Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

El objetivo general de esta estrategia experimental es resolver los distintos ensamblajes funcionales en los que puede estar involucrada una proteína, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul, fraccionamiento de complejos de proteínas purificadas por afinidad y perfiles de correlación por espectrometría de masas. Este método puede ayudar a agregar información organizacional a las listas de proteínas generadas por experimentos de espectrometría masiva de purificación por afinidad. Las principales ventajas de este procedimiento son que es sencillo de realizar, tiene buena resolución y requiere poco más trabajo que el GMSC de gel convencional.

Este protocolo está optimizado para la purificación de complejos proteicos de 200 a 500 millones de células que expresan niveles endógenos de una proteína marcada con FLAG. Después de descongelar el pellet celular, como se describe en el protocolo de texto, agregue cinco mililitros de tampón de lisis helada que contenga inhibidores de DTT y proteasa a la suspensión celular y gire para mezclar. Incuba la suspensión en hielo durante 10 minutos.

Transfiera la suspensión de la celda a un homogeneizador de plumón frío. Lise las células con 20 a 30 golpes, usando el mortero apretado hasta que no haya viscosidad notable, luego transfiera el homogeneizado a tubos de microcentrífuga fríos. Después de centrifugar los tubos, transfiera el lisado aclarado a un tubo frío limpio, dejando aproximadamente 50 microlitros de lisado.

Guarde una alícuota de 35 microlitros de lisado para medir la concentración de proteínas y controlar la purificación. A continuación, retire el tampón de las cuentas previamente preparadas. Vuelva a suspender las perlas con un mililitro del lisado y luego mezcle con el resto del lisado.

Incubar la mezcla en una rueda giratoria a cuatro grados centígrados durante una o dos horas. Recoge las cuentas en el costado del tubo con un imán. Recoge una alícuota de 30 microlitros de sobrenadante y desecha el resto.

Vuelva a suspender las perlas en 0,5 mililitros de tampón IPP150 pipeteando de cuatro a seis veces. A continuación, transfiera la suspensión a un tubo frío de 1,5 mililitros. A continuación, lavar las perlas tres veces con 0,5 mililitros de tampón nativo de elución FLAG.

Con el último lavado, transfiera las perlas a un nuevo tubo frío. Retire el tampón completamente. Resuspender las perlas en 100 microlitros de 200 microgramos por mililitro de péptido 3X5 en tampón de elución nativo.

Luego, incube a cuatro grados centígrados durante 10 minutos con una rotación suave. Recoja las cuentas con el imán y transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y frío. Repita este paso dos veces antes de tirar de todos los eluidos.

Concentre el eluido hasta 25 microlitros en una unidad de filtro centrífugo por centrifugación a 10.000 veces G a cuatro grados Celsius. Prepare la muestra agregando 4X tampón de carga de muestra nativo y 0.5% G-250 aditivo de muestra al eluido concentrado de 25 microlitros. Cargue la muestra y los marcadores de peso molecular nativos, dejando un pozo vacío entre ellos.

Luego, cargue de 10 a 20 microlitros de tampón de carga de muestra nativo 1X en todos los pocillos vacíos. Llene la cámara del cátodo con 200 mililitros de tampón de cátodo azul oscuro nativo PAGE 1X con cuidado, para no alterar las muestras. Llene la cámara del ánodo con 550 mililitros de tampón de ánodo nativo PAGE 1X.

Haga funcionar el gel a 150 voltios durante 30 minutos. Después de detener la carrera, retire el tampón de cátodo azul oscuro con una pipeta serológica y reemplácelo con 1X tampón de cátodo azul claro. Después de continuar la carrera durante 60 minutos, abra el casete de gel y deseche una de las placas de casete.

El gel permanece unido a la otra placa de casete. Coloque el gel en una bandeja que contenga suficiente solución fijadora para cubrirlo e incube durante 30 minutos agitando suavemente. Luego, retire la solución fijadora y reemplácela con agua antes de escanear el gel.

Para prepararse para la espectrometría de masas, primero coloque una placa de 96 pocillos de fondo cónico encima de otra placa de 96 pocillos para recolectar los desechos. Perfore el fondo de los pocillos de la placa de pocillos de 96 pocillos de fondo cónico con una aguja de calibre 21. A continuación, añada 200 microlitros de 50% de acetonitrilo, 0,25% de ácido fórmico a los pocillos de la placa perforada.

Incube la pila de platos en un agitador durante 10 minutos. A continuación, centrifuga la placa a 500 veces G durante un minuto, de modo que el líquido fluya a través de los orificios hacia la placa de recogida de residuos. Después de repetir los pasos de lavado dos veces, llene los pocillos de la placa perforada de 96 pocillos con 150 microlitros de bicarbonato de amonio de 50 milimolares.

A continuación, coloque el gel sobre una superficie limpia. Corta el carril que contiene la muestra en 48 rodajas idénticas. Corta cada rebanada en dos o tres trozos más pequeños, excepto las últimas cinco rodajas en la parte superior del gel.

Coloque cada rebanada secuencialmente en un pocillo de la placa de 96 pocillos lavada con el extremo perforado. Agregue 50 microlitros de acetonitrilo a cada pocillo e incube la placa agitando durante 30 a 60 minutos. Después de eliminar el líquido por centrifugación, agregue 200 microlitros de dos milímetros de TSEB y 50 milimolares de bicarbonato de amonio a cada pocillo.

Incubar la placa agitándola durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de eliminar el líquido por centrifugación como antes. Deshidratar las piezas de gel añadiendo 200 microlitros de acetonitrilo puro e incubar agitando a temperatura ambiente durante 20 minutos hasta que las piezas de gel estén blancas y opacas. Después de eliminar el acetonitrilo, agregue 150 microlitros de tripsina en bicarbonato de amonio frío a cada pocillo.

Incubar la placa agitándola a 37 grados centígrados durante dos horas. A continuación, coloque una placa inferior cónica limpia debajo de la placa que contiene gel, asegurando la orientación correcta de las placas. A continuación, recoja el líquido que contiene los péptidos por centrifugación a 200 veces G durante un minuto.

Coloque la placa contenedora de péptidos en un evaporador centrífugo y evapore el líquido mientras realiza el siguiente paso. Agregue 150 microlitros de 50% de acetonitrilo, 0,25% de ácido fórmico a las piezas de gel. Incubar agitando a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Recoja el líquido en la placa parcialmente seca por centrifugación a 200 veces G durante un minuto. Continúe evaporando la placa contenedora de péptidos mientras realiza el siguiente paso. Transfiera las soluciones peptídicas a la placa de filtración centrífuga lavada.

Coloque una placa inferior cónica limpia debajo de ella para recoger los péptidos y centrifugar la pila de placas como antes. Evapore el líquido en la placa inferior cónica hasta que los pocillos estén completamente secos. Una vez seca, la placa puede cubrirse con una tapa de silicona y almacenarse a menos 20 grados centígrados hasta realizar la espectrometría de masas y el análisis de datos como se describe en el protocolo de texto.

Los resultados representativos de la agrupación jerárquica de los perfiles de migración de PAGE nativos azules de Mta2 y proteínas copurificantes se muestran aquí como un dendrograma y un mapa de calor que representa las intensidades de las proteínas. El perfil de migración de Mta2 muestra dos picos indicativos de dos complejos distintos. Algunas subunidades de NuRD muestran un patrón similar con mayor abundancia en el ensamblaje de menor peso molecular.

Por el contrario, otras subunidades de NuRD son más abundantes en el ensamblaje de NuRD de mayor peso molecular. Por otro lado, el interactivo Mta2, Cdk2ap1, solo está presente en el ensamblaje NuRD de mayor peso molecular. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días y medio.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todas las muestras y reactivos en hielo para evitar la disociación de los complejos proteicos. Este procedimiento se puede aplicar a cualquier proteína de interés, siempre que se pueda observar desde el medio de afinidad mediante elución competitiva en condiciones nativas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la coinmunoprecipitación inversa o secuencial para validar los subcomplejos identificados.