Discriminación y Caracterización de las Poblaciones Heterocelulares Usando Técnicas de Imagen Cuantitativa

El objetivo general de esta metodología es evaluar cuantitativamente las respuestas fenotípicas dinámicas de las poblaciones heterocelulares a las pertubaciones, discriminando entre subpoblaciones. La mayoría de las interacciones fisiológicas ocurren en presencia de múltiples tipos de células. Este método puede ayudar a los biólogos celulares a evaluar cómo las células heterogéneas responden a presiones ambientales idénticas y cómo las diferentes se influyen entre sí.

Esta técnica tiene varias ventajas, discrimina entre múltiples tipos de células, permite el análisis simultáneo de subpoblaciones, incluidas las tasas de natalidad y mortalidad y la dinámica morfológica. Si bien este protocolo se puede utilizar para estudiar muchos procesos biológicos, demostraremos el flujo de trabajo utilizando células tumorales H3255 y células CCD19LU fibroblastos tratadas con Erlotinib, un fármaco quimioterapéutico. Para comenzar, después de preparar las suspensiones celulares en tubos de acuerdo con el protocolo de texto, invierta los tubos para mezclar las células en solución para estandarizar la siembra.

A continuación, pipetee 10 microlitros de cada suspensión celular en un tubo de microcentrífuga y añada 10 microlitros de azul de tripano. Pipetee 10 microlitros de la solución en un portaobjetos de recuento de células e inserte el portaobjetos en un contador de células automatizado. Repita el recuento de células al menos tres veces, o hasta que los recuentos obtenidos sean consistentes.

Utilizando una pipeta multicanal, siembre un total de 1.500 células en 100 microlitros de RPMI en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Coloque cada suspensión de celda por triplicado con configuraciones de placas idénticas para cada punto de tiempo. Incuba las células durante la noche.

Agregue DMSO al polvo de erlotinib para hacer una solución madre de erlotinib de 10 milimolares. A continuación, utilice el medio de cultivo celular para diluir el fármaco a dos veces la concentración final más alta de 10 micromolares. Diluir el medicamento en serie cuatro veces en una proporción de 1:10, para un total de cinco concentraciones de medicamento y un control sin drogas.

Pipetear 100 microlitros de solución de fármaco en los pocillos apropiados de la placa de células de 96 pocillos para obtener una concentración final de fármaco de 1x diluido en medio. Luego, para teñir las células para la clasificación basada en fluorescencia, prepare cinco microgramos por mililitro de tinción nuclear y cinco micromolares de tinción de células muertas en PBS. Para la clasificación basada en la morfología, prepare cinco microgramos por mililitro de tinción nuclear, cinco micromolares de tinción de células muertas y cinco micromolares de tinción de células en PBS.

Agregue 20 microlitros de solución de tinte a cada pocillo. Luego, incubar las muestras a 37 grados centígrados protegidas de la luz durante 30 minutos. Para obtener imágenes, use etanol al 70% para limpiar la parte inferior de la placa y colóquela en la cámara de imágenes.

En la pestaña de configuración, en la selección de canales, haga clic en el botón más para agregar los canales apropiados a la imagen. En Selección de diseño, establezca una pila z de imágenes de prueba cada dos micras, comenzando en cero micras y terminando en 20 micras, para identificar el plano de enfoque. Haga clic en Instantánea, debajo de cada canal para evaluar las intensidades y optimizar los tiempos de exposición.

Introduzca valores más altos o más bajos en el tiempo según sea necesario. Los núcleos de las células deben estar enfocados para garantizar la precisión del análisis posterior. En el esquema de la placa, resalte los pozos apropiados.

A continuación, en el esquema de los pozos, resalte los 25 campos que se van a visualizar de forma similar. En ejecutar experimento, identifique la placa en el nombre de la placa y, a continuación, haga clic en el botón de inicio para ejecutar el protocolo de adquisición de imágenes con un objetivo 10x para generar imágenes TIFF en escala de grises en los canales elegidos. Después de instalar los softwares de código abierto, CellProfiler y CellProfiler analysis, abra CellProfiler, haga clic en Archivo, Importar, Canalización desde archivo y seleccione el archivo adecuado.

Seleccione la tubería de clasificación basada en fluorescencia para clasificar las células como H3255 o CCD19LU en función de la intensidad de EGFP y para calcular las características de morfología. Haga clic en Ver configuración de salida y, a continuación, seleccione la ubicación de los archivos de imagen para el análisis y el destino de los datos extraídos. Antes de ejecutar el análisis, el protocolo debe probarse en modo de prueba para comprobar los valores de los parámetros.

Es importante que la segmentación nuclear y celular sea precisa. Este protocolo fue diseñado para identificar células con diferentes tinciones de núcleos, asegurando que el valor de píxel en el que se expanden los núcleos sea lo suficientemente grande como para enmascarar los núcleos con la mayor tinción de ADN, pero lo suficientemente pequeño como para no enmascarar los núcleos circundantes. Para clasificar las poblaciones en función de la fluorescencia, primero reescale el rango de intensidad de GFP, luego mida la intensidad de GFP de cada núcleo identificado y clasifique los objetos en función de un umbral definido por el usuario.

A continuación, haga clic en analizar imágenes para comenzar el análisis. Una vez finalizado el análisis, vaya a la carpeta de salida predeterminada para ver los datos calculados. Para la clasificación basada en morfología, ejecute el protocolo adecuado en el generador de perfiles de celdas para generar características de morfología de celdas completas.

Abra el software Cell Profiler Analysis, seleccione el archivo de propiedades de la base de datos generado en Cell Profiler y haga clic en abrir. Haga clic en la pestaña Clasificador en la parte superior izquierda de la pantalla. Para llamar a imágenes de celdas aleatorias del experimento, haga clic en obtener, las imágenes aparecerán en la ventana sin clasificar.

Clasifique manualmente las celdas como positivas o negativas, que en este caso representan H3255 o CCD19LU seleccionando y arrastrando las celdas a la bandeja adecuada. Después de clasificar al menos 50 celdas por subpoblación, haga clic en Entrenar clasificador y, a continuación, haga clic en Comprobar progreso. Por último, haga clic en Puntuar todo para generar una tabla con los recuentos de celdas de cada subpoblación.

En un cultivo heterocelular frío de células tumorales H3255 y CCD19LU fibroblastos, se identificaron y segmentaron los núcleos según la tinción de ADN. Las poblaciones celulares se clasificaron mediante fluorescencia inducida artificialmente o mediante entrenamiento en algoritmos de aprendizaje automático para identificar tipos de células en función de las diferencias morfológicas. Existe una alta concordancia entre las metodologías basadas en fluorescencia y morfología.

Los dos métodos de clasificación se asociaron de forma independiente a las mismas imágenes y concordaron en un 97,4% y un 92,5% en las poblaciones tratadas y no tratadas, respectivamente. Aquí, se investigaron los cambios en la morfología celular y la respuesta al tratamiento con erlotinib. Después de tres días de tratamiento farmacológico, se observó una disminución en el área de los núcleos y un aumento en el área celular de las células H3255.

Esto posiblemente se debió a la muerte celular. Para probar si el erlotinib tenía un efecto citotóxico o citostático en las células, se identificaron las células muertas mediante la tinción con yoduro de propidio. Se observaron efectos citotóxicos y citostáticos de erlotinib en las células H3255, con un aumento en el número de muertes y una disminución en el número de nacimientos después del tratamiento farmacológico.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas no consecutivas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la interferencia de RA o CRISPR, con el fin de abordar cuestiones adicionales que investigan la genómica funcional. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del cáncer exploraran la influencia de las células estromales en la progresión tumoral en múltiples tipos de cáncer.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar las respuestas heterocelulares a los estímulos ambientales, específicamente cómo analizar datos de imágenes basados en microscopía de una manera de alto rendimiento.