Name: Con alto contenido de imagen para cuantificar la participación de blanco en las células adherentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprende a medir la unión de fármacos a proteínas diana mediante CETSA con imagen de alto contenido en células adherentes. Este protocolo permite localización espacial sin desprender células.

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Los autores reconocen el apoyo de infraestructura de ciencia para laboratorio de la vida y el Karolinska Institutet. Los autores también reconocen entrada y discusiones con Michaela Vallin, Magdalena Otrocka y Thomas Lundbäck.

1. siembra de células
Nota: Para una visión general del flujo de trabajo vea la figura 1. Una lista detallada de materiales y reactivos están disponibles en la Tabla de materiales.
<ol><li>Antes de la siembra de las células, perforar con un taladro estándar en el marco de placas de ensayo imágenes de 384-pozo negro para evitar burbujas de aire que está atrapadas debajo de la placa más adelante durante la etapa de calefacción. Para evitar partículas de plástico en los pozos durante este paso y mantener las condiciones de esterilidad, sellar las placas con un papel de aluminio adhesivo o cubra la placa antes de la perforación en una campana de cultivo de tejidos. Por lo general, 3 agujeros con un diámetro de 3,5 mm en cada lado de la placa (borde corto) es suficiente.</li>
	<li>Preparar un banco de flujo laminar limpiándolo con etanol al 70%. Siguiendo técnicas de cultivo de tejido aséptica estándar, retire media celular frasco o plato. Lavar las células con 5-10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego añadir tripsina 2 mL en el matraz. Incube el frasco a 37 ° C hasta que se desprenda de las células A-431. Contar las células usando un hemocitómetro o celda contador. Preparar una suspensión de 50.000 células/mL en medio de cultivo.</li>
	<li>Añada 40 μl de suspensión celular (dando una densidad celular final de 2.000 células por pocillo) en cada pocillo de una placa de ensayo usando un dispensador de reactivo a granel o una pipeta multicanal, dependiendo de la escala del experimento. Pasar brevemente la placa de lado a lado para dispersar las células uniformemente en la parte inferior de la placa.</li>
	<li>Para minimizar los efectos de borde de la placa, permiten que las células se colocan en la parte inferior de la placa de ensayo durante 20 minutos a temperatura ambiente en la parte posterior de la campana de flujo laminar. Luego, colocar la placa en un recipiente de plástico con toallas de papel húmedo para asegurar una atmósfera húmeda. Antes del uso, limpie el recipiente de plástico con etanol al 70%.</li>
	<li>Incubar la caja con la placa de ensayo durante 2-3 días a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada convencional. Supervisar la confluencia de las células hasta 50-75%, según lo determinado por la inspección visual con un microscopio de luz.</li>
</ol>2. tratamiento del compuesto
<ol><li>En el día del experimento, aspirar el medio de cada pocillo con una arandela de placa. Coloque la placa en la lavadora de placa y seleccionar el programa de aspiración. Si no hay una arandela de placa, el líquido puede eliminarse invirtiendo la placa con un giro rápido de la mano sobre una bandeja de residuos o un lavabo. Retiro completo del líquido es esencial para el buen funcionamiento. Cualquier exceso de líquido se retira entonces taponando con toallas de papel.</li>
	<li>Añadir 30 μl de compuestos diluido a la concentración apropiada en medio de cultivo celular mediante dosificación automática o una pipeta multicanal según la escala del experimento. Asegúrese de añadir un control positivo (ligando conocido) y negativo (DMSO) a varios pozos en cada placa de ensayo. Ya que este es un ensayo de cambio térmico, es necesario que la concentración de compuesto supera la constante de disociación para observar la estabilización de la proteína. Por lo tanto, una pauta aproximada para la concentración del compuesto es 50 - 100 veces el IC50pero más descripciones de detalle de las concentraciones de compuestos se encuentran en la sección de discusión. Nota: Tolerancia de DMSO de las líneas celulares debe analizarse antes del experimento.</li>
	<li>Sello sello de la placa de ensayo compuesto tratado con una placa transpirable e incubar a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada durante 30 minutos.</li>
</ol>3. calor desafío
<ol><li>En primer lugar, establecer el baño de agua a la temperatura deseada. Tenga en cuenta que la temperatura final que se alcanza dentro de los pocillos de la placa de ensayo puede ser diferente de la temperatura final en el baño de agua. Investigar previamente el desplazamiento con un termómetro simulado de la placa y termopar. Por lo general toma 30 minutos para el baño María se estabilice a la temperatura deseada.</li>
	<li>Para verificar que la temperatura deseada se alcanza en los pocillos de la placa de ensayo durante la etapa de calentamiento, prepare una placa simulada no sellada que contienen el mismo volumen de medio que la placa de ensayo.</li>
	<li>Retire las placas de ensayo de la incubadora. Quite el sello transpirable y volver a sellar la placa de ensayo que contiene las células tratadas con compuestos con una papel de aluminio adhesivo firmemente para asegurar que no hay agua se escapará en los pozos durante el posterior calentamiento en el baño de agua. Asegúrese de que los orificios perforados en el marco de la placa son accesibles.</li>
	<li>Coloque la placa de ensayo y la placa del maniquí en el baño de agua con la parte inferior de la placa en ángulo hacia la superficie del agua a la fuerza todo el aire restante hacia fuera debajo de las placas.</li>
	<li>Monitorear la temperatura dentro de los pocillos de una placa simulada nueva usando un termómetro termopar.</li>
	<li>Calentar la placa de ensayo en el baño de agua durante 3 minutos. Transferir inmediatamente el ensayo y la placa falsa a otro baño de agua con agua templado de habitación se enfríe durante 5 minutos. La placa de ensayo está lista para su posterior procesamiento.</li>
</ol>4. fijación
<ol><li>Dispense el paraformaldehído al 10 μl 16% (w/v) (PFA) directamente a la placa de ensayo con un dispensador de reactivo a granel o una pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Nota: Algunos fijadores se clasifican como carcinogénicos y deben seguirse las normas de seguridad institucional.</li>
	<li>Aspire la solución de la PFA y lavar las células con 300 de μl PBS, usando una arandela de placa. Coloque la placa en la lavadora de placa y seleccionar el programa de aspiración. Nota: Este procedimiento se ha optimizado con un protocolo de desbordamiento en la arandela de placa que líquido al mismo tiempo dispensado y quitado. Si no hay una arandela de placa o procedimiento similar, el paso de lavado puede también hacer manualmente.</li>
	<li>
Procedimiento de lavado manual: Retire el líquido de los pozos invirtiendo la placa con un giro rápido de la mano sobre una bandeja de residuos o un lavabo. Retiro completo del líquido es esencial para el buen funcionamiento. Añadir 80 μl de PBS con una pipeta multicanal e invertir la placa otra vez como se describe anteriormente, repetir el lavado dos veces. Después del último lavado, secar la placa sobre toallas de papel limpias para quitar cualquier exceso de líquido.</li>
</ol>5. la permeabilización
<ol><li>Añadir 20 μl de 0,1% (v/v) NP-40 para los pozos con una pipeta multicanal e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lavar las células con el mismo procedimiento como se describe anteriormente (paso 4.2).</li>
	<li>Alternativamente, cuando sea apropiado, aplicar un protocolo de recuperación de antígeno, por ejemplo:<ol>
<li>Añadir 20 μl de SDS 1% a los pozos con una pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y lavar siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente (paso 4.2).</li>
		<li>Añadir 80 μL de glicina de 10 mM a pH 7,2 e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución de glicina con una arandela de placa colocando en la arandela de placa y seleccionar el protocolo de aspiración. Ver notas en 2.1 y 4.2 Si no hay una arandela de placa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. bloqueo
<ol><li>Añadir 15 μl de 1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS en los pocillos con un dispensador de reactivo a granel o una pipeta multicanal. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 hora o durante la noche a 4 ° C con un sello de placa de papel de aluminio.</li>
</ol>7. primaria del anticuerpo
<ol><li>Aspirar la solución bloqueo usando una arandela de placa colocando en la arandela de placa y seleccionar el protocolo de aspiración. Ver notas en 2.1 y 4.2 Si no hay una arandela de placa.</li>
	<li>Añadir 10 μl de anticuerpo primario diluido por consiguiente en el 1% (w/v) BSA en PBS para los pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 hora o durante la noche a 4 ° C con un sello de placa de papel de aluminio.</li>
</ol>8 anticuerpo secundario
<ol><li>Aspire la solución de anticuerpo primario y lavar los pocillos según el mismo procedimiento como se describe anteriormente (paso 4.2).</li>
	<li>Añadir 10 μl del anticuerpo secundario Alexa 488 diluido por consiguiente en el 1% (p/v) BSA en PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Selle la placa con un sello adhesivo de aluminio para proteger de la luz. Nota: Proteja la placa de la luz durante este y los pasos posteriores.</li>
</ol>9. nuclear la coloración y la mascarilla de células
<ol><li>Añadir 10 μl de colorante nuclear diluido a 0,05 mg/mL en PBS en los pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos más.</li>
	<li>Aspire la solución de Hoechst y anticuerpo secundario y lavar los pocillos con el mismo procedimiento como se describe anteriormente (paso 4.2).</li>
	<li>Añadir 10 μl de la mascarilla de células diluida a 200 ng/mL en PBS en los pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
	<li>Aspire la solución de la máscara de la célula y lavar los pocillos con el mismo procedimiento como se describe anteriormente (paso 4.2).</li>
	<li>Añada 60 μL de PBS a todos los pozos con la arandela de placa, un dispensador de reactivo a granel o una pipeta multicanal y sellar las placas con un papel de aluminio adhesivo.</li>
</ol>10. adquisición y análisis de imágenes
<ol><li>Captura de imágenes en un sensor contenido alto con 3 canales fluorescentes: DAPI (387/447), GFP (472/520) y TexasRed (562/624). Adquisición de 4 imágenes por pozo con objetivo de 10 X. Utilizar autoenfoque láser automatizado y aplicar 2 binning durante la adquisición. Guardar imágenes como archivos de tiff de escala de grises de 16 bits, junto con metadatos.</li>
	<li>Analizar imágenes utilizando el software disponible. Identificar los límites de la celda utilizando un algoritmo de puntuación de célula con DAPI (núcleo) y TexasRed (citoplasma).</li>
	<li>Extracto de media intensidad para todas longitudes de onda adquiridas para su posterior análisis de datos.</li>
	<li>Calcular el factor Z para asegurar la robustez del ensayo.</li>
	<li>Calcular % estabilización con la siguiente fórmula: 100 * (1-(bien intensidad-control negativo de intensidad bien media) / (promedio del control negativo de la intensidad promedio de control positivo de intensidad)). Esta control negativo de DMSO y el control positivo es la sustancia de referencia. Puesto que la máxima estabilización entre compuestos puede variar y de hecho ser mayor que el control positivo para las curvas ITDRF, las intensidades máxima y mínima estabilización para cada compuesto se utilizan a veces en lugar de los valores de intensidad de los pozos de control .</li>
</ol>

<ol><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R%26D+productivity+at+AstraZeneca%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li>
<li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165(2015).</li>
<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li>
<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+flow+of+medicines+be+improved%3F+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li>
<li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+validation+using+chemical+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li>
<li>Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li>
<li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091(2015).</li>
<li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li>
<li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+Thermal+Shift+Assay%3A+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li>
<li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li>
<li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040(2016).</li>
<li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li>
<li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+%28CETSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li>
<li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAxelsson%2C+H+%22Assay+Guidance+Manual+%5BInternet%5D%22">Assay Guidance Manual [Internet]</a>. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).</li>
<li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen ninguna revelación al informe.

Como comentamos en la sección de resultados, hay varias medidas claves para el procedimiento. En primer lugar, es importante identificar un reactivo de alta calidad afinidad. Recomendamos una pequeña biblioteca de anticuerpos para cada objetivo deseado de detección. Después de que un anticuerpo primario se ha seleccionado, también es importante validar el sistema para un número de sitios de Unión diferentes de la meta de proteína si es necesario. Counter-detección de compuestos que interfieren con la señal de ensayo como...

En el desarrollo de nuevos fármacos o sondas químicas es esencial par el efecto farmacológico observado o lectura funcional a las medidas de ocupación del destino o participación en células vivas1,2,3. Estos datos son necesarios para que la molécula pequeña de hecho llegue a su destino deseado y validar la hipótesis biológica detrás de proteína objetivo selección4,5. Además, durante el desarrollo de drogas, modelo de los sistemas de complejidad creciente se utiliza para seleccionar y corroborar un plomo compuesto antes de los ensayos clínicos. Para confirmar la traducción de la biología a través de estos sistemas preclínicos, métodos de rastreo contrato de drogas blanco y acompañando la biología a lo largo de este proceso de desarrollo son fundamentales.
Compromiso de Diana farmacológica ha sido tradicionalmente difícil de controlar en células vivas con unfunctionalized pequeñas moléculas y proteínas, especialmente a nivel unicelular con resolución espacial6,7. Sin modificar de un método reciente para observar la interacción entre fármacos y proteínas en células vivas es el ensayo celular cambio térmico (CETSA) en el cual estabilización inducida por ligando de una proteína nativa en respuesta a un desafío de calor es cuantificada8, 9,10. Esto se logra mediante la cuantificación de proteína soluble restante después de la exposición a un desafío de calor. En la divulgación inicial de CETSA, mancha blanca /negra occidental fue utilizada para la detección. Para activar campañas de detección y clasificación de colecciones compuestos más grandes del golpe, los esfuerzos para aumentar el rendimiento de CETSA experimentos han llevado al desarrollo de varios ensayos homogéneos, basado en una microplaca10,11. Sin embargo, una limitación con estos métodos es que ellos son actualmente más adecuados para tratamiento compuesto en suspensiones celulares y lisis celular, llevando a la pérdida de la información espacial requiere de la detección. CETSA puede ser aplicado experimentalmente como un cambio inducido por ligando de temperatura térmica agregación (Tagg) en una concentración única de la molécula pequeña o la concentración del ligand necesaria para estabilizar la proteína en una sola temperatura. Este último se denomina huellas dactilares isotermo dosis respuesta (ITDRF) para indicar la dependencia de estas mediciones en las condiciones experimentales específicas.
El objetivo de este protocolo es medir el compromiso de destino mediante CETSA en células adherentes detección inmunofluorescente del anticuerpo de (IF) con microscopía de alto contenido12. Este procedimiento extiende la plataforma original de CETSA para permitir la cuantificación unicelular del contrato de blanco con la conservación de la localización subcelular. En particular, a diferencia de muchos informes anteriores, en este procedimiento de tratamiento compuesto se realiza en células vivas adherentes sin desprendimiento superficial o lavado antes del reto de calor, preservando así el equilibrio establecido enlace que pretendemos medir13. Actualmente, el método está validado para un destino proteína p38α (MAPK14) en varias líneas celulares, y esperamos que al compartir este procedimiento la técnica se puede aplicar ampliamente a través del fusión proteoma. Esperamos que este protocolo puede ser adaptado a lo largo de la tubería del desarrollo drogas de proyección, golpe clasificación a través de seguimiento de objetivo participación en vivo.

<table><tbody><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604013</td><td>para separar células y subcultivar</td></tr><tr><td>16% de paraformaldehído (PFA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>fijador</td></tr><tr><td>IgG (H+L) de cabra anti-conejo (H+L), anticuerpo conjugado Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11008</td><td>anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>HCS CellMask tinción roja</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H32712</td><td>Tinción de citoplasma</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56741</td><td>para permeabilización</td></tr><tr><td>Tinción de Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>tinción nuclear</td></tr><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' medio s (DMEM) - glucosa alta Componente</td> de <td>medio de cultivo celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6429</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino inactivado por calor (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>componente de medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>componente de medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Corning, junta de placa transpirable</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3345</td><td>para la etapa de incubación de Copound</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-p38 de conejo [E229]</td><td>Abcam</td><td>ab170099</td><td>anticuerpo primario, LOT:GR305364-16</td></tr><tr><td>Falcon, Negro Placas de imagen de fondo transparente de 384 pocillos</td> Placas de imagen <td>VWR</td><td>736-2044</td><td></td></tr><tr><td>Greiner, placas de polipropileno de bajo volumen de 384 pocillos</td><td>VWR</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo Papel de aluminio</td><td>VWR</td><td>30127790</td><td></td></tr><tr><td>Sello de aluminio pelable</td><td>Agilent</td><td>24210-001</td><td>para PlateLoc</td></tr><tr><td>LY2228820</td><td>Selleckchem</td><td>S1494</td><td>p38&alpha; inhibidor</td></tr><tr><td>PH797804</td><td>Selleckchem</td><td>PH797804</td><td>p38&alpha; inhibidor</td></tr><tr><td>BIRB796</td><td>Selleckchem</td><td>S1574</td><td>p38&alpha; inhibidor</td></tr><tr><td>SB203580</td><td>Tocris</td><td>1202</td><td>p38&alpha; inhibidor</td></tr><tr><td>AMG 548</td><td>Tocris</td><td>3920</td><td>p38 y alfa; inhibidor</td></tr><tr><td>RWJ 67657</td><td>Tocris</td><td>2999</td><td>p38 y alfa; inhibidor</td></tr><tr><td>L-Skepinona</td><td>CBCS colección</td><td></td> de compuestos <td>p38 y alfa; inhibidor</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>agente bloqueante</td></tr><tr><td>SDS (dodecil sulfato de sodio)</td><td>BDH</td><td>44244</td><td>utilizado en la recuperación de antígenos</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td>utilizada en la recuperación de antígenos</td></tr><tr><td>Células A-431</td><td>ATCC</td><td>ATC-CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550</td><td>Labcyte</td><td>Para la</td><td></td> preparación de placas compuestas</tr><tr><td>Sellador de placas</td><td>Agilent</td><td></td><td>PlateLoc</td></tr><tr><td>Dosificador de reactivos a granel</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td>Multidrop Combi</td></tr><tr><td>Líquido automatizado manipulación</td><td>Plataforma de manipulación de líquidos Agilent Bravo; utilizada para la preparación de placas compuestas</td><td></td> Lavadora de placas Tecan Hydrospeed Baño de agua Julabo TW12 Termopar VWR Termómetro de laboratorio trazable Thermopair de alto contenido ImageXpress Micro XLS Wide-Field de alto contenido <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Sistema de análisis</td></tr></tbody></table>

con alto contenido de imagen para cuantificar la participación de blanco en las células adherentes

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Cuantificación de la interacción de moléculas pequeñas con su blanco prevista de la proteína es fundamental para desarrollo de fármacos, validación de destino y validación química de la sonda. Métodos que miden este fenómeno sin modificación del destino de la proteína o molécula pequeña son particularmente valiosos aunque técnicamente difícil. El ensayo celular cambio térmico (CETSA) es una técnica para supervisar el contrato de blanco en las células vivas. Aquí, describimos una adaptación del protocolo original de CETSA, que permite mediciones de alto rendimiento manteniendo la localización subcelular en el nivel unicelular. Creemos que este protocolo ofrece importantes avances para la aplicación de CETSA profunda caracterización del compuesto objetivo interacción, especialmente en poblaciones heterogéneas de células.

El protocolo descrito en la figura 1 describe el flujo de trabajo básico para ejecución de ensayos CETSA en células adherentes con detección de la proteína soluble restantes por proyección de imagen de contenido alto. Este flujo de trabajo puede ser fácilmente adaptada a todas las etapas de desarrollo de ensayos modificando el diseño de la placa de los reactivos o compuestos14. Detallamos los resultados esperados para varias previsto a...

Medidas del contrato de blanco de la droga son fundamentales para desarrollo de fármacos eficaces y validación química de la sonda. Aquí detallamos un protocolo para la medición de compromiso de Diana farmacológica con alta proyección de imagen contenido en una adaptación de microplacas compatibles del ensayo celular cambio térmico (CETSA).

Con alto contenido de imagen para cuantificar la participación de blanco en las células adherentes

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología química y descubrimiento de fármacos. Por ejemplo, ¿su compuesto se une a la proteína objetivo? Las principales ventajas de esta técnica son que no hay ningún requisito de desprendimiento de las células adherentes.Y la localización espacial se puede determinar mediante imágenes. Aunque hemos aplicado este método en líneas celulares, también es posible aplicar este método a otros sistemas celulares como cultivos primarios y coculturas. Antes de sembrar las células, coloque placas de ensayo de imágenes negras de 384 biens en una campana de cultivo de tejido y cubra las placas con papel de aluminio antes de usar un taladro estándar para hacer tres agujeros de 3,5 milímetros de diámetro en ambos extremos de cada placa.Cuando las placas estén listas, utilice una técnica aséptica para lavar un cultivo celular A-431 con 5 a 10 mililitros de PBS. E incubar las células con dos mililitros de tripsina a 37 grados celsius hasta que las células se desprendan. Después de contar, diluir las células a 5 veces 10 a las 4a células por mililitro en medio de cultivo, y sembrar 40 microlitros de células a cada pozo de cada placa de ensayo.Agitar suavemente cada placa de lado a lado después de la siembra para asegurar una distribución homogénea de las células a través de los fondos de los pozos. Para minimizar los efectos del borde de la placa, permita que las células se asienten en la parte inferior de las placas de ensayo durante 20 minutos a temperatura ambiente en la parte posterior de la campana de flujo laminar antes de colocar las placas en una cámara humidificada personalizada durante dos a tres días a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono. El día del experimento, utilice una arandela de placas para aspirar el medio de cada pozo.Y añadir 30 microlitros del compuesto de interés en la concentración experimental adecuada a los pozos experimentales apropiados. Selle las placas de ensayo tratadas con compuestos con sellos de placa transpirables. Y devuelva las placas a la incubadora de cultivo celular durante 30 minutos.Para exponer las células a un desafío de calor, primero coloque el baño de agua a la temperatura experimental adecuada, y coloque una placa ficticia sin sellar que contenga el mismo volumen de medio por bien como la placa de ensayo en el baño, junto con un termómetro termopar para monitorear la temperatura dentro de los pozos. Cuando se haya alcanzado la temperatura experimental adecuada, retire el sello transpirable de cada placa de ensayo y vuelva a sellar las placas con una lámina de aluminio adhesiva apretada para asegurarse de que no haya fugas de agua en los pozos durante su calentamiento posterior en el baño de agua. Mantener los agujeros perforados dentro del marco de la placa accesibles.Coloque las placas de ensayo y una nueva placa ficticia en el baño de agua, con la parte inferior de las placas en ángulo hacia la superficie del agua para forzar cualquier aire restante desde debajo de las placas, y comience a monitorear la temperatura de la nueva placa ficticia. Un calentamiento uniforme de la placa es fundamental para el rendimiento del ensayo. Tenga cuidado de colocar la placa en el baño de agua de tal manera que no haya burbujas de aire atrapadas debajo.Después de tres minutos, enfríe inmediatamente las placas en un segundo baño de agua de agua a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de su análisis. Para tomar imágenes de las células, primero agregue 10 microlitros de 16%paraformaldehído directamente a las placas de ensayo para una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente. Al final del período de fijación, lave las células con 300 microlitros de PBS en la arandela de placas, y agregue 20 microlitros de 0.1%NP40 para una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente.Al final de la incubación, lave las células como se ha demostrado. Y bloquear las células con 15 microlitros de 1%albúmina sérica bovina, o BSA, durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, utilice la arandela de placas para aspirar el suero de bloqueo, y agregue 10 microlitros del anticuerpo primario de interés a los pozos apropiados para una incubación de una hora a temperatura ambiente.Al final de la incubación, lave cada pocillo con 300 microlitros de PBS y etiquete las células con 10 microlitros del anticuerpo secundario apropiado durante una hora a temperatura ambiente protegidas de la luz. Para la tinción nuclear de las células, agregue 10 microlitros de un tinte nuclear apropiado a cada pozo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Y lavar las células en PBS como se demuestra.Etiquete las células con 10 microlitros de máscara celular por pozo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Seguido de un último lavado con PBS. A continuación, dispensar 60 microlitros de PBS fresco a cada pozo, y sellar las placas con papel de aluminio hasta que seinen.Para crear imágenes de las celdas, capture cuatro imágenes por pozo en un imager de alto contenido utilizando los canales fluorescentes apropiados bajo el objetivo de 10 veces utilizando el enfoque automático láser automatizado y aplique binning durante la adquisición. A continuación, almacene las imágenes como archivos punto-tiff en escala de grises de 16 bits junto con los metadatos. El reconocimiento de anticuerpos no debe ser interrumpido por cambios conformales en la proteína diana que pueden ser inducidos por la unión de ligandos.Por ejemplo, BIRB796 tiene una tasa de apagado larga y la cuantificación de la interacción de destino solo es posible aplicando un paso de recuperación de antígeno. Este experimento representativo de curva de agregación térmica para células tratadas con compuestos de control positivos y negativos ilustra los rangos típicos de estabilización de proteínas después del tratamiento de las células con los compuestos a varias temperaturas. Aquí se muestra un experimento típico de huellas dactilares de dosis-respuesta isotérmica para demostrar rangos representativos de estabilización de proteínas en respuesta a diferentes dosis de compuesto experimental.La aplicación de desafíos de calor isotérmico para el cribado compuesto para identificar nuevos aglutinantes de la proteína diana permite el análisis de un gran número de compuestos a una sola concentración a la vez, antes de la huella digital de dosis-respuesta isotérmica de los impactos para confirmar la estabilización de la proteína objetivo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las condiciones experimentales exactas, como la longitud y la temperatura del desafío de calor afectan la potencia observada de los compuestos. No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso.Y siempre se deben tomar precauciones, como seguir las pautas de seguridad institucional, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

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