Discriminación y Caracterización de las Poblaciones Heterocelulares Usando Técnicas de Imagen Cuantitativa

El objetivo general de esta metodología es evaluar cuantitativamente las respuestas fenotípicas dinámicas de poblaciones heterocelulares frente a perturbaciones, al tiempo que se discrimina entre subpoblaciones. La mayoría de las interacciones fisiológicas ocurren en presencia de múltiples tipos celulares. Este método puede ayudar a los biólogos celulares a evaluar cómo responden células heterogéneas a presiones ambientales idénticas y cómo diferentes tipos celulares se influyen mutuamente.

Esta técnica presenta varias ventajas: discrimina entre múltiples tipos celulares, permite el análisis simultáneo de subpoblaciones, incluyendo tasas de natalidad y mortalidad, así como la dinámica morfológica. Aunque este protocolo puede utilizarse para estudiar muchos procesos biológicos, demostraremos el flujo de trabajo utilizando células tumorales H3255 y células fibroblastos CCD19LU tratadas con Erlotinib, un fármaco quimioterapéutico. Para comenzar, tras preparar las suspensiones celulares en tubos según el protocolo descrito, invierta los tubos para mezclar las células en solución y así estandarizar la siembra.

Luego, pipetee 10 microlitros de cada suspensión celular en un tubo microcentrífugo y agregue 10 microlitros de azul de tripano. Pipetee 10 microlitros de la solución en una lámina para conteo celular e introduzca la lámina en un contador automático de células. Repita el conteo celular al menos tres veces, o hasta que los conteos obtenidos sean consistentes.

Utilizando una pipeta multicanal, siembre un total de 1.500 células en 100 microlitros de RPMI en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Siembre cada suspensión celular por triplicado con configuraciones de placa idénticas para cada punto temporal. Incube las células durante la noche.

Añada DMSO al polvo de Erlotinib para preparar una solución stock de Erlotinib de 10 milimolar. Luego, use medio de cultivo celular para diluir el fármaco hasta dos veces la concentración final más alta de 10 micromolar. Diluya el fármaco seriamente cuatro veces en una proporción de 1:10, para un total de cinco concentraciones de fármaco y un control sin fármaco.

Pipetee 100 microlitros de solución de fármaco en los pozos adecuados de la placa de 96 pozos con células para obtener una concentración final de fármaco de 1x diluida en medio. Luego, para teñir las células para la clasificación basada en fluorescencia, prepare cinco microgramos por mililitro de tinción nuclear y cinco micromolares de tinción para células muertas en PBS. Para la clasificación basada en morfología, prepare cinco microgramos por mililitro de tinción nuclear, cinco micromolares de tinción para células muertas y cinco micromolares de tinción celular en PBS.

Añada 20 microlitros de solución de colorante a cada pocillo. A continuación, incube las muestras a 37 grados Celsius, protegidas de la luz, durante 30 minutos. Para adquirir imágenes, use etanol al 70 % para limpiar la parte inferior de la placa y coloque la placa en la cámara de imagen.

En la pestaña de configuración, bajo la selección de canales, haga clic en el botón más para agregar los canales apropiados a la imagen. Bajo la selección de diseño, establezca un apilamiento en z de imágenes de prueba cada dos micrones, comenzando en cero micrones y terminando en 20 micrones, para identificar el plano de enfoque. Haga clic en captura, bajo cada canal, para evaluar las intensidades y optimizar los tiempos de exposición.

Introduzca valores más altos o más bajos en el campo de tiempo según sea necesario. Los núcleos en las células deben estar enfocados para garantizar la precisión del análisis posterior. En el esquema de la placa, resalte los pozos adecuados.

Luego, en el esquema de pozos, resalte los 25 campos que se van a imaginar de manera similar. En ejecutar experimento, identifique la placa en el nombre de la placa y, a continuación, haga clic en el botón de inicio para ejecutar el protocolo de adquisición de imágenes con un objetivo de 10x y generar imágenes TIFF en escala de grises en los canales elegidos. Después de instalar los programas de código abierto CellProfiler y CellProfiler Analysis, abra CellProfiler, haga clic en Archivo, Importar, Canalización desde archivo y seleccione el archivo correspondiente.

Seleccione la canalización de clasificación basada en fluorescencia para clasificar las células como H3255 o CCD19LU según la intensidad de EGFP y para calcular las características de morfología. Haga clic en Ver configuración de salida, luego seleccione la ubicación de los archivos de imagen para el análisis y el destino de los datos extraídos. Antes de ejecutar el análisis, el protocolo debe probarse en modo de prueba para verificar los valores de los parámetros.

Es importante que la segmentación nuclear y celular sea precisa. Este protocolo fue diseñado para identificar células con tinción nuclear variable y asegurar que el valor de píxeles mediante el cual se expanden los núcleos sea lo suficientemente grande como para enmascarar los núcleos con la mayor tinción de ADN, pero lo suficientemente pequeño como para no enmascarar los núcleos circundantes. Para clasificar poblaciones basándose en la fluorescencia, primero reescale el rango de intensidad de GFP, luego mida la intensidad de GFP de cada núcleo identificado y clasifique los objetos según un umbral definido por el usuario.

A continuación, haga clic en analizar imágenes para comenzar el análisis. Cuando el análisis haya finalizado, vaya a la carpeta de salida predeterminada para ver los datos calculados. Para la clasificación basada en morfología, ejecute el protocolo adecuado en Cell Profiler para generar características de morfología celular completa.

Abra el software de análisis Cell Profiler, seleccione el archivo de propiedades de la base de datos generado en Cell Profiler y haga clic en abrir. Haga clic en la pestaña Clasificador en la parte superior izquierda de la pantalla. Para obtener imágenes aleatorias de células del experimento, haga clic en obtener; las imágenes aparecerán en la ventana sin clasificar.

Clasifique manualmente las células como positivas o negativas, que en este caso representan H3255 o CCD19LU, seleccionando y arrastrando las células al compartimento correspondiente. Después de clasificar al menos 50 células por subpoblación, haga clic en Entrenar Clasificador y luego en Verificar Progreso. Finalmente, haga clic en Puntuar Todo para generar una tabla con el número de células de cada subpoblación.

En un cultivo en frío heterocelular de células tumorales H3255 y fibroblastos CCD19LU, se identificaron y segmentaron los núcleos basándose en la tinción de ADN. Las poblaciones celulares se clasificaron ya sea mediante fluorescencia inducida artificialmente o mediante entrenamiento de un algoritmo de aprendizaje automático para identificar los tipos celulares según las diferencias morfológicas. Existe una alta concordancia entre los métodos basados en fluorescencia y morfología.

Los dos métodos de clasificación se aplicaron de forma independiente a las mismas imágenes y coincidieron en un 97,4 % y un 92,5 % en las poblaciones no tratadas y tratadas, respectivamente. Aquí se investigaron los cambios en la morfología celular y la respuesta al tratamiento con Erlotinib. Tras tres días de tratamiento con el fármaco, se observó una disminución del área nuclear y un aumento del área celular en las células H3255.

Esto posiblemente se debió a la muerte celular. Para comprobar si el Erlotinib tenía un efecto citotóxico o citostático sobre las células, se identificaron las células muertas basándose en la tinción con yoduro de propidio. Se observaron tanto efectos citotóxicos como citostáticos del Erlotinib sobre las células H3255, con un aumento en el número de muertes y una disminución en el número de divisiones celulares tras el tratamiento con el fármaco.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas no consecutivas si se lleva a cabo correctamente. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la interferencia de AR o CRISPR, para abordar preguntas adicionales sobre genómica funcional. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del cáncer exploraran la influencia de las células estromales en la progresión tumoral en múltiples tipos de cáncer.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar las respuestas heterocelulares a estímulos ambientales, específicamente cómo analizar datos de imágenes basadas en microscopía de manera de alto rendimiento.