Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

El objetivo general de esta estrategia experimental consiste en resolver los distintos ensamblajes funcionales en los que una proteína podría estar involucrada, mediante la fraccionación por electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul de complejos proteicos purificados por afinidad y el perfilado de correlación por espectrometría de masas. Este método puede ayudar a añadir información organizacional a las listas de proteínas generadas mediante experimentos de espectrometría de masas masiva con purificación por afinidad. Las principales ventajas de este procedimiento son que es sencillo de realizar, tiene buena resolución y requiere poco trabajo adicional en comparación con la espectrometría CMSMS convencional en gel.

Este protocolo está optimizado para la purificación de complejos proteicos a partir de 200 a 500 millones de células que expresan niveles endógenos de una proteína marcada con FLAG. Después de descongelar el pellet celular, como se describe en el protocolo escrito, añada cinco mililitros de tampón de lisis frío con DTT e inhibidores de proteasas a la suspensión celular y agite suavemente para mezclar. Incube la suspensión en hielo durante 10 minutos.

Transfiera la suspensión celular a un homogenizador frío. Lisee las células con entre 20 y 30 movimientos, utilizando el pistilo ajustado hasta que no haya viscosidad notable, luego transfiera el homogenizado a tubos de microcentrífuga fríos. Después de centrifugar los tubos, transfiera el lisado clarificado a un tubo frío limpio, dejando aproximadamente 50 microlitros de lisado en el tubo original.

Guarde una alícuota de 35 microlitros del lisado para medir la concentración de proteína y monitorear la purificación. A continuación, elimine el tampón de las perlas previamente preparadas. Re_suspenda las perlas con un mililitro del lisado y luego mézclelas con el resto del lisado.

Incube la mezcla en una rueda rotatoria a cuatro grados Celsius durante una a dos horas. Recoja las perlas en el costado del tubo con un imán. Tome una alícuota de 30 microlitros de sobrenadante y deseche el resto.

Re-suspender las perlas en 0,5 mililitros de tampón IPP150 pipeteando de cuatro a seis veces. Luego, transferir la suspensión a un tubo frío de 1,5 mililitros. A continuación, lavar las perlas tres veces con 0,5 mililitros de tampón nativo de elución FLAG.

Con el último lavado, transfiera las perlas a un tubo frío nuevo. Elimine completamente el tampón. Re-suspenda las perlas en 100 microlitros de péptido 3X5 a 200 microgramos por mililitro en tampón de elución nativo.

A continuación, incubar a cuatro grados Celsius durante 10 minutos con rotación suave. Recoger las perlas con el imán y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo frío. Repetir este paso dos veces antes de recuperar todos los eluidos.

Concentre el eluato hasta 25 microlitros en una unidad de filtro centrífugo mediante centrifugación a 10.000 × g a cuatro grados Celsius. Prepare la muestra añadiendo tampón de carga nativo 4X y aditivo de muestra G-250 al 0,5 % al eluato concentrado de 25 microlitros. Cargue la muestra y los marcadores nativos de peso molecular, dejando un pozo vacío entre ellos.

Luego, cargue de 10 a 20 microlitros de tampón de carga nativo 1X en todos los pocillos vacíos. Llene cuidadosamente la cámara catódica con 200 mililitros de tampón catódico azul oscuro 1X para PAGE nativo, sin perturbar las muestras. Llene la cámara anódica con 550 mililitros de tampón anódico 1X para PAGE nativo.

Corra el gel a 150 voltios durante 30 minutos. Después de detener la corrida, retire el tampón catódico de color azul oscuro con una pipeta serológica y reemplácelo con tampón catódico 1X de color azul claro. Después de continuar la corrida durante 60 minutos, abra la caja del gel y deseche una de las placas de la caja.

El gel permanece unido a la otra placa de la cassette. Coloque el gel en una bandeja que contenga suficiente solución fijadora para cubrirlo e incube durante 30 minutos con agitación suave. Luego, elimine la solución fijadora y sustitúyala por agua antes de escanear el gel.

Para prepararse para la espectrometría de masas, coloque primero una placa de 96 pocillos con fondo cónico encima de otra placa de 96 pocillos para recolectar los desechos. Perfore el fondo de los pocillos de la placa de 96 pocillos con fondo cónico con una aguja de calibre 21. Luego, agregue 200 microlitros de acetonitrilo al 50%, ácido fórmico al 0,25% a los pocillos de la placa perforada.

Incube la pila de placas en un agitador durante 10 minutos. A continuación, centrifugue la placa a 500 veces G durante un minuto, de modo que el líquido fluya a través de los orificios hacia la placa de recolección de desechos. Después de repetir los pasos de lavado dos veces, llene los pocillos de la placa de 96 pocillos perforada con 150 microlitros de bicarbonato de amonio 50 milimolar.

A continuación, coloque el gel sobre una superficie limpia. Corte la banda que contiene la muestra en 48 rebanadas idénticas. Corte cada rebanada en dos o tres piezas más pequeñas, excepto las últimas cinco rebanadas en la parte superior del gel.

Coloque cada rebanada secuencialmente en un pozo de la placa de 96 pozos lavada con el extremo perforado. Añada 50 microlitros de acetonitrilo a cada pozo e incube la placa con agitación durante 30 a 60 minutos. Después de eliminar el líquido mediante centrifugación, añada 200 microlitros de TSEB de dos milimoles y bicarbonato de amonio de 50 milimoles a cada pozo.

Incube la placa con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de eliminar el líquido mediante centrifugación como antes. Deshidrate los trozos de gel añadiendo 200 microlitros de acetonitrilo puro e incube con agitación a temperatura ambiente durante 20 minutos hasta que los trozos de gel estén blancos y opacos. Tras eliminar el acetonitrilo, añada 150 microlitros de tripsina en bicarbonato de amonio frío a cada pocillo.

Incube la placa con agitación a 37 grados Celsius durante dos horas. A continuación, coloque una placa limpia de fondo cónico debajo de la placa que contiene el gel, asegurando la orientación correcta de las placas. Luego, recoja el líquido que contiene los péptidos mediante centrifugación a 200 veces G durante un minuto.

Coloque la placa que contiene los péptidos en un evaporador centrífugo y evapore el líquido mientras realiza el siguiente paso. Añada 150 microlitros de acetonitrilo al 50%, ácido fórmico al 0,25% a los trozos de gel. Incube con agitación a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

Recoger el líquido en la placa parcialmente seca mediante centrifugación a 200 veces G durante un minuto. Continuar evaporando la placa que contiene péptidos mientras se realiza el siguiente paso. Transferir las soluciones de péptidos a la placa de filtración centrífuga lavada.

Coloque una placa limpia de fondo cónico debajo para recoger los péptidos y centrifugue el conjunto de placas como antes. Evapore el líquido en la placa de fondo cónico hasta que los pocillos estén completamente secos. Una vez secos, la placa puede cubrirse con una tapa de silicona y almacenarse a menos 20 grados Celsius hasta realizar la espectrometría de masas y el análisis de datos, tal como se describe en el protocolo escrito.

Se muestran aquí resultados representativos del agrupamiento jerárquico de los perfiles de migración por electroforesis nativa azul de Mta2 y las proteínas que copurifican, en forma de un dendrograma y un mapa de calor que representa las intensidades proteicas. El perfil de migración de Mta2 muestra dos picos indicativos de dos complejos distintos. Algunas subunidades del complejo NuRD presentan un patrón similar, con la mayor abundancia en el ensamblaje de menor peso molecular.

Por el contrario, otras subunidades de NuRD son más abundantes en el complejo NuRD de mayor peso molecular. Por otro lado, el interactor de Mta2, Cdk2ap1, solo está presente en el complejo NuRD de mayor peso molecular. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos días y medio.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener todas las muestras y reactivos en hielo para evitar la disociación de los complejos proteicos. Este procedimiento puede aplicarse a cualquier proteína de interés, siempre que pueda detectarse en el medio de afinidad mediante elución competitiva en condiciones nativas. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la co-inmunoprecipitación inversa o secuencial para validar los subcomplejos identificados.