Name: Discriminación y Caracterización de las Poblaciones Heterocelulares Usando Técnicas de Imagen Cuantitativa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprende a discriminar y caracterizar poblaciones heterocelulares mediante técnicas de imagen cuantitativa con CellProfiler. Este protocolo permite analizar simultáneamente subpoblaciones celulares y sus respuestas dinámicas a fármacos.

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Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) Subvenciones U54CA143798 y U54CA143907 para establecer Ciencias Físicas-Oncología Centros (PS-OC) en el Dana-Farber Cancer Institute y la Universidad del Sur de California, respectivamente. SM Mumenthaler recibió un premio de transnetwork de PS-OC que apoyó parte de este trabajo. Quisiéramos expresar nuestra más profunda gratitud a nuestros partidarios filantrópicos, en particular a la familia Stephenson, Emmet, Toni y Tessa, por su donación de la plataforma Operetta HCS. También queremos agradecer a J. Foo por orientación, y al Centro de Medicina Aplicada miembros del equipo de Medicina: D. Agus para la orientación clínica y mentoría, K. Patsch para las discusiones significativas con el diseño experimental, R. Rawat para la ayuda en los protocolos de análisis de imágenes , J. Katz para la asistencia técnica con la Operetta, y P. Macklin y D. Ruderman para las discusiones provechosas y la regeneración.

1. Cultivo celular NOTA: Aquí se investigaron las respuestas fenotípicas de células NSCLC (H3255) al agente de direccionamiento de EGFR, erlotinib, cuando se co-cultivaron con fibroblastos pulmonares (CCD-19Lu GFP). Para el mismo conjunto de datos, basada en la fluorescencia y la clasificación basada en la morfología de las dos poblaciones de células (H3255 y CCD-19Lu GFP) para ejemplificar su concordancia se realizó. Sin embargo, sólo se debe utilizar un método de clasificación y debe elegirse sobre la base de la aplicación. <ol><li> Preparar 500 ml de RPMI-1640 suplementado con FBS inactivado por calor al 10% y penicilina / estreptomicina al 1%. NOTA: El medio de crecimiento y los suplementos se pueden reemplazar según sea necesario para otros tipos de células. </li><li> Cultivar células en placas de 10 cm 3 como poblaciones puras en CO 2 al 5% a 37 ° C y pasar a una proporción apropiada cada 3-4 días. </li></ol> 2. Preparación de células <ol><li> Para preparar una suspensión celular, eliminar cEll y las células de lavado con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS). </li><li> Aspirar fuera del PBS, añadir 1 mL de 0,05% de tripsina calentada a 37 ° C e incubar durante 5 min (o hasta que las células ya no se adhieren a la placa) a 37 ° C. </li><li> Para neutralizar la tripsina, añadir 4 ml de RPMI a las placas H3255 y CCD-19Lu GFP y pipetear las soluciones celulares en tubos cónicos de 15 ml. </li><li> Centrifugar las células a 150 xg durante 5 minutos a RT. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender los sedimentos celulares en 10 ml de medio RPMI en tubos cónicos para preparar la siembra. </li></ol> 3. Revestimiento de células <ol><li> Cuente las células para estandarizar la siembra. <ol><li> Invertir tubos para mezclar las células en solución. Pipetear 10 μl de cada suspensión de células en un tubo de microcentrífuga y añadir 10 μl de azul de tripano. </li><li> Pipetee 10 μL de esta solución en una diapositiva de conteo de células e inserte en un contador de células automatizado. NOTA: Otros métodos de recuento celular ( es decir,. Hemocitómetro). </li><li> Repita el recuento de células por lo menos tres veces, o hasta que los recuentos obtenidos sean consistentes. </li></ol></li><li> Las células de semilla en una placa de varios pocillos NOTA: El número de placas a sembrar depende del número de puntos de tiempo que se visualizarán. Alternativamente, una placa se puede volver a imaginar con el tiempo si las células se transducen con histona-2B-GFP (u otras tinciones nucleares lentivirales estables que proporcionan una segmentación nuclear adecuada). <ol><li> Semilla de un total de 1.500 células / pocillo en 100 μ l de RPMI. Preparar tres suspensiones de células para la placa de tres poblaciones de células: H3255, CCD-19Lu GFP, y 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Realice cada uno por triplicado con configuraciones de placa idénticas para cada punto de tiempo. NOTA: Las densidades de siembra iniciales se deben optimizar para cada línea celular y tamaño de placa. </li><li> Seed células en placas de 3 x 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal. Incubar las células O / N a 37 ° C, 5% de CO 2 . </li></ol> &lt;Li </ol> 4. Dosificación de fármacos <ol><li> Añadir DMSO a erlotinib en polvo para hacer una solución madre de erlotinib final de 10 mM de concentración. NOTA: El fármaco puede ser sustituido como se desee. </li><li> Diluir el fármaco con medio de cultivo celular a 2x la concentración final con la concentración final más alta a 10 μM y diluir en serie cuatro veces a una relación 1:10, para un total de cinco concentraciones de fármaco y un control sin fármaco. NOTA: Si la concentración de DMSO es igual o superior a 0,1% v / v a la dosis de fármaco más alta, el control de fármaco no debe contener una cantidad equivalente de DMSO para asegurar que los efectos observados observados no se deban a la toxicidad de DMSO. </li><li> Pipetear 100 μl de solución de fármaco en el pocillo apropiado para una concentración final de fármaco de 1x diluido en medio. </li></ol> 5. Adquisición de imágenes NOTA: Las imágenes fueron adquiridas en los días 0, 2 y 3. Dependiendo de los tipos celulares y de los procesos celulares estudiados, oSe pueden estudiar los puntos temporales deseados. <ol><li> Mancha las células para preparar la imagen. <ol><li> Preparar la solución de colorante a las siguientes concentraciones finales. <ol><li> Para la clasificación basada en fluorescencia, preparar tinción nuclear de 5 μg / mL y tinción de células muertas 5 μM en PBS (ver Tabla de Materiales ). </li><li> Para la clasificación basada en la morfología, preparar tinción nuclear de 5 μg / mL, tinción de células muertas 5 μM y tinción celular 5 μM en PBS (ver Tabla de Materiales ). </li></ol></li><li> Añadir 20 μL de solución de colorante a cada pocillo. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C protegido de la luz. </li></ol></li><li> Optimizar y adquirir imágenes. <ol><li> Retire la placa del pozo de la incubadora, limpie la parte inferior de la placa con EtOH al 70% y coloque la placa en la cámara de imagen. </li><li> En la pestaña &#39;Configuración&#39;, haga clic en el botón &#39;+&#39; en &#39;Selección de canales&#39; para agregar canales(Es decir , campos brillantes, tinción nuclear, tinción de células muertas, GFP y señales RFP). </li><li> Haga clic en &#39;Layout Selection&#39; (selección de disposición) y tome imágenes de prueba empiladas en z cada 2 μm comenzando en 0 μm y terminando en 20 μm para identificar el plano de enfoque. Introduzca esta distancia para cada canal bajo &#39;Altura&#39;. </li><li> Haga clic en &quot;Instantánea&quot; en cada canal para evaluar las intensidades y optimizar los tiempos de exposición. Ingrese valores más altos o más bajos en &quot;Hora&quot; según sea necesario. </li><li> En el lado derecho de la pantalla, resalte los pozos apropiados (que se van a visualizar) en el esquema de la placa. En el esquema de pozos a continuación, resalte los veinticinco campos que se van a tomar imágenes de una manera similar. </li><li> En &quot;Ejecutar experimento&quot;, identifique la placa en &quot;Nombre de placa&quot; en la pestaña izquierda y haga clic en el botón &quot;Inicio&quot; (debajo) para ejecutar el protocolo de adquisición de imágenes con un objetivo 10X para generar imágenes TIFF en escala de grises en los canales mencionados. NOTA: paso a paso instRucciones para el protocolo de imagen pueden diferir entre los instrumentos, pero los valores de los parámetros deben ser optimizados. </li><li> Repita la proyección de imagen en los días dos y tres. </li></ol></li></ol> 6. Análisis de imágenes NOTA: Todo el análisis de imagen se realizó utilizando software propietario. Sin embargo, debido a que esto no es disponible públicamente, los análisis comparables también fueron diseñados en CellProfiler 2.2 y CellProfiler Analyst 2.0, con un breve protocolo listado a continuación y un protocolo detallado proporcionado como material complementario (las imágenes de prueba ya están cargadas en las tuberías para probar el flujo de trabajo). Las imágenes de este experimento se agruparon en una base por pozo para que cada pocillo pudiera cargarse individualmente. Los pipelines de CellProfiler a continuación contienen una expresión regular que analiza la información de metadatos de cada nombre de archivo de imagen y permite que las imágenes se agrupan aún más por canal. <ol><li> Descargue e instale el software de código abierto: &#39;CellProfiler9; Y &#39;CellProfiler Analyst&#39;. Acepte todas las opciones y complementos predeterminados durante la instalación. </li><li> Clasificar los cultivos heterocelulares en subpoblaciones. <ol><li> Abra el software &#39;CellProfiler&#39;, haga clic en &#39;Archivo&#39; | &#39;Pipeline de importación&#39; | &#39;From File&#39; y seleccione el archivo apropiado (&quot;Fluorescence_Classification.cppipe&quot; para la clasificación basada en fluorescencia , o &quot;Morphology_Classification.cppipe&quot; para la clasificación basada en morfología). NOTA: Estos archivos contienen protocolos para procesamiento básico de imágenes y segmentación de núcleos / células. Debido a la irregular mancha Hoechst presente a través de estas células, los núcleos se segmentaron y agrandaron, y luego se utiliza para enmascarar la imagen para permitir la segmentación de núcleos con intensidades más bajas. <ol><li> Seleccione el gasoducto de clasificación basado en fluorescencia para clasificar las células como H3255 o CCD-19Lu sobre la base de la intensidad eGFP y para calcular las características morfológicas. NOTA: CCD-19Lu células fueron transducidas con GFP. </li><li> Seleccione el gasoducto de clasificación basado en morfología para segmentar núcleos y células y para calcular características morfológicas. NOTA: Para la clasificación es necesario realizar análisis adicionales en el &#39;CellProfiler Analyst&#39;. Las células muertas se clasifican mediante clasificación basada en fluorescencia. </li></ol></li><li> Haga clic en &quot;Ver configuración de salida&quot; en la parte inferior izquierda de la pantalla. Seleccione la ubicación de los archivos de imagen para análisis (&#39;Default Input Folder&#39;) y el destino de los datos extraídos (&#39;Default Output Folder&#39;). </li><li> Haga clic en &#39;Analizar imágenes&#39; para comenzar el análisis. Una vez finalizado el análisis, haga clic en &quot;Aceptar&quot; y vaya a la &quot;Carpeta de salida predeterminada&quot; para ver los datos calculados. NOTA: Los valores de los parámetros de ejemplo y las imágenes están disponibles en el archivo suplementario 1-CellProfilerProtocol.pdf . </li><li> Para la clasificación basada en morfología (solamente) haga lo siguiente. <ol><li> Abra el software &#39;CellProfiler Analyst&#39;, seleccione el archivo de propiedades de la base de datos generado en CellProfiler y haga clic en &#39;Abrir&#39;. </li><li> Haga clic en la pestaña &#39;Clasificador&#39; en la parte superior izquierda de la pantalla. Para llamar a las imágenes celulares aleatorias del experimento, haga clic en &#39;Buscar&#39;; Las imágenes aparecerán en la ventana sin clasificar. </li></ol></li><li> Clasifique manualmente las células como positivas (H3255) o negativas (CCD-19Lu) seleccionando y arrastrando las celdas a la casilla correspondiente (vea el archivo suplementario 2-Pipeline.pdf : Figura B ). Después de clasificar al menos 50 células por subpoblación, haga clic en &#39;Train Classifier&#39; y, a continuación, en &#39;Check Progress&#39;. NOTA: Las celdas se clasifican a través de un algoritmo de aprendizaje de máquina forestal aleatoria supervisada por el usuario [ 12] . Si la precisión no está por encima del umbral aprobado (&gt; 90%), puede ser necesario retroceder y optimizar la segmentación celular en &#39;CellProfiler&#39;, o las células pueden no ser ideales para classiFying por la morfología. </li><li> Haga clic en &quot;Puntuación completa&quot; para generar una tabla con recuentos de celdas para cada subpoblación. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kanemura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+in+vitro+proliferative+activity+of+human+fetal+neural+stem%2Fprogenitor+cells+using+indirect+measurements+of+viable+cells+based+on+cellular+metabolic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity.</a> J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).</li>
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<li>Dao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+Analyst%3A+interactive+data+exploration%2C+analysis+and+classification+of+large+biological+image+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito anteriormente mejora los ensayos actuales de biología celular al proporcionar información más completa sobre la dinámica fenotípica de múltiples tipos de células en respuesta a perturbaciones ambientales mientras se utilizan reactivos y tiempo reducidos. Una de las principales ventajas de este diseño experimental es la capacidad de analizar múltiples fenotipos con una sola configuración y generar datos cuantitativos que caractericen estos fenotipos a nivel de una sola célula. Una ventaja técnica de esta plataforma es la facilidad de resolución de problemas inicial en comparación con otros ensayos. Debido a que este método se basa en imágenes, se puede visualizar los pozos para una aparente siembra excesiva o insuficiente. Es aconsejable tener células en la fase de crecimiento exponencial durante la duración del experimento y no estar limitado por limitaciones de nutrientes o espaciales o confundido por la senescencia debido a la escasa siembra. De lo contrario, las tasas de natalidad y mortalidad pueden no ser reproducibles entre experimentos. Como referencia, CellPD es un programa disponible públicamente para el cálculo de las tasas de natalidad y mortalidad14. Además, se puede visualizar si se agregaron concentraciones adecuadas de colorantes a cada pocillo. Los problemas de pipeteo en un pozo individual podrían resultar en una segmentación incorrecta y datos sesgados, pero se pueden detectar fácilmente con el protocolo mencionado anteriormente.
Desafortunadamente, no todos los tipos de células pueden ser susceptibles de esta aplicación. Es importante poder segmentar con precisión los núcleos y las células, por lo tanto, el análisis de células que se organizan en estructuras más esféricas o agrupadas puede no ser adecuado. Para algunas células, también puede ser ventajoso usar un colador de células antes de la siembra para asegurar la siembra inicial de células individuales. Además, la técnica del clasificador lineal solo es aplicable a tipos de células que se pueden distinguir fácilmente en función de las características morfológicas. 
Para el éxito del protocolo, es importante optimizar primero las condiciones de imagen, ya que la validez de los análisis posteriores depende de la calidad de las imágenes. Si bien aquí realizamos experimentos utilizando una plataforma de detección de alto contenido, la adquisición de imágenes también se puede realizar utilizando cualquier microscopio fluorescente (aunque una plataforma de imágenes automatizada es ideal para enfoques de alto rendimiento). Las imágenes de prueba deben tomarse antes de cada punto de tiempo de imagen para garantizar que no haya problemas con el microscopio o el protocolo. La relación señal/ruido debe ser alta, especialmente para los canales que se utilizarán para la segmentación (es decir , núcleos, tinciones celulares). Además, es importante obtener imágenes en el plano de enfoque óptimo. Si las imágenes están desenfocadas, la segmentación se vuelve mucho más difícil y las características morfológicas calculadas probablemente serán inexactas. Las diferencias de iluminación entre campos también pueden causar problemas con la segmentación de imágenes. Las grandes diferencias de luminosidad dificultan la selección automatizada de los valores umbral. Además, si hay intensidades de fluorescencia heterogéneas entre las células, es posible que un solo valor umbral no segmente suficientemente todas las células de una imagen. En este análisis, estos problemas se superaron creando máscaras alrededor de poblaciones de células más brillantes y más tenues y segmentando cada población por separado. 
Si bien los fenotipos bajo investigación en este protocolo se limitan a la caracterización morfológica, viva y muerta, se pueden expandir fácilmente para investigar otras características. Por ejemplo, se pueden agregar estudios genéticos funcionales con ARNi, sobreexpresión u otras perturbaciones químicas. 
En este artículo, se demostró la capacidad del protocolo para medir la respuesta de las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas al erlotinib en presencia y ausencia de CAF. Sin embargo, este es solo un ejemplo de los muchos tipos de células y parámetros microambientales que se pueden probar. Hemos ampliado este protocolo para que se utilice con otros tipos de células y estudios farmacológicos, incluidas las células primarias aisladas de tumores de pacientes13,15.

Ensayos basados ​​en células han sido un caballo de batalla en la investigación básica y la configuración del desarrollo de drogas. Sin embargo, las limitaciones de estos ensayos estándar se han hecho cada vez más evidentes con la discordancia entre los datos in vitro y clínicos y el fracaso de la mayoría de los fármacos para recibir la aprobación de la FDA. Aquí, presentamos un nuevo método para la utilización de imágenes cuantitativas para analizar simultáneamente los fenotipos heterocelulares en respuesta a los estímulos ambientales pertinentes co-occurring. Los ensayos basados ​​en células tradicionales que se usan para medir la viabilidad celular incluyen: ensayos de exclusión de azul de tripán, tinción con citometría de flujo con MTT / MTS y anexina V-FITC. Trypan azul exclusión ensayos, mientras que simple y barato, requieren un gran número de células, son mucho tiempo, y son a menudo influenciados por el usuario sesgo 1 . MTT y MTS indirectamente medir la viabilidad celular a través de mediciones de la tasa metabólica mitocondrial. Sin embargo, la actividad metabólica(Por ejemplo, los medios de comunicación o la concentración de oxígeno), lo que conduce a resultados imprecisos y evita la estandarización entre los tipos y condiciones de las células 2 , 3 . Otra desventaja principal de estas técnicas es su incapacidad para distinguir entre tipos de células múltiples - la mayoría de los sistemas biológicos son heterocelulares. Aunque los métodos de citometría de flujo tienen la capacidad de distinguir entre poblaciones de células múltiples, se requieren etiquetas de células, el muestreo dinámico es desafiante y cuando se usan células adherentes, esta aplicación se convierte en mucho tiempo y propensa a errores. Otros importantes fenotipos celulares, incluyendo los cambios morfológicos, se producen en respuesta a los estímulos ambientales, pero no son capturados por los ensayos basados ​​en células tradicionales. La elaboración de perfiles de los estados de las células a través de la caracterización morfológica y las similitudes de mapeo entre muestras es una herramienta poderosa e imparcial con el aBility para proveer nuevas ideas sobre muchos aspectos de la investigación básica y traslacional, incluyendo la biología celular básica y el descubrimiento de fármacos 4 . Además, se ha demostrado que la morfología de las células tumorales se correlaciona con los subtipos tumorales 5 y la agresividad 6 . Por lo tanto, es de gran interés estudiar estas características celulares y cómo se relacionan con perturbaciones ambientales específicas. Además, se pueden utilizar diferencias en las características morfológicas para discriminar entre subpoblaciones en sistemas de co-cultivo. Las células marcadoras fluorescentes tienen caídas ( es decir, alteran las propiedades celulares inherentes, consumen tiempo) y, por lo tanto, son ventajosos métodos adicionales para clasificar tipos celulares. La imagen basada en microscopía es un método alternativo para perfilar los fenotipos celulares de una manera multiplexada, cuantitativa y robusta. En este manuscrito, aplicamos nuestra tubería de imagen cuantitativa para destacar la evoluciónDinámica de las poblaciones de células heterogéneas dentro de un tumor. Nos centramos en la interacción entre células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y Fibroblastos Asociados al Cáncer (CAF), el tipo de células estromales más prevalente en tumores. Las CAF han sido implicadas en la iniciación tumoral, la progresión y la respuesta terapéutica; Por lo tanto, la realización de ensayos fenotípicos en las células tumorales en ausencia de CAF puede ser engañosa [ 7 , 8 , 9] . Específicamente, evaluamos los efectos de las CAFs en las células tumorales en respuesta al erlotinib, una molécula pequeña dirigida al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) que se usa a menudo en el tratamiento clínico del NSCLC. Utilizamos una plataforma de cribado de alto contenido y su software de análisis de imagen que acompaña a la evaluación; Sin embargo, en un intento de hacer accesible esta metodología a otros investigadores, también hemos desarrollado un protocolo comparable de downstream usando el software de código abierto:CellProfiler 10 y CellProfiler Analyst 11 . La mayoría de los ensayos de detección de alto contenido basados ​​en imágenes se analizan con software comercializado específico para un modelo de instrumento dado. Los resultados son difíciles de replicar en otros laboratorios con software diferente porque los algoritmos subyacentes son a menudo propietarios. Usando este oleoducto basado en imágenes, se midió la proliferación celular, la muerte y la morfología de cada subpoblación de un cultivo heterocelular en respuesta al tratamiento con fármaco utilizando tanto la clasificación basada en fluorescencia como en la morfología. El siguiente protocolo proporciona una metodología robusta para probar procesos celulares complejos.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV medio de</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td>suplemento medio</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>suplemento medio</td></tr><tr><td>TC20</td><td>Biorad</td><td>Contador</td> de <td>células</td></tr><tr><td>1450102 TC20 con azul de tripano</td><td>Célula 1450003 Biorad</td><td></td><td> portaobjetos placas</td></tr><tr><td>de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3904</td><td>placas negras de fondo transparente</td></tr><tr><td>Erlotinib</td><td>LC Laboratories</td><td>E-4007</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>317275-100ML</td><td>solución para resuspender el fármaco</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H21491</td><td>colorante nuclear</td></tr><tr><td>Yoduro de propidio (PI)</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td>tinción de células muertas</td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange CMRA</td><td>Life Technologies</td><td>C34551</td><td>tinción de célula entera</td></tr><tr><td>Operetta sistema de imagen de alto contenido</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>Broad Institue</td><td>versión 2.2.0 (rev 9969f42)</td><td>http://cellprofiler.org/releases/</td></tr> <tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td> <td>de cultivo celularCualquier incubadora de cultivo celular será adecuada: las células se cultivaron bajo 37 &ordm; C al 5% de CO2,</td></tr><tr><td>15 mL Tubos cónicos Falcon</td><td></td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>10 cm2 placas de cultivo celular</td><td>TPP</td><td>93040</td><td></td></tr></tbody></table>

discriminación y caracterización de las poblaciones heterocelulares usando técnicas de imagen cuantitativa

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Los procesos celulares son complejos y resultan de la interacción entre múltiples tipos de células y su entorno. Las técnicas existentes de biología celular a menudo no permiten una interpretación precisa de esta interacción. Utilizando un enfoque basado en imágenes cuantitativas, presentamos un protocolo de alto contenido para caracterizar las respuestas fenotípicas dinámicas ( es decir , cambios morfológicos, proliferación, apoptosis) de poblaciones de células heterogéneas a cambios en los estímulos ambientales. Destacamos nuestra capacidad para distinguir entre tipos de células basadas en la intensidad de fluorescencia o características morfológicas inherentes dependiendo de la aplicación. Esta plataforma permite una caracterización más completa de la respuesta de la subpoblación a la perturbación mientras que utiliza tiempo más corto, cantidades más pequeñas de reactivos, y menor probabilidad de error que los ensayos tradicionales de biología celular. Sin embargo, en algunos casos, las poblaciones celulares pueden ser difíciles de identificar y cuantificar basándose en células complejasY requerirá una solución de problemas adicional; Destacamos algunas de estas circunstancias en el protocolo. Demostramos esta aplicación usando la respuesta al fármaco en un modelo de cáncer; Sin embargo, se puede aplicar con mayor facilidad a otros procesos fisiológicos. Este protocolo permite identificar subpoblaciones dentro de un sistema de co-cultivo y caracterizar la respuesta particular de cada uno a estímulos externos.

Se generó un conjunto de imágenes compuesto por 25 campos / pocillo, 54 pocillos / placa (3 poblaciones de células x 6 concentraciones de fármaco x 3 repeticiones), a través de tres placas para un total de 4.050 imágenes individuales. Los conjuntos de imágenes generadas a lo largo del experimento se analizaron utilizando un software propietario (véase tabla de materiales) para extraer varias propiedades cuantitativas de células ( es decir , morfología, fluorescencia) que podrían utilizarse para clasificar subpoblaciones celulares. Sin embargo, debido a que el software comercial utilizado tiene acceso limitado, se crearon ductos descendentes comparables en CellProfiler y CellProfiler Analyst. Clasificación heterocelular en subpoblaciones Los núcleos fueron identificados y segmentados en base a la tinción de ADN (aquí Hoechst) y las poblaciones de células se clasificaron basados ​​en fluorescencia o mo( Figura 1 ). Para la clasificación basada en la fluorescencia, los fibroblastos (CCD-19Lu) se transdujeron previamente con GFP-lentivirus. Los niveles de intensidad GFP se midieron para cada núcleo, y los que se calcularon por encima del umbral aceptado (basado en la señal de fondo) se clasificaron como CCD-19Lu mientras que los siguientes fueron identificados como células tumorales (H3255). Para la clasificación basada en morfología, las células se tiñeron previamente con una tinción celular no tóxica (véase la tabla de materiales) y se utilizó para identificar y segmentar el citoplasma. Un algoritmo de aprendizaje de la máquina fue entrenado con ~ 50-100 células de cada población. Se identificaron características morfológicas que eran significativamente diferentes entre las poblaciones, que se utilizaron entonces para diseñar un clasificador lineal para distinguir entre células CCD-19Lu y H3255. Los protocolos de clasificación de fluorescencia y morfología fueron 97,4% (n = 1403) concordantes en distinguir entre las dos poblaciones de célulasEn condiciones no tratadas y 92,5% (n = 916) concordante en las condiciones tratadas con fármacos (erlotinib 1 μM) ( Figura 2 ). Análisis fenotípicos de subpoblaciones Además de la discriminación entre los tipos de células, se trató de caracterizar las propiedades fenotípicas de cada subpoblación. Los ensayos de multiplexación ahorran tiempo y reactivos, aportan consistencia y proporcionan información adicional sobre el sistema que se está estudiando. Hay muchos potenciales resultados fenotípicos y uno debe elegir basados ​​en las preguntas de interés. Aquí, se investigaron los cambios en la morfología celular y el estado de viabilidad en respuesta al tratamiento con erlotinib. Después de tres días de tratamiento con fármaco, se observó una disminución en el área nuclear y un aumento en el área celular de las células H3255 ( Figura 3A ). La diferencia media en el área nuclear entreSe encontró que las poblaciones tratadas con &quot;fármaco sin fármaco&quot; y &quot;fármaco&quot; eran estadísticamente significativas a través de una prueba t de dos caras tipo 2 (varianza igual) ( p = 7,92 x 10 -16 ). Se plantea la hipótesis de que esta observación es una respuesta celular al estrés impuesto por el tratamiento farmacológico. También es de interés estudiar si un fármaco tiene un efecto citotóxico ( es decir, aumento del número de células muertas en el tiempo) o citostático ( es decir, disminución del número de nacimientos celulares en el tiempo), ya que esto tiene un impacto clínico profundo. Por ejemplo, un efecto citostático de fármaco induce la detención del crecimiento pero no elimina las células del tumor, por lo que existe el potencial de que las células cancerosas reinicien la proliferación celular una vez que se elimina el fármaco. Los efectos de la droga a menudo pueden ser el contexto, la concentración y el tipo de células dependientes. Anteriormente se observó erlotinib provocando una respuesta citotóxica en un tipo de célula, mientras que mostrando acRespuesta ytostática en otro 13 . Los ensayos de viabilidad tradicional producen el número relativo de células y, por tanto, no discriminan entre los arrestos por crecimiento y la muerte celular. En este documento, se identificaron células muertas basadas en tinción de yoduro de propidio ( Figura 3B ). Se observaron efectos citotóxicos y citostáticos del erlotinib sobre las células H3255, con un aumento en el número de muertes y una disminución en el número de nacimientos después del tratamiento con fármacos ( Figura 3C ). Vale la pena señalar que el número de células muertas disminuye después del día 1 probablemente debido a la depuración celular. Las células CCD-19Lu no se vieron afectadas por el fármaco. Una ventaja adicional de esta plataforma es la generación de datos cuantitativos. Por ejemplo, en nuestro experimento de co-cultivo, se encontró que una subpoblación inicial de 1.118 (75.8%) células H3255 era 2.817 (87.9%) o 396 (57.2%) después de tres días sin o con erlotinaIb, respectivamente ( Figura 4 ). Debido a que podemos generar recuentos de células reales en lugar de porcentaje relativo (como con los métodos de citometría de flujo), concluimos que el cambio en la composición durante el tratamiento con fármacos se debe a una disminución de las células H3255 y no a un aumento de CCD-19Lu. No vale la pena que las tasas de mortalidad se pueden subestimar debido a la depuración celular, que es difícil de evaluar experimentalmente y probablemente difiere entre los tipos de células. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" /> Figura 1: Visión general del Protocolo de análisis de imágenes. Dos posibles tuberías de análisis de imagen aguas abajo para clasificar las poblaciones heterocelulares utilizando una clasificación basada en morfología o basada en fluorescencia. Barras de escala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic en ella</a>E para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" /> Figura 2: Concordancia entre la Morfología y la Clasificación basada en la Fluorescencia. ( A ) Gráfico de concordancia que muestra la superposición de los dos protocolos de clasificación. Las mismas células se clasificaron como H3255 utilizando tanto la morfología y la fluorescencia basada en la clasificación. Los dos protocolos estuvieron de acuerdo, con clasificación de 97,4% (n = 1403) de células no tratadas y 92,5% (n = 916) de células tratadas con erlotinib (Nota: el área blanca es demasiado pequeña para visualizarse). ( B ) imágenes 10X que representan ejemplos de buena y mala concordancia entre la clasificación basada en la fluorescencia y la morfología basada. Las flechas blancas apuntan a las celdas que fueron clasificadas inconsistentemente entre las plataformas. Imagen de entrada: núcleos azules (Hoechst); Verde - CCD19Lu (GFP). ClassiImágenes de marcado: Rojo - H3255; Verde - CCD-19Lu. Barra de escala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" /> Figura 3: Mediciones fenotípicas multiplexadas de una sola configuración experimental. ( A ) Se calcularon características morfológicas, tales como núcleos y área celular, en el nivel de célula única en presencia y ausencia de fármaco. Nota: Las áreas celulares que miden menos de 100 μm 2 se consideraron escombros y se excluyeron de los análisis. La gráfica de la caja representa la mediana con los rangos del primer y tercer cuartil y las barras de error del intervalo de confianza del 95%. ( B ) Se co-cultivaron células H3255 (azul) y CCD-19Lu (verde) y se identificaron células muertas basándose en la intensidad de las células propídicasIum iodide mancha (rojo) y imágenes utilizando un objetivo 10X. Barra de escala = 1 mm (panel superior); 100 μm (imágenes del fondo). ( C ) Se calculó el número total de células vivas y muertas durante tres días con o sin tratamiento con fármaco, con una disminución obvia en el número de células vivas y aumento de células muertas con la adición de erlotinib. Las barras de error representan el error estándar de la media basada en tres repeticiones. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" /> Figura 4: Dinámica de la Subpoblación en el Tiempo. Imágenes representativas 10X de pocillos que contienen H3255 (azul) y CCD-19Lu (verde) el día 0 o el día 3 con y sin fármaco. Se contaron las células pertenecientes a cada subpoblación y los gráficos circulares proporcionales muestran la aCambios en la composición de la población en las muestras. Barras de escala = 1 mm (paneles centrales, shpwn en el panel más alto), 1 mm (imagen superior), 100 μm (imágenes del fondo). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Hemos desarrollado un nuevo protocolo para estudiar la dinámica de la población heterocelular en respuesta a las perturbaciones. Este manuscrito describe una plataforma basada en imágenes que produce conjuntos de datos cuantitativos para la caracterización simultánea de múltiples fenotipos celulares de poblaciones heterocelulares de una manera robusta.

Discriminación y Caracterización de las Poblaciones Heterocelulares Usando Técnicas de Imagen Cuantitativa

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

El objetivo general de esta metodología es evaluar cuantitativamente las respuestas fenotípicas dinámicas de poblaciones heterocelulares frente a perturbaciones, al tiempo que se discrimina entre subpoblaciones. La mayoría de las interacciones fisiológicas ocurren en presencia de múltiples tipos celulares. Este método puede ayudar a los biólogos celulares a evaluar cómo responden células heterogéneas a presiones ambientales idénticas y cómo diferentes tipos celulares se influyen mutuamente.Esta técnica presenta varias ventajas: discrimina entre múltiples tipos celulares, permite el análisis simultáneo de subpoblaciones, incluyendo tasas de natalidad y mortalidad, así como la dinámica morfológica. Aunque este protocolo puede utilizarse para estudiar muchos procesos biológicos, demostraremos el flujo de trabajo utilizando células tumorales H3255 y células fibroblastos CCD19LU tratadas con Erlotinib, un fármaco quimioterapéutico. Para comenzar, tras preparar las suspensiones celulares en tubos según el protocolo descrito, invierta los tubos para mezclar las células en solución y así estandarizar la siembra.Luego, pipetee 10 microlitros de cada suspensión celular en un tubo microcentrífugo y agregue 10 microlitros de azul de tripano. Pipetee 10 microlitros de la solución en una lámina para conteo celular e introduzca la lámina en un contador automático de células. Repita el conteo celular al menos tres veces, o hasta que los conteos obtenidos sean consistentes.Utilizando una pipeta multicanal, siembre un total de 1.500 células en 100 microlitros de RPMI en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Siembre cada suspensión celular por triplicado con configuraciones de placa idénticas para cada punto temporal. Incube las células durante la noche.Añada DMSO al polvo de Erlotinib para preparar una solución stock de Erlotinib de 10 milimolar. Luego, use medio de cultivo celular para diluir el fármaco hasta dos veces la concentración final más alta de 10 micromolar. Diluya el fármaco seriamente cuatro veces en una proporción de 1:10, para un total de cinco concentraciones de fármaco y un control sin fármaco.Pipetee 100 microlitros de solución de fármaco en los pozos adecuados de la placa de 96 pozos con células para obtener una concentración final de fármaco de 1x diluida en medio. Luego, para teñir las células para la clasificación basada en fluorescencia, prepare cinco microgramos por mililitro de tinción nuclear y cinco micromolares de tinción para células muertas en PBS. Para la clasificación basada en morfología, prepare cinco microgramos por mililitro de tinción nuclear, cinco micromolares de tinción para células muertas y cinco micromolares de tinción celular en PBS.Añada 20 microlitros de solución de colorante a cada pocillo. A continuación, incube las muestras a 37 grados Celsius, protegidas de la luz, durante 30 minutos. Para adquirir imágenes, use etanol al 70 % para limpiar la parte inferior de la placa y coloque la placa en la cámara de imagen. En la pestaña de configuración, bajo la selección de canales, haga clic en el botón más para agregar los canales apropiados a la imagen. Bajo la selección de diseño, establezca un apilamiento en z de imágenes de prueba cada dos micrones, comenzando en cero micrones y terminando en 20 micrones, para identificar el plano de enfoque. Haga clic en captura, bajo cada canal, para evaluar las intensidades y optimizar los tiempos de exposición.Introduzca valores más altos o más bajos en el campo de tiempo según sea necesario. Los núcleos en las células deben estar enfocados para garantizar la precisión del análisis posterior. En el esquema de la placa, resalte los pozos adecuados.Luego, en el esquema de pozos, resalte los 25 campos que se van a imaginar de manera similar. En ejecutar experimento, identifique la placa en el nombre de la placa y, a continuación, haga clic en el botón de inicio para ejecutar el protocolo de adquisición de imágenes con un objetivo de 10x y generar imágenes TIFF en escala de grises en los canales elegidos. Después de instalar los programas de código abierto CellProfiler y CellProfiler Analysis, abra CellProfiler, haga clic en Archivo, Importar, Canalización desde archivo y seleccione el archivo correspondiente.Seleccione la canalización de clasificación basada en fluorescencia para clasificar las células como H3255 o CCD19LU según la intensidad de EGFP y para calcular las características de morfología. Haga clic en Ver configuración de salida, luego seleccione la ubicación de los archivos de imagen para el análisis y el destino de los datos extraídos. Antes de ejecutar el análisis, el protocolo debe probarse en modo de prueba para verificar los valores de los parámetros.Es importante que la segmentación nuclear y celular sea precisa. Este protocolo fue diseñado para identificar células con tinción nuclear variable y asegurar que el valor de píxeles mediante el cual se expanden los núcleos sea lo suficientemente grande como para enmascarar los núcleos con la mayor tinción de ADN, pero lo suficientemente pequeño como para no enmascarar los núcleos circundantes. Para clasificar poblaciones basándose en la fluorescencia, primero reescale el rango de intensidad de GFP, luego mida la intensidad de GFP de cada núcleo identificado y clasifique los objetos según un umbral definido por el usuario.A continuación, haga clic en analizar imágenes para comenzar el análisis. Cuando el análisis haya finalizado, vaya a la carpeta de salida predeterminada para ver los datos calculados. Para la clasificación basada en morfología, ejecute el protocolo adecuado en Cell Profiler para generar características de morfología celular completa.Abra el software de análisis Cell Profiler, seleccione el archivo de propiedades de la base de datos generado en Cell Profiler y haga clic en abrir. Haga clic en la pestaña Clasificador en la parte superior izquierda de la pantalla. Para obtener imágenes aleatorias de células del experimento, haga clic en obtener; las imágenes aparecerán en la ventana sin clasificar.Clasifique manualmente las células como positivas o negativas, que en este caso representan H3255 o CCD19LU, seleccionando y arrastrando las células al compartimento correspondiente. Después de clasificar al menos 50 células por subpoblación, haga clic en Entrenar Clasificador y luego en Verificar Progreso. Finalmente, haga clic en Puntuar Todo para generar una tabla con el número de células de cada subpoblación.En un cultivo en frío heterocelular de células tumorales H3255 y fibroblastos CCD19LU, se identificaron y segmentaron los núcleos basándose en la tinción de ADN. Las poblaciones celulares se clasificaron ya sea mediante fluorescencia inducida artificialmente o mediante entrenamiento de un algoritmo de aprendizaje automático para identificar los tipos celulares según las diferencias morfológicas. Existe una alta concordancia entre los métodos basados en fluorescencia y morfología.Los dos métodos de clasificación se aplicaron de forma independiente a las mismas imágenes y coincidieron en un 97,4 % y un 92,5 % en las poblaciones no tratadas y tratadas, respectivamente. Aquí se investigaron los cambios en la morfología celular y la respuesta al tratamiento con Erlotinib. Tras tres días de tratamiento con el fármaco, se observó una disminución del área nuclear y un aumento del área celular en las células H3255.Esto posiblemente se debió a la muerte celular. Para comprobar si el Erlotinib tenía un efecto citotóxico o citostático sobre las células, se identificaron las células muertas basándose en la tinción con yoduro de propidio. Se observaron tanto efectos citotóxicos como citostáticos del Erlotinib sobre las células H3255, con un aumento en el número de muertes y una disminución en el número de divisiones celulares tras el tratamiento con el fármaco.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas no consecutivas si se lleva a cabo correctamente. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la interferencia de AR o CRISPR, para abordar preguntas adicionales sobre genómica funcional. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del cáncer exploraran la influencia de las células estromales en la progresión tumoral en múltiples tipos de cáncer.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar las respuestas heterocelulares a estímulos ambientales, específicamente cómo analizar datos de imágenes basadas en microscopía de manera de alto rendimiento.

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