masas para análisis proteómico.
- Aislamiento de regiones específicas de tejido a partir de muestras FFPE.
- Protocolos de digestión optimizados para análisis de proteínas.
- Análisis comparativo de alteraciones proteicas en condiciones pancreáticas.
Resultados principales
- Se identificaron alteraciones proteicas distintas en los diferentes tipos de enfermedad pancreática.
- Se obtuvieron conocimientos sobre las diferencias entre condiciones benignas y precancerosas.
- El método mejora la profundidad y precisión del análisis proteómico.
- Los hallazgos podrían ayudar en el diagnóstico temprano del cáncer de páncreas.
Conclusiones
- El método desarrollado mejora el estudio de los proteomas en tejidos FFPE.
- Los protocolos optimizados pueden superar los desafíos en la digestión de proteínas.
- Esta investigación contribuye a comprender las enfermedades pancreáticas y posibles aplicaciones diagnósticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La proteómica con resolución espacial mediante regiones de tejido en FFPE aborda una necesidad crítica de perfiles moleculares de alta resolución en investigaciones oncológicas en fase de descubrimiento. Este flujo de trabajo optimizado permite una cuantificación robusta y análisis comparativo de la expresión proteica en microentornos tisulares relevantes para la enfermedad, respaldando la confianza predictiva en la validación temprana de biomarcadores y dianas. La integración de la selección de regiones guiada por patólogos con una preparación optimizada de muestras y análisis de MS de alto rendimiento mejora la toma de decisiones en el portafolio en la intersección entre investigación básica y traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación de alteraciones proteómicas específicas de región en contextos de tejido enfermo y benigno.
- Apoya la validación funcional de objetivos mediante la cuantificación in situ de marcadores proteicos conocidos y novedosos.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante el análisis a nivel de vías de proteínas expresadas diferencialmente.
- Mejora la confianza predictiva en el descubrimiento de biomarcadores y la triage temprana de objetivos candidatos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara muestras de tejido validadas y definidas espacialmente para flujos de trabajo proteómicos cuantitativos posteriores.
- Normaliza la preparación de muestras y el análisis por MS para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad entre estudios.
- Genera datos cuantitativos de proteoma de alta calidad adecuados para el cribado comparativo de estados patológicos.
- Permite la evaluación confiable de los cambios en la expresión proteica para el desarrollo y optimización de ensayos.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Relaciona hallazgos moleculares de tejidos FFPE con vías relevantes para la enfermedad implicadas en la progresión del cáncer.
- Proporciona continuidad desde el perfilado proteómico en fase de descubrimiento hasta la validación en modelos preclínicos.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de firmas moleculares con fenotipos clínicos.
- Mejora la correlación de biomarcadores traslacionales mediante la cuantificación integral de proteínas en tejidos archivados.
Integración de la Secuencia de Trabajo y Flujo de Trabajo
Este protocolo integrado conecta el descubrimiento temprano, la validación de dianas y la investigación traslacional al permitir un análisis proteómico con resolución espacial de tejidos FFPE.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de rutas mediante la cuantificación de la expresión proteica específica por región.
- Examen: Proporciona resultados cuantitativos reproducibles para la comparación robusta de regiones de tejido con enfermedad y controles.
- Análisis: Ofrece mediciones exhaustivas de abundancia proteica y análisis de expresión diferencial entre condiciones.
- Investigación Traslacional: Conecta las firmas proteómicas con los mecanismos de enfermedad y posibles biomarcadores clínicos.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo estandarizado y escalable para su uso repetido en diversos tipos de tejidos y modelos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas y biomarcadores.
- Valor operativo: Optimiza la preparación de muestras, mejora la reproducibilidad y facilita la escalabilidad de alto rendimiento.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir un perfilado molecular robusto desde las primeras etapas del proceso.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de programas de descubrimiento y traslación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en macrodisección de tejidos, preparación de muestras para proteómica y operación de espectrometría de masas.
- Exige acceso a instrumentación de MS de alta resolución e infraestructura bioinformática robusta.
- Necesita estandarización entre equipos para la selección de regiones y los protocolos de análisis de datos.
- Adaptable a diversos tipos de tejidos FFPE y modelos de enfermedad con optimización adecuada.
- Las limitaciones potenciales incluyen la variabilidad en la recuperación de proteínas y la necesidad de colaboración con patólogos para la identificación de las regiones de interés (ROI).
